全 文 ：尖嘴林檎叶防霉有效成分分析
Xie D.P.
谢达平 赵肃青 曾晓雄 雷 女孝
(湖南农业大学 长沙 410128)
摘 要 对有防霉效果的尖嘴林檎叶提取液进行分离与鉴定 , 结果表明:单宁和皂苷
是尖嘴林檎抑菌的主要成分 ,将这类物质应用于食品防霉试验 ,能明显延长食品保质
期。
关键词 尖嘴林檎;单宁;皂苷
尖嘴林檎(Malus meliana),蔷薇科 ,苹果属 ,落叶乔木 ,主要分布在广西及湘南地区 ,资
源丰富。经研究证明 ,尖嘴林檎叶的各种提取液中 ,以正丁醇提取液的抑菌防霉效果最好。
因此采用 Sephadex-LH 20对正丁醇提取液进行柱层析分离 ,然后对分离的各组分进行抑菌
分析和性质鉴定 。
1 试验材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料 尖嘴林檎叶采自湖南株洲中南林学院。
1.1.2 菌种 大肠杆菌(Escherichia col i),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aurcus),枯草
杆菌(Baci llus subti lis),变形杆菌(Proteus vuigaris),苏云金杆菌(Baci llus thuringiensis),
米曲霉菌(Aspergil lus aryzae),青霉菌(Penicil lium SP),黄曲霉菌(Aspergi llus f lavus),黑
曲霉菌(Aspergi llus niger),根曲霉菌(Rhizopus nigricans)。以上菌种由湖南农业大学微生
物教研室和湖南省轻工专科学校菌种室提供 。
1.1.3 霉菌培养基 将削皮马铃薯 100 g 切成薄片 ,加 500 mL 水煮沸 30 min ,取汁 ,再加
入葡萄糖 10 g ,琼脂 10 g ,补充水至 500 mL , pH 自然。
1.1.4 细菌培养基 牛肉膏 5.0 g ,蛋白胨 5.0 g ,NaCl 2.5 g ,水500mL ,pH 7.4 ～ 7.6 ,琼脂
2%。0.981×105 ～ 1.177×105 Pa压力下灭菌 30min ,备用 。
1.2 方法
国家自然科学基金资助项目 39370532
收稿日期:1997-01-24
谢达平 ,男 , 53 岁 , 教授
第 18卷第 2期
1998 年 6 月
林 产 化 学 与 工 业
Chemistry and Industry of Forest P roducts
Vol.18 No.2
June 1998
1.2.1 尖嘴林檎叶防霉有效成分的提取及分离
1.2.2 抑菌试验 按参考文献[ 1]方法进行 。用打孔器将新华 1号滤纸打成 5 mm 圆纸
片 ,浸泡于上述 5种尖嘴林檎叶浓缩液中 , 4 h 后用于抑菌检测 。同时 ,将上述菌种制斜面
后 ,用无菌水制成菌悬液或孢子悬液 ,分别吸取0.2mL 涂布平板 。将前述A 、B 、C 、D 、E 5种
浓缩液中浸泡的滤纸取出 ,置于涂菌平板内 ,每个样品重复 2次 ,然后置平板于 30℃恒温箱
中培养 ,待平板长满菌后 ,测定抑菌圈直径 ,比较抑菌效果。
1.2.3 Sephadex-LH 20柱层析 根据抑菌试验结果 ,称取 60 g Sephadex-LH 20用正丁醇
浸泡 48 h ,取1 m 长 ,容积100mL 层析柱装柱 ,用正丁醇平衡24 h ,取4 mL 浓缩液后的正丁
醇抽提液上柱分离 ,用正丁醇作洗脱剂 ,流速为 10滴/min ,根据被分离物的颜色差别 ,收集
到 Ia、Ib 、Ic、Id 、Ie 5部分 ,分别将此 5部分收集液减压浓缩 ,冷冻干燥 ,得固体粉末 。
1.2.4 检测 对上述分离得到的 5种组分参照文献作定性分析和光谱检测[ 2～ 5] 。
1.2.5 防霉试验 (1)将 Ia、Ib 、Ic 、Id 、Ie 5 种组分配成 6.5 mg/mL 的水溶液 ,按 1.2.2法
进行抑菌试验;(2)在 4组三角瓶内分别加入 10 mL 桔子原汁 、啤酒 、茶汤 、2%牛肉膏水溶
液 ,然后在三角瓶内分别加入抑菌效果好的 Ie 、Id 6.5 mg/mL 水溶液 0 ml、1 mL 、2 mL 、10
mL ,其中一组不密封 ,另一组用纸封瓶口 ,置于室温 ,观察记录霉变出现的时间 。
2 试验结果
2.1 尖嘴林檎叶萃取液的抑菌效果
不同生长时期的尖嘴林檎叶按 1.2.1法进行处理 ,萃取后得 A 、B 、C 、D 、E 5种浓缩液 ,
再按 1.2.2法进行抑菌试验 ,结果如表 1。
34 林 产 化 学 与 工 业 第 18 卷
从表 1可知 ,石油醚 、乙酸乙酯和水相浓缩液完全无抑菌活性;乙醇抽提物抑菌力较弱 ,
只有正丁醇浓缩液抑菌力较强 ,且对霉菌的作用强于对细菌的作用。
表 1 尖嘴林檎叶萃取液的抑菌效果＊
Table 1 The bacteriosta tic effect of ex tract from malus leaves
采叶期
Month
抽提液
Ext.
