全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
解淀粉芽孢杆菌 B am H I甲基转移酶
基因克隆、功能鉴定与序列分析
刘洋 1, 2 沈微 1, 2 石贵阳 1, 2 王正祥 1, 2
(1江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室 ,无锡 214122;
2江南大学生物工程学院 生物资源与生物能源研究中心 ,无锡 214122)
　　摘 　要 : 　从解淀粉芽孢杆菌 B aillus am yloliquefaciens C IC IM B2125中克隆了 B am H I甲基转移酶基因 ( bam H IM ) ,并在大
肠杆菌 JM109中得到了成功表达。该基因含有 1 271 bp的开放阅读框 (ORF) ,编码 423个氨基酸 ,成熟蛋白分子量为 49 kD。
该基因在自身启动子引导下 ,表达了具有活性的 B am H I甲基转移酶 (M. B am H I)。该酶可以将 B am H I位点的碱基甲基化。氨
基酸序列分析表明该酶存在有 NADB_Rossmann结构域。
关键词 : 　解淀粉芽孢杆菌 B am H I甲基转移酶 序列分析
Clon ing, Expression and Nucleotide Sequence Analysis of
Gene Encoding for B am HIM ethyltransferase from
B a illus am yloliquefaciens C IC IM B2125
L iu Yang1, 2 　Shen W ei1, 2 　Shi Guiyang1, 2 　W ang Zhengxiang1, 2
(1 The Key Laboratory of Industria l B iotechnology, M inistry of Education, J iangnan University, W uxi 214122;
2 Center for B ioresource & B ioenergy, School of B iotechnology, J iangnan University, W uxi 214122)
　　Abs trac t: 　A gene encoding for B am H Imethyltransferase ( bam H IM ) was cloned from B aillus am yloliquefaciens C IC IM B2125. The
bam H IM was exp ressed under its own p romoter in E. coli JM109. The gene contained an opening reading frame (ORF) of 1 271 bp,
which coded for 423 am ino acid residues. The molecular weight of mature p rotein was 49 kD. The B am H I site could be methylased by
the enzyme M. B am H I. The am ino acid sequence analysis revealed that the enzyme contained a domain of Rossmann2fold NAD ( P)
( + ) 2binding p roteins.
Key wo rds: 　B aillus am yloliquefaciens B am H Imethyltransferase Sequence analysis
收稿日期 : 2009206229
基金项目 :新世纪优秀人才支撑计划 (NCET20420497) ,国家“863”项目 (2006AA020204)
作者简介 :刘洋 (19752) ,男 ,新疆克拉玛依人 ,博士 ,研究方向 :工业微生物 ; E2mail: liuyang_07@126. com
通讯作者 :王正祥 ,男 ,教授 ; E2mail: zxwang@ jiangnan. edu. cn　　DNA甲基转移酶是一类以 S2腺苷酰甲硫氨酸为甲基供体 ,以 DNA胞嘧啶为受体 (也有以 DNA腺嘌呤为甲基受体 )的甲基转移酶类 ,可以将特定位点的碱基甲基转移 ,有明显的序列专一性和组织专一性 [ 1 ]。其广泛存在于生物体内 ,对于保护识别自身 DNA ,识别外源 DNA,保持种的稳定和遗传多样性及对基因的表达调控起着重要作用 [ 1, 2 ]。在大部分微生物中都存在 DNA甲基转移酶 ,它与限制性内切酶组成限制 2修饰系统 (RM ) [ 3～5 ]。大肠杆菌 [ 2 ]、 枯草芽孢杆菌 [ 6 ]和解淀粉芽孢杆菌 [ 7～9 ]都存在着特异的甲基转移酶及限制内切酶。解淀粉芽孢杆菌 (B aillus am yloliquefaciens)为革兰氏阳性 ,杆状细菌与枯草芽孢杆菌具有很近的亲缘关系 [ 10 ]。它具有较强的胞外酶分泌能力 ,是淀粉酶、蛋白酶和β2糖苷酶的等一些主要酶制剂的生产菌株 [ 11 ]。同时 ,一些解淀粉芽孢杆菌可以分泌抑菌素 ,抑制植物上的多种病原真菌 ,也是用于生物防治的理想菌株 [ 12～14 ]。由于 B. am yloliquefaciens体内存
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
在特有的限制修饰系统 ,使得菌株较为稳定 ,不易受
到外界 DNA的侵染 ,但同时也使得通过基因工程手
段改造 B. am yloliquefaciens变的较为困难。
为了研究 B. am yloliquefaciens菌株的限制修饰
系统 (RM )及通过基因工程手段改造 B. am y lolique2
faciens菌株。从 B. am y loliquefaciens C IC IM B2125菌
株中克隆了甲基转移酶基因 ( bam H IM ) ,并对该基
因的功能进行验证和序列分析。
1　材料与方法
1. 1 菌种、质粒及主要试剂
解淀粉芽孢杆菌 (B. am yloliquefaciens)由江南大学
工业微生物资源和信息中心 ( http: / /www. cicim2cu.
