全 文 ：《食品工业》2016 年第37卷第 1 期 193
工艺技术
超声波辅助提取臭李子中单宁的响应面工艺优化
鞠春艳，谢春阳*，刘春晖
吉林农业大学食品科学与工程学院（长春 130118）
摘 要 研究了以超声波为辅助手段提取臭李子中单宁的试验条件。在单因素的基础上, 用Box-Behnken组合试验
设计来优化试验条件。以四因素三水平的响应面试验优化了单宁提取的最佳工艺条件。最佳条件如下: 提取溶剂
浓度为61.20%, 提取温度为51.94 ℃, 超声波功率41.25 W, 提取时间为80.13 min, 单宁提取量为214.21 mg/kg。采用钨
酸钠-钼酸钠显色分光光度法测定臭李子中单宁。该方法的回收率为99.94%, 相对标准偏差 (RSD) 为0.7%。结论,
该方法简便准确, 灵敏度高, 重复性好。
关键词 臭李子; 单宁; 超声波辅助提取; 响应面法; 分光光度法
Condition Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction Technology of Tannins
from Rhamnus davurica Pall by Response Surface Methodology
Ju Chun-yan, Xie Chun-yang*, Liu Chun-hui
College of Food Science and Engineering, Jilin Agriculture University (Changchun 130118)
Abstract A trial was made to study the optimum technology of tannins extraction from Rhamnus davurica Pall by ultrasonic
assisted methodology. On the basis of single factor, the principles of Box-Behnken design were used to optimize the conditions.
Response surface methodology with 4 factors and 3 levels was used to explore the effect of each factor on the yield of tannins
extraction. The optimum conditions were as followings: concentration of extraction solvent was 61.20%, extraction temperature
was 51.94 ℃, ultrasonic power was 41.25 W, and extraction time was 80.13 min. Under the optimal conditions above, the
yield of tannins extraction was 214.21 mg/kg. Use sodium tungstate-sodium molybdate coloration spectrophotometric method
to determine tannins from Rhamnus davurica Pall. The recovery of the method was 99.94%, and the relative standard deviation
(RSD) was 0.7%. The method was simple and accurate with high sensitivity and good repeatability.
Keywords Rhamnus davurica Pall; tannins; ultrasonic assisted extraction; response surface methodology; spectrophotometric
method
臭李子属药食兼用材料，是林区主要的野生浆果
之一，为达乌里鼠李实果实。学名，臭李子，别称为
老鸹眼、老乌眼。臭李子8~9月果实成熟时采收，鲜
用或微火烘干。臭李子种子含油38.79%，可提炼工业
围环境检测、样品检测。检测菌落总数，36 ℃培养72
h；检测霉菌/酵母，25 ℃培养120 h；按国标测大肠菌
群，36 ℃培养48 h，每隔24 h观察结果并记录。
最佳微生物环境数据为：①菌落总数＜1 CFU/5
mL，霉菌/酵母＜1 CFU/5 mL；②周围环境微生物
检测指标：生产现场微生物指标：菌落总数/霉菌酵
母＜20 CFU/5 mL，无菌实验室（A级）微生物指标
＜1 CFU/m3；③水处理环节检测指标：原水菌落总
数＜100 CFU/mL、原水大肠菌群＜1 CFU/100 mL，
其他水菌落总数＜25 CFU/mL、其他水大肠菌群＜1
CFU/100 mL。
检测环节的人工操作必须严格按照企业SOP文件
上的操作要求执行。假如水处理环境微生物超标，通
知水处理车间对处理缸进行清洗消毒，生产线停机，
待处理结果符合要求后开机生产；假如样品中微生物
超标，通知生产班组停机，对生产线管道以及配料灌
注间进行深度清洁；假如周围环境微生物超标，针对
相应环境进行清洗消毒或灭菌。
参考文献：
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中国农业大学出版社, 2011: 1-12.
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校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明
[S]. 北京: 中国标准出版社, 2007-4-4.