菌 种＊＊Fungi
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
6 月
June
A 0.7 0.6 0.6 0.7 0.9 1.0 1.1 0.7 0.6 0.6
B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
D 0.9 1.3 1.7 1.6 1.6 2.1 2.1 0.9 0.8 0.7
E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7 月
July
A 0.6 0.7 0.7 0.7 1.2 0.9 0.9 0.8 0.6 0.6
B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
D 0.9 1.2 1.6 1.7 1.9 2.1 2.0 0.7 0.8 0.7
E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
8 月
Aug.
A 0.6 0.7 0.9 0.8 0.7 1.3 1.0 0.7 0.6 0.5
B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
D 1.4 1.2 1.2 1.9 1.7 2.0 1.3 0.8 0.9 0.7
E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
9 月
Sept.
A 0.6 0.7 0.9 0.8 0.9 0.9 0.9 0.6 0.6 0.8
B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
D 1.0 0.9 1.2 2.1 2.0 1.7 1.6 0.7 0.9 0.9
E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 月
Oct.
A 0.9 1.7 1.3 1.1 0.8 0.7 0.6 1.1 0.6 0.8
B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
D 1.0 0.9 1.7 1.3 1.9 2.1 2.0 0.9 1.1 1.3
E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
11 月
Nov.
A 0.8 0.7 0.7 0.9 0.6 1.2 0.8 0.7 0.6 0.7
B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
D 1.1 1.2 1.0 1.3 1.7 1.9 2.0 2.1 0.9 0.8
E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
＊表中数据为抑菌圈直径(cm);
＊＊1.大肠杆菌(Escherichia coli);2.葡萄球菌(S taphylococcus aurcus);3.米曲霉菌(Aspergi llus aryzae);4.根曲霉菌
(Rhizop us nigr icans);5.黑曲霉菌(Aspergi llus niger);6.青霉菌(Penici llium SP);7.黄曲霉菌(Aspergi llus f lavus);
8.枯草杆菌(Bacil lus subt ilis);9.变形杆菌(Proteus vuigaris);10.苏云金杆菌(Bacillus thur ingiensis)
2.2 Sephadex-LH20柱层析分离组分鉴定
将上述正丁醇浓缩液经层析后分离得到的 Ia、Ib 、Ic、Id 、Ie 减压浓缩 ,冷冻干燥成粉末
状 ,然后特征性化学反应 。定性鉴定。
2.2.1 黄酮类化学特征反应 (1)分别挑取少许 Ia 、Ib 、Ic 、Id 、Ie 固体粉末于试管内 ,加入
1mL甲醇摇匀 ,加入少许镁粉后分别滴加 5滴浓盐酸 ,1 ～ 2 min内 , Ia、Ib 、Ic试管内颜色均
变为红色 ,而 Id 、Ie试管内无此颜色变化;(2)将上述 5种浓缩液分别滴于滤纸上 ,干后喷以
第 2 期 谢达平等:尖嘴林檎叶防霉有效成分分析 35
10%NaCl水溶液或用氨熏 ,产生深黄色颜色变化的有 Ia 、Ib 、Ic组分;时间久后 ,氨熏滤纸因
氨挥发而退色。而 Id 、Ie 组分无此现象 。因此鉴定认为 Ia、Ib 、Ic为黄酮类化合物。
2.2.2 Id组分的鉴定 Id组分溶于水后 ,经检测有如下特征:(1)将其水溶液装于大试管
内 ,紧塞试管后振摇 ,产生大量肥皂样的泡沫 ,长时间也不消失;(2)取 2%兔血球悬浮液