jiangnan. edu. cn)提供 ,菌种保藏编号 C IC IM B2125。
大肠杆菌 JM109,质粒 pBlue scrip t II, PHY23002PLK为
本实验室收藏。质粒 PUB110来源于 B acillus Genet2
ic Stock Center (BGSC)。 Pfu DNA聚合酶、限制酶、
DNA Marker均购自上海生物工程有限公司。质粒
提取、PCR产物纯化、胶回收试剂盒购于北京博大
泰克生物有限公司。S2腺苷酰甲硫氨酸 ( SAM )购自
上海吉泰生物有限公司。
1. 2　DNA的提取
解淀粉芽孢杆菌 (B. am yloliquefaciens C IC IM
B2125)基因组 DNA提取、E. coli质粒提取、连接、转
化参考分子克隆相有关方法进行 [ 15 ]。 PCR产物纯
化、胶回收参考试剂盒说明书进行。
1. 3　PCR扩增
按 B am H I甲基转移酶基因 (bamHIM )序列 ( Gen2
Bank登录号 : X55285)设计一对引物用于扩增 bam 2
H IM 基因。上游引物 Bamet01: 5′2ATTCAGAATTC2
CTCCTGATAACAATTGACGC23′,下游引物 Bamet02:
5′2ATTCAGAATTCGCAAGGAAATGCAAGGTC23′, 引
物两端均含有 EcoRⅠ位点。引物由上海生物工程有
限公司合成。以解淀粉芽孢杆菌 (B. am yloliquefaciens
C IC IM B2125)的基因组 DNA作为 PCR模版 ,用引物
Bamet01、Bamet02, pfu聚合酶扩增 bamH IM 基因。扩
增条件 : 94℃ 4 m in; 94℃ 0. 5 m in, 52℃ 1 m in, 72℃
2130 m in; 72℃ 10 m in。
1. 4　目标片段的克隆与序列测定
按试剂盒的说明将 PCR产物纯化 ,并用 EcoR I
酶切 ,酶切后产物与经 EcoR I酶切的载体 pB lue scrip t
II连接 ,构建克隆 pSK2met转化大肠杆菌 JM109感受
态细胞 ;在含有 IPTG和 X2Gal的 Amp抗性 LB平板
上筛选转化子 ,挑选白色转化子。提取阳性克隆质
粒 , EcoRⅠ酶切和 PCR检测鉴定后 ,送至上海生物
工程有限公司进行序列测定。
1. 5　M. B am H I功能验证
1. 5. 1　粗酶的制备 将验证正确的转化子接种于 3
m l、含氨苄青霉素 100μg/m l的 LB培养基中 , 37℃过
夜培养。以 1∶100转接于 500 ml含上述抗生素的 LB
培养基中 ,培养 OD600至 0. 6～0. 8时 ,离心收集菌体。
加入 10 ml缓冲液 (20 mmol/ l KPO4 , 10 mmol/ lβ2mer2
cap toethanol, 100 mmol/ l NaCl, 2 mmol/ l EDTA, pH 7.