《食品工业》2016 年第37卷第 1 期 194
工艺技术
用油；叶入药，起镇咳作用；叶中的挥发油，有杀虫
作用。臭李子含有单宁。单宁具有多种功用，能与金
属离子螯合，并能与自由基发生反应，从而表现出很
强的抗氧化能力[1]，同时还具有抗菌、抗病毒活性[2]以
及抗肿瘤活性[3]，应用十分广泛。
目前常用水和乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂来提
取单宁，有机溶剂能促进氢键断裂，易于游离到胞
外，从而萃取到溶剂中[4]，提取的方式多采用水煎煮
或水浴加热[5-6]。超声波具有空化、微射流及微声流等
多级物理效应，能促使植物细胞组织破壁或变形而应
用于一些油料、多酚等天然产物的提取[7-8]，并取得了
良好的效果。试验采用超声波辅助手段提取臭李子中
单宁，并采用响应面法对提取工艺进行优化，以获取
最佳的提取工艺。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
臭李子购于长白山，钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、
溴水、无水碳酸钠、水合没食子酸均为分析纯。
UV2300紫外分光光度计：上海天美科学仪器有
限公司；TB-214电子天平：北京赛多利斯天平有限公
司；XMTD-4000电热恒温水浴锅：北京市永先明医疗
仪器厂；TGL-16G高速台式离心机：上海安亭科学仪
器厂。
1.2　试验方法
1.2.1　单宁含量的测定
1.2.1.1　原理
以没食子酸为主的单宁类化合物可将钨钼酸还原
成蓝色化合物，该化合物在765 nm处有最大吸收峰，
其吸收值与单宁含量成正比，以没食子酸为标准物
质，标准曲线法定量。
1.2.1.2　试剂的配置
1) 钨酸钠-钼酸钠混合溶液：称取50.0 g钨酸钠，
12.5 g钼酸钠，用350 mL水溶解到1 000 mL回流瓶中，
加入25 mL磷酸，50 mL盐酸，充分混匀，小火加热
回流2 h，再加入75 g硫酸锂，25 mL蒸馏水，数滴溴
水，然后继续沸腾15 min（至溴水完全挥发为止），
冷却后，转入500 mL容量瓶中定容，过滤，置棕色瓶
中保存，使用时稀释一倍。
2) 75 g/L碳酸钠溶液：称取37.5无水碳酸钠溶于
250 mL温水中，混匀，冷却，稀释至500 mL，过滤到
储备瓶中备用。
3) 没食子酸标准储备液：准确称取0.110 0 g水合
没食子酸，溶解并定容至100 mL，此溶液没食子酸质
量浓度为1 000 mg/L。在冰箱2 ℃~3 ℃下可保存5 d。
4) 没食子酸标准使用液：分别吸取1 000 mg/L没
食子酸标准储备液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL至
100 mL容量瓶中，定容，溶解质量浓度为0.0，10.0，
20.0，30.0，40.0和50.0 mg/L。
1.2.1.3　样品预处理
样品解冻后，精确称取样品2 g，清洗除籽后，
超声波法辅助提取臭李子中单宁，吸取2.0 mL样品提
取，8 000 r/min离心4 min，上清液备用。
1.2.1.4　标准曲线的建立
吸取0.00，10.0，20.0，30.0，40.0和50.0 mg/L
没食子酸标准使用液各1.0 mL，分别加5.0 mL的水，
1.0 mL钨酸钠-钼酸钠混合溶液3.0 mL碳酸钠溶液，混
匀，放置2 h，以标准曲线0.0 mg/L为空白，在765 nm
波长下测定标准溶液的吸光度，以没食子酸浓度为横
坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.1.5　样品的测定
吸取1.0 mL样品提取液，分别加入5.0 mL水，1.0
mL钨酸钠-钼酸钠混合液和3.0 mL碳酸钠溶液，显
色，放置2 h，以不加样品提取液为空白，在765 nm波
长下测定样品溶液的吸光度。
1.2.1.6　结果计算
试样中单宁（以没食子酸计）提取量按式（1）
进行计算。
Y= ρ×10×A （1）m
式中：Y-试料中单宁含量，mg/kg；ρ-试样测定
液中没食子酸的浓度，mg/L；10-试样测定液定容体
积，mL；A-样品稀释倍数；m-试料质量，g。
1.2.2　提取溶剂的选择[9-10]
在探索性试验中以水，乙醇和丙酮水溶液为提
取溶剂，对这3种常用溶剂的提取效果进行比较，
以提取温度为50 ℃，时间80 min，料液比1︰12（g/
mL），超声波功率40 W。选择50%乙醇和50%丙酮
为溶剂，单宁提取量分别为192.45 mg/kg和209.73 mg/
kg，而以水为溶剂的单宁提取量仅为172.18 mg/kg。由
此可见，选择丙酮作为最佳的提取剂。
1.2.3　单因素试验
以丙酮作为提取溶剂，探讨提取溶剂的浓度，超