1mL ,加生理盐水 7 mL ,再加 Id水溶液 1mL ,混匀后放置 ,2 min内产生溶血现象;(3)将 Id
干粉用 2 mol/L 盐酸溶解 ,置 40℃水浴水解 6 h ,生成少量沉淀 ,离心 ,沉淀用 80%乙醇溶
解 ,置 4℃冰箱冷析过夜 ,有白色结晶析出 ,取出结晶 ,干燥后进行紫外和红外光谱测定。红
外光谱显示出 980 cm 、920 cm 、900 cm 、860 cm附近的 4个特征吸收谱带 ,而 980 cm 处的谱
带最强 。紫外光谱显示 222 nm 处强吸收 ,285 nm 附近的弱吸收 。其紫外及红外光谱特征
均与王宪楷所述甾体苷元的特征完全一致[ 3] 。因此通过以上化学定性分析和光谱测定可
确定 Id为甾体皂苷 。
2.2.3 Ie组分的鉴定 当用 Sephadex-LH 20层析柱分离正丁醇抽提液时 ,有一棕色物质
吸附于柱顶端不被正丁醇洗脱 ,将这部分染色的葡聚糖挑出放入烧杯 ,用温热的正丁醇∶水
(1∶1)浸泡洗脱 ,取水溶液减压浓缩 、冷冻干燥 ,得棕色粉末状固体 ,此即柱层析得到的组分
Ie ,它具以下化学性质:当其水溶液滴入酪蛋白水溶液中时 ,产生白色环状不溶于水的沉淀;
当其水溶液滴入 FeCl3 溶液时立即生成黑色沉淀;当往其水溶液加入少量盐酸于电炉上加
热时 ,有无定形红色沉淀生成;当用其水溶液与 FeSO4 溶液混合后的液体书写时 ,字迹渐呈
黑色;当其水溶液加入兔血球悬浮液后 ,血球很快凝聚 。将 Ie组分进行红外光谱检测时 ,光
谱图显示出在 3368.1 cm 处有一个很强且宽的羟基峰 ,这是由分子内部羟基缔合形成的 ,在
800 ～ 830 cm 处也显示特征吸收 ,这与陈培榕[ 6] 、L.Y.Foo[ 7] 、张宗才[ 8]等描述的单宁红外
图谱一致 。因此通过化学定性反应和光谱分析 ,可确定 Id组分为单宁 。
2.2.3 防霉试验
2.2.3.1 按 1.2.5所述的方法对层析分离的 Ia、Ib 、Ic 、Id 、Ie 分别进行抑菌试验 ,结果如表
2所示。
表 2 Ia、Ib、Ic、Id、Ie的抑菌效果＊
Table 2 The bacteriostatic effect of Ia、I b、Ic、Id 、Ie
菌 种＊＊Fungi
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ib 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ic 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Id 1.2 1.0 2.0 1.3 1.6 2.0 1.5 0.8 0.9 0.9
Ie 1.1 1.3 1.7 1.9 1.9 2.1 1.3 0.7 1.1 1.0
正丁醇 Butanol 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
＊表中数据为抑菌圈直径(cm);＊＊数字代号同表 1。
从表 2可知:Ia 、Ib 、Ic组分无抑菌性能 ,而 Id 、Ie 有好的抑菌效果 ,特别对霉菌效果更
好。因此可以认为 ,尖嘴林檎叶内抑菌防霉物质为皂苷和单宁。
2.2.3.2 按 1.2.5所述方法用尖嘴林檎皂苷和单宁对食品进行防霉试验 ,结果如表 3 所
36 林 产 化 学 与 工 业 第 18 卷
示。
试验结果表明 ,当 6.5 mg/mL 尖嘴林檎叶皂苷和单宁的水溶液加入到上述食品中时 ,
当加入量达 10 mL ,此时尖嘴林檎皂苷和单宁的浓度为 3.25%,可大大延长食品保存期。
表 3 Id、Ie对食品的防霉效果
Table 3 Comparison o f the mycostatic effect of Id and Ie for food
食品名称
Food name
霉变开始出现的时间 Mycostatic time of feed(d)
Ida(mL) Ieb(mL)
0 1 2 10 0 1 2 10
桔子汁 I 5 6 10 21 5 6 7 21
Orange juice I＊ 5 7 11 26 5 7 9 31
啤酒 I 13 15 15 42 13 15 15 41
Beer I＊ 14 15 17 63 14 17 19 57
茶汤 I 5 6 15 47 5 6 13 48
Tea soup I＊ 5 9 18 71 5 9 15 69
2%牛肉膏水溶液 I 4 4 6 25 4 4 6 23
2% beef ext ract w ater solut ion I＊ 4 4 7 31 4 5 6 23
注:“ I”瓶口不封盖;“ I＊”瓶口用纸密封;a.Id—皂苷水溶液(6.5 mg/mL);b.Ie—单宁水溶液(6.5mg/mL)
3 结论