4℃)重悬菌体 ,冰浴超声波破碎菌体细胞。8 000 r/
min, 4℃,离心 30 min,收集上清液。向上清液中慢慢加
人 1 /10 体积的 10%聚乙烯亚胺搅拌 30 min,
8 000 r/m in, 4℃,离心 30 min,去除核酸沉淀 ,上清液即
为粗酶液。
1. 5. 2　酶活力检测 1μg pSK2met DNA与 200μl
粗酶液 37℃作用 3 h,反应体系中添加 5 mmol/ l SAM
作为甲基供体。反应结束后用酚仿抽提 ,乙醇沉淀
DNA,用 20μl TE溶解。B am H I酶切经粗酶液处理
过的 DNA和未处理的 DNA,检测甲基化作用效果。
1. 6 序列分析
用 BLAST软件 ( http: ∥www. ncbi. nlm. nih. gov)
进行同源性比较。用 DNAMAN 6. 0软件和 ClustalX
1. 81对所测序列与 GenBank上其它序列进行进行序
列比对 ,用 MEGA 4. 1软件采用邻接法 (neighbor2join2
ing method)构建分子树状图 ,自举分析 ( bootstrap )为
1 000次检测 ,以估算其内分支的支持率。Vector NTI
9. 0分析 ORF,预测等电点。用 CDD v2. 09 ( http: ∥
www. ncbi. nlm. nih. gov/ structure / cdd /cdd. shtm l)分
析结构域 ,用 Signal P ( http: ∥www. cbs. dtu. dk / serv2
ices/ signal P / )预测信号肽。
2　结果和分析
2. 1　bam H IM 基因的 PCR扩增
以 B. am y loliquefaciens C IC IM B21215的基因组
DNA为模板进行 PCR,获得一条约 117 kb的条带
(图 1)。
2. 2　bam H IM 基因的克隆与功能验证
将 PCR产物进行纯化、酶切并与酶切后的载体
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2009年第 11期 　刘洋等 :解淀粉芽孢杆菌 B am H I甲基转移酶基因克隆、功能鉴定与序列分析
pB lue scrip t II连接 ,转化大肠杆菌 JM109感受态。
转化子经过酶切 , PCR验证 (图 2) ,再进行测序。转
化子质粒进行 EcoR I酶切获得 1. 7 kb条带与 PCR
验证结果一致 , 表明质粒构建正确。克隆到的
B am H I甲基转移酶基因含自身启动子 ,可以在大肠
杆菌中表达 ,但表达相对较弱 ,在 SDS2PAGE蛋白电
泳图谱上与对照无明显差异 (数据未列出 )。提取
粗酶液后 ,对含有 B am H I位点的质粒进行甲基化处
理。结果表明 :克隆到的 B am H I甲基转移酶基因的
表达 ,可以将质粒上的 B am H I位点甲基化 ,甲基化
后质粒 B am H I不能将该位点切开 (图 3)。
2. 3　bam H IM 基因的序列分析
对克隆的 bam H IM 基因进行测序并提交 Gen2
Bank进行序列比对 ,发现该基因与报道的 bam H IM
基因 ( GenBank登录号 : X55285 )同源性达 99% ,
有两个碱基发生改变 ,分别位于 1 250 ( C→T)和 1
452 (A→G) ,氨基酸同源性为 97%。克隆的 bam 2
H IM 基因片段全长 1 679 bp ,利用 Vector NTII 9. 0
件分析发现 ,该片段含有一个 1 271 bp的 ORF,编
M. DNA 分子量标准 ; 1. pUB110酶切 (B am H I) ;
2. pUB110 —酶切 (B am H I) ; 3. pHY23002PLK/B am H I;
4. PHY23002PLK — /B am H I( —经甲基化处理 )
图 3　B am H I甲基转移酶基因功能验证
码 423个氨基酸 ,成熟蛋白分子量为 49 kD ,预测
等电点为 8. 7。
用信号肽软件对 M. B am H I酶的氨基酸序列进
行分析 ,结果表明该蛋白不具有信号肽序列 ,属于非
分泌蛋白。将 M. B am H I氨基酸序列提交 CDD ,发
现该酶的 138～356位氨基酸存在 NADB _Rossmann
结构域 ( Rossmann2fold NAD ( P) ( + ) 2binding p ro2
teins) ,该区域特异识别 DNA双链序列 ( GGATCC) ,
并在双链的 C25 位置甲基转移 ,保护 DNA 不被
B am H I内切酶识别而降解。
应用 BLAST软件对 M. B am H I与 GenBank甲基
转移酶的氨基酸序列进行了比对 ,选取与 M. BamH I
酶同源性较高的甲基转移酶 ,用于做进化树构建。不
同来源的甲基转移酶缩写及来源菌株如下 : M.