声波功率，处理温度和处理时间等因素对臭李子中单
宁提取效果的影响。
提取时间80 min，温度50 ℃，超声波功率40 W，
用浓度为30%，45%，60%，75%和90%的丙酮溶液
作为提取液，研究不同浓度溶剂对臭李子中单宁提
取效果的影响；提取时间80 min，丙酮溶液的浓度为
60%，超声波功率40 W，选择30 ℃，40 ℃，50 ℃，
60 ℃和70 ℃五个温度梯度进行试验，研究不同温度
对臭李子中单宁提取效果的影响；以丙酮溶液的浓
度为60%，提取温度50 ℃，超声波功率40 W，选择
40，60，80，100和120 min五个不同的提取时间研究
对臭李子中单宁提取效果的影响；丙酮溶液的浓度为
60%，处理温度50 ℃，处理时间80 min，设置超声波
*通讯作者
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功率为20，30，40，50和60 W，比较不同超声波功率
对臭李子中单宁波提取效果的影响。
1.3　响应面试验设计
响应面试验设计为了使提取工艺更加科学，在单
因素试验的基础上，根据Box-Behnken[11]设计原则，
选取提取溶剂浓度、提取温度、超声波功率和提取时
间对单宁提取量较显著的四个因素，以单宁提取量为
响应值，设计四因素三水平的响应面试验，响应面试
验因素与水平表如表1所示。
表1　响应面试验因素与水平表
水平
因素
X1提取溶剂浓度/%
X2提取温度/℃
X3超声波功/W
X4提取时间/min
-1 50 40 30 70
0 60 50 40 80
1 70 60 50 90
2　结果与分析
2.1　没食子酸标准曲线
图1为没食子酸标准曲线得回归方程：y=0.165 4x-
0.084，其中R2=0.994 8。结果表明，测定值在0~5.0
mg/L范围内线性良好。
图1　没食子酸标准曲线
2.2　以丙酮溶液浓度为梯度进行单因素试验
随着丙酮浓度的升高，单宁提取量逐渐增大，但
超过60%以后，增大趋势不是很明显，结果见图2。
提取溶剂浓度达一定程度时，有效成分基本完全析
出，此时继续增大料液比，更多杂质溶出，而且增加
了生产成本[12]。因此可选取50%~70%的丙酮溶液作为
提取液。
图2　丙酮溶液浓度对单宁提取量的影响
2.3　以提取温度为梯度进行单因素试验
随温度升高提取率迅速增高，50 ℃附近时达到
最大，结果见图3。这可能是在较高的温度条件下，
由于超声波的机械效应和形成的微射流而使得单宁分
子运动速度加快，易于氧化所造成的。因此可选择40
℃~60 ℃为提取温度。
图3　提取温度对单宁提取量的影响
2.4　以超声波功率为梯度进行单因素试验
在20~40 W范围内单宁的提取量随超声波功率的
增大而提高，超过40 W后降低，结果见图4。这可能
是由于随着超声波功率增大，并且放出大量的热，
体系中单宁分解的速度增加[13]，故选用超声波功率为
30~50 W。
图4　超声波功率对单宁提取量的影响
2.5　以超声波处理时间为梯度进行单因素试验
延长处理的时间会提高单宁提取量，但超过80
min以后开始迅速降低，结果见图5。这是由于单宁分
子在长时间超声波的作用下会迅速分解。因此可选用
70~90 min作为超声波处理时间。
图5　超声波处理时间对单宁提取量的影响
2.6　Box- Behenken试验结果及条件优化
2.6.1　超声波辅助提取臭李子中单宁的响应面试验
以臭李子中单宁提取量（Y）作为指标，以提
取溶剂浓度（X1），提取温度（X2），超声波功率
（X3），提取时间（X4）为试验因素，响应面优化试
验设计表和试验结果见表2，试验结果方差分析表3，
模型系数及显著性分析见表4。
分析结果如表3所示。回归模型F值为32.03，
p＜0.000 1，表现为“极显著”，因此可以使用该模
型。失拟误差平方和为109.611 860，表现为“不显
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著”，表明该方程对试验的拟合情况好。且相关系数
R2=0.969 7，接近1，这表明模型与实际情况吻合程度
较高，预测值和真实值之间有较好的相关性，因此可
用此回归方程对试验结果进行分析预测[14-15]。从由F
值可以得到各因素对单宁提取量影响从大到小的顺序
依次为：提取温度（X2）＞超声波功率（X3）＞提取
时间（X4）＞提取溶剂浓度（X1）。
表2　响应面优化试验设计表和试验结果
编号 X1 X2 X3 X4 Y
1 0 0 0 0 210.35
2 1 0 -1 0 182.78
3 1 0 0 1 194.43
4 -1 0 -1 0 179.56
5 -1 -1 0 0 162.12
6 1 -1 0 0 165.72
7 0 0 1 -1 187.32
8 0 1 1 0 188.89
9 0 -1 0 1 163.87