从表 1可知 ,尖嘴林檎叶在整个生长期中都含有抗菌物质 ,且从 6月至 11月每个月生
长的新叶都具有相同的抗菌能力。该物质能溶于乙醇和正丁醇 ,且更易溶于正丁醇 。
从正丁醇萃取液中可分离得 5种组分 ,从表 2可知 ,尖嘴林檎叶分离到的 3种黄酮类物
质无抗菌效果 ,而其抗菌实效物质为皂苷和单宁。
从表 3可知 ,将皂苷和单宁分别用于食品防霉变 ,能明显延长食品保质期。作者亦将此
类物质与山梨酸钾等做了抗菌能力的比较试验 。其用量较山梨酸钾和苯甲酸钠多 2倍左
右 ,方能获得相同的抗菌效果 。但因尖嘴林檎资源丰富 ,其防霉变物质为天然成分 ,也可用
于防霉剂开发。如桉叶的抑菌效果与尖嘴林檎相当 ,经宋永芳等同志开发用作饲料防霉剂 ,
取得较好经济效益[ 9] 。
参 考 文 献
1 肖靖萍 , 任宇红.松针抑菌作用研究.食品科学 , 1994 , 2:52～ 54
2 林启寿主编.中草药成分化学.北京:科学出版社 , 1987:466 ～ 498
3 王宪楷主编.天然药物化学.北京:人民卫生出版社 , 1988:256 ～ 272
4 唐得时.中药化学.北京:人民卫生出版社 , 1986:124 ～ 273
5 孙达旺.植物单宁化学.北京:中国林业出版社 , 1993:30 ～ 32
6 陈培榕 , 黄梁绮龄 ,苏美龄.香港地区红树植物资源研究.天然产物开发与研究 , 1994 , 2:6 ～ 10
7 Foo L Y.Proanthocyanidins:Gross chemical structure by infraredspectra.Phytochemistry , 1981 , 20(6):1397
～ 1402
第 2 期 谢达平等:尖嘴林檎叶防霉有效成分分析 37
8 张宗才 , 李 英 ,张文德.落叶松树皮单宁的组分分离及结构鉴定.中国林学会林产化学化工学会树
木提取物化学与利用学术讨论会论文集 , 南宁:1987:440～ 480
9 宋永芳 , 罗嘉梁 ,包承玉.桉叶饲料添加剂的研制和利用.天然产物研究与开发 , 1992 , 3:101 ～ 109
IDENTIFICAT ION OF EFFECTIVE MYCOSTAT IC CONSTITUENTS
IN MALUS MELIANA LEAF
Xie Daping Zhao Suqing Zeng Xiaoxiong Lei Shou
(Department of Bio-technology , Hunan Agriculture University Changsha 410128)
Abstract Butanol extracts from Malus meliana leaf , which had antifungal activity , have been separated and i-
dentified.Results show that tannins and saponins are the main mycostatic constituents resistant to fungus.The
two constituents w ere applied for food mycostatic experiments and it was found that quality guarantee period of
food could be effectively prolonged.
Key words Malus meliana;Tannin;Saponins
本 刊 信 息
1.《林产化学与工业》1997年在江苏省第二届期刊评选中 ,荣获江苏省优秀期刊奖 。
2.创刊伊始《林产化学与工业》即被美国《化学文摘》 、英国《林产品文摘》 、美国《造纸科
学与技术文献通报》收录 ,1996年开始 ,又被俄罗斯《文摘杂志》 、日本《科学技术文献速报》
收录 。
3.1995年本刊首次进入美国《化学文摘》千名表 ,在 150多个国家和地区的 14000多种
期刊中 ,排列第 804名。
4.中文核心期刊要目总览编委会根据文献计量学的原理和方法 ,经过研究人员对相关
文献的检索 、计算和分析 ,并请学科专家鉴定后 ,确定本刊为中文核心期刊 。
5.自 1987年开始 ,本刊即作为中国科技信息所信息分析研究中心的《中国科技论文统
计与分析》的统计源 。1995年起 ,该中心开始进行期刊引文的统计工作 ,期刊论文被引用的
多少是表明该期刊质量高低的重要标志之一。据 1996年该中心的年度研究报告 ,在 1227
种中国科技论文统计与分析期刊影响因子排序 ,本刊排在第 102位 ,影响因子为 0.3196(即
期刊论文发表后的第二和第三年被引频次与这两年发表的论文总数之比)。
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