B am H I (B acillus am yloliquefaciens) , M. B sp (B acillus
sp) ,M. Tbaro ( Therm ococcus baroph ilus MP) ,M. D pn IIB
(Cand ida tus C loacam onas acidam inovorans) , M. Hpa I
( Haem oph ilus para influenzae ) , M. M bo II (M oraxella
bovis) ,M. Ecoli ( Escherich ia coli B171) ,M. B clau (B a2
cillus clausii KSM 2K16 ) , M. B stYI ( Cand ida tus C loa2
cam onas acidam inovorans) ,它们与 M. B am H I的同
源性在 18% ～49%之间。利用 Clustal X软件将这
些不同菌种来源的甲基转移酶氨基酸进行比对 ,
并构建系统发育进化树见图 4。B. am y loliquefa2
ciens, B acillus sp菌株的甲基转移酶分在同一个簇
中 ,序列同源性分别为 49%。 Therm ococcus ba r2
oph ilus M P, Cand ida tus C loacam onas acidam in2
ovorans, B acillus clausii KSM 2K16菌株来源的甲基
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
转移酶分在另外一个簇中 ,序列同源性分别为
32% , 33% , 17. 85% , M. B am H I与 M oraxella bovis
菌株来源的的甲基转移酶 (M. M bo II)亲缘性较远。
分支处数值表示支持率
图 4　基于不同菌株来源甲基转移酶序列和
Ne ighbor2Jo in ing法构建的系统发育树
3 讨论
从 B. am yloliquefaciens C IC IM B2125菌株中克隆
了甲基转移酶基因 ( bamH IM ) ,并验证了该基因的功
能 ,表明在 B. am yloliquefaciens C IC IM B2125菌株中
确实存在含有甲基转移酶 (M. B am H I)的限制修饰系
统。所克隆的甲基转移酶基因与报道的 bam H IM 基
因差异不大 ,仅有两个碱基差异 ,这可能与 B.
am yloliquefaciens C IC IM B2125菌株与报道的菌株亲
缘性较近和 bam H IM 基因具有高度保守性有关。该
基因能在大肠杆菌中正常表达 ,表明克隆的 bam 2
H IM 基因的启动子序列是完整的 ,而且都可以被大
肠杆菌 RNA聚合酶的σ因子识别。E. coli RNA聚
合酶能与 B am H I甲基转移酶的启动子区域结合 ,使
得 B am H I甲基转移酶基因可以在大肠杆菌细胞中
正确表达 ,该结果与 Connaughton[ 7, 8 ]报道的结果一
致。B am H I甲基转移酶可以将 B am H I位点进行甲
基化 ,从而保护 DNA不被 B am H I切割。
M. B am H I与其他菌株的甲基转移酶氨基酸序
列对比发现 ,不同菌株来源的甲基转移酶与 M.
B am H I同缘性较低 ,但甲基转移酶结构上存在有相
对保守的区域 ,说明甲基转移酶具有相似功能。
从 B. am yloliquefaciens C IC IM B2125菌株中克
隆了 B am H I甲基转移酶基因 ( bam H IM )为高效表
达、纯化、制备该酶奠定了基础。同时也为进一步研
究 B. am yloliquefaciens C IC IM B2125菌株的限制修
饰系统和菌株改造奠定了基础。
参 考 文 献
1　陈伟伟 ,曹梦西 ,杨玉慧 ,等. 现代农业科技 , 2008, 14: 195～199.
2　 U rig S, Gowher H, Hermann A, et al. J Mol B iol, 2002, 319 ( 5 ) :
1085～1096.
3　 Gromova ES, Khoroshaev AV. Molekulyarnaya B iologiya (Moscow) ,
2003, 37 (2) : 300～314.
4　 Kessler C,Manta V. Gene, 1990, 92 (1～2) : 1～248.
5　 McClelland M, Nelson M. Gene, 1988, 74 (1) : 291～304.
6　 Guha S. Gene, 1988, 74 (1) : 77～81.
7　 Connaughton JF, Vanek PG, Lee2L in SQ, et al. Gene Anal Tech,
1988, 5 (6) : 116～124.
8　 Connaughton JF, Kaloss WD, Vanek PG, et al. Nucleic Acids Res,
1990, 18 (13) : 4002.
9　 Vanek PG, Connaughton JF, Kaloss WD, et al. Nucleic Acids Res,
1990, 18 (20) : 6145.
10　Welker NE, Campbell LL. J Bacteriol, 1967, 94 (4) : 1124～1130.
11　Vehmaanpera J, Steinborn G, Hofemeister J. J B iotechnol, 1991, 19
(2～3) : 221～240.
12　Quan CS,W ang JH, Xu HT, et al. W ei ShengW u Xue Bao, 2006, 46
(1) : 7～12.
13　Sutyak KE, W irawan RE, A routcheva AA, et al. J App l M icrobiol,
2008, 104 (4) : 1067～1074.
14　Danielsson J, Reva O , M eijer J. M icrob Ecol, 2007 , 54 ( 1 ) : 134
～140.
15　萨姆布鲁克 J,弗里奇 EF,分子克隆实验指南 (第 2版 ) [M ]. 北
京 :科学出版社 , 1986.
86