10 -1 1 0 0 181.29
11 0 0 0 0 212.65
12 0 0 0 0 213.58
13 0 1 0 1 187.49
14 0 0 0 0 209.78
15 -1 0 1 0 182.55
16 1 0 0 -1 199.33
17 0 -1 -1 0 161.23
18 0 -1 1 0 171.98
19 0 1 0 -1 177.43
20 0 0 -1 1 180.45
21 0 0 1 1 182.43
22 -1 0 0 1 187.26
23 -1 0 0 -1 180.33
24 0 1 -1 0 178.42
25 0 0 0 0 213.87
26 0 0 -1 -1 180.39
27 1 0 1 0 192.49
28 0 -1 0 -1 163.55
29 1 1 0 0 188.57
表4　模型系数及显著性分析
变异来源 自由度 估值 标准误差 t值 p＞|t|
常数 1 -2 231.473 845 245.199 787 -9.10 ＜0.000 1
X1 1 18.358 818 3.268 466 5.62 ＜0.000 1
X2 1 23.202 504 2.572 844 9.02 ＜0.000 1
X3 1 12.363 053 2.472 32 5.00 0.000 2
X4 1 25.616 420 3.437 674 7.45 ＜0.000 1
X1
2 1 -0.124 731 0.016 170 -7.71 ＜0.000 1
X2X1 1 0.009 200 0.019 203 0.48 0.639 3
X2
2 1 -0.247 277 0.015 264 -16.20 ＜0.000 1
X3X1 1 0.016 800 0.019 203 0.87 0.396 4
X3X2 1 -0.000 070 0 0.019 203 -0.04 0.971 4
X3
2 1 -0.149 864 0.015 264 -9.82 ＜0.000 1
X4X1 1 -0.053 168 0.026 721 -1.99 0.066 4
X4X2 1 0.024 350 0.019 203 1.27 0.225 5
X4X3 1 -0.012 375 0.019 203 -0.64 0.529 7
X4
2 1 -0.144 240 0.016 580 -8.70 ＜0.000 1
通过二次回归分析对试验数据进行回归拟合，
确立超声波辅助提取臭李子中单宁的最优拟合二次
多项式方程，其回归方程系数见表4中估值。由表4
可知，以单宁提取量（Y）为因变量，以提取溶剂浓
度（X1），提取温度（X2），超声波功率（X3）和提
取时间（X4）的编码值为自变量的三元二次回归方程
为：Y=-2 231.473 845+18.358 818X1+23.202 504X2+
12.363 053X3+25.616 420X4-0.124 731X12+0.009 200X2X1-
0.247 277X22+0.016 800 2X3X1-0.000 070 0X3X2-
0.149 864X32-0.053 168X4X1+0.024 350X4X2-0.012 375X4X3-
0.144 240X42。
图6~图11分别说明提取溶剂浓度，提取温度，
超声波功率，提取时间两两之间的交互作用臭李子中
单宁提取量的影响关系。从6个图可以看出，臭李子
中单宁提取量最初会跟随这4个因素的逐渐增大而不
断爬升；但是超过这4个因素在试验中选取的中心值
时，臭李子中单宁提取量会随着因素水平的上升而下
降。比较这6个图，加之结合回归方程系数的显著性
变异来源 自由度 平方和 均方 F比值 p＞F 显著性
X1 5 1 037.679 830 214.735 966 14.56 ＜0.000 1 **
X2 5 494.013 153 994.802 631 67.45 ＜0.000 1 **
X3 5 1 592.184 696 318.436 939 21.59 ＜0.000 1 **
X4 5 1 185.694 462 237.138 892 16.08 ＜0.000 1 **
一次项 4 1 541.590 164 26.13 ＜0.000 1 **
二次项 4 4 969.078 987 84.22 ＜0.000 1 **
交互项 6 102.972 409 1.16 0.378 6
回归模型 14 6 613.641 559 32.03 ＜0.000 1 **
失拟误差 9 109.611 860 12.179 096 0.63 0.743 5
纯误差 5 96.885 250 19.377 050
总残差 14 206.497 110 14.749 794
Y均值 185.521 034
标准误差 3.840 546
R2 0.969 7
变异系数 2.070 1
注: **p＜0.01, 差异极显著; *p＜0.05, 差异显著。R2=0.969 7。
表3　试验结果方差分析表
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工艺技术
检验试验，可以清楚地得到这4个因素的交互作用对
臭李子中单宁提取量的影响的显著程度，从而得出提
取温度对臭李子中单宁提取量影响最大，曲面呈现比
较陡，其次是超声波功率和提取时间，影响作用最低
的因素是提取溶剂浓度，曲面整体表现较为平滑。
图6 提取溶剂浓度（X1）与提取温度（X2）之间
交互作用的响应面及等高线
图7　提取温度（X2）与提取时间（X4）之间
交互作用的响应面及等高线
图8　提取温度（X2）与超声波功率（X3）之间
交互作用的响应面及等高线
图9　提取溶剂浓度（X1）与提取时间（X4）之间
交互作用的响应面及等高线
图10　超声波功率（X3）与提取时间（X4）之间
交互作用的响应面及等高线
图11　提取溶剂浓度（X1）与超生波功率（X3）
之间交互作用的响应面及等高线
2.6.2　响应曲面试验的最佳优化结果及试验验证
通过使用软件对试验得到的数据进行优化得到的
最佳工艺条件为：提取溶剂浓度为61.20%，提取温度
为51.94 ℃，超声波功率41.25 W，提取时间为80.13
min。臭李子中单宁提取量为214.21 mg/kg。
2.7　精密度试验
分别精密量取标准储备溶液1 mL，按照1.2.1.5中
的方法重复5次，测定吸光度，求得RSD=3.28%，表
明仪器精密度良好。结果见表5。
表5　精密度试验结果
平行样品 吸光度 平均吸光度 RSD/%
1 0.984
1.029 3.28
2 1.021
3 1.077
4 1.039
5 1.024
2.8　重复性试验
按照2.6.2 中所得的最佳超声波辅助提取条件提
取样品中单宁，并按照1.2.1.5中的方法测定供试样品
吸光度并计算单宁的提取量，做5次平行，结果见表
6。由表6可知，测定结果的相对标准偏差（RSD）为
0.83%，表明方法重复性较好。
2.9　回收率试验[16]
取已测得单宁含量的臭李子提取液0.25 mL，再加
1 g/L没食子酸标准储备溶液0.75 mL，按照1.2.1.5中方
法测定吸光度并计算单宁含量，做5次平行，计算回
收率。结果见表7。由表7可知平均回收率为99.94%，
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RSD为0.7%。
表6　重复性试验结果
平行样品 测得单宁提取量/mg·kg-1 平均含量/mg·kg
-1 RSD/%
1 215.66
213.53 0.83
2 214.79
3 211.12
4 212.45
5 213.63
表7　回收率试验结果
平行
样品
对照品量/
mg
测得单宁提
取量/mg 回收率/%
平均回收
率/% RSD/%
1 0.75 0.741 5 98.88
99.94 0.7
2 0.75 0.748 3 99.78
3 0.75 0.751 5 100.20
4 0.75 0.745 99.33
5 0.75 0.745 99.33
3　结论
试验通过使用辅助的超声波能量加速提取臭李
子中单宁及通过使用Design-Expert软件进行响应面优
化，得出最佳工艺条件：提取溶剂浓度为61.20%，
提取温度为51.94 ℃，超声波功率为41.25 W，提取时
间为80.13 min。在此条件下，臭李子皮单宁提取量
为214.21 mg/kg。对该结果进行3次验证，与软件优化
的结论吻合性较好，因而具有较高的可信性。使用
该方法的回收率为99.94%，相对标准偏差（RSD）为
0.7%。该试验结果可以为在天然物质的提取生产上提
供一定的实际意义。
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信 息
垃圾食品有害健康，但少吃一点没关系吧？荷兰应用
自然科学研究中心发现，即便少吃，也会危害健康。
研究人员征募了两组志愿者，第一组是10名健康男
性，第二组是9名代谢综合征患者，同时有两个及以上心脏
病风险因素，比如胆固醇水平偏高、高血压、高血糖、高
血脂、“啤酒肚”等。研究人员让所有志愿者饮用一杯高
脂奶昔，并在饮用前后分别采集血样，检测胆固醇、血糖
等61种生物标记。结果显示，第二组患有代谢综合征的志
愿者，饮用奶昔后糖分和脂肪代谢进程以及炎症水平不正
常，代谢综合征加剧。研究人员又让第一组健康志愿者每
天食用1 300 cal的巧克力、蛋挞、薯片等零食，连续吃上４
周，然后再验血，发现他们体内调节糖和脂肪代谢的激素
以及炎症水平都变了，变得类似代谢综合征早期的水平。
研究结果刊载于《美国实验生物学协会联合会杂志》。
来源：新华网 2015-11-06
研究：垃圾食品一点也嫌多 少吃伤身也明显