全 文 ：第 29卷　第 5期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 29 No. 5
2001年 10月 Jour. o f No r th west Sci-Tech Univ . of Ag ri. and Fo r. ( Nat. Sci. Ed. ) Oct. 2001
杜仲叶总黄酮含量测定方法研究
尉　芹 1 ,王冬梅 1 ,马希汉2 ,张康健 1
( 1西北农林科技大学 林学院 ; 2生命科学学院 ,陕西 杨陵 712100)
　　 [摘　要 ]　为了解决硝酸铝比色法在测定杜仲总黄酮时含量偏高的问题 ,用外标法和纸层析法对干扰测定的
因素和测定方法进行了研究。 结果表明 ,绿原酸是硝酸铝比色法测定杜仲黄酮的主要干扰因素 ,干扰程度大于
50% ;将纸色谱与硝酸铝比色法结合进行测定 ,可消除干扰 ,准确度提高 ,标准差为 10. 6 mg /g ,测定回收率为
99. 75%。
[关键词 ]　杜仲叶 ;总黄酮测定 ;绿原酸
[中图分类号 ]　 O652; Q949. 751. 5　　　 [文献标识码 ]　 A [文章编号 ]1000-2782( 2001) 05-119-05
　　杜仲为杜仲科杜仲属植物 ,其皮是我国特有的
名贵滋补药材 ,叶是制备保健品的重要原料。黄酮类
化合物是杜仲的主要有效成分之一 ,具有多种生物
活性。杜仲中黄酮类化合物含量的高低 ,是判断杜仲
生药及其相关产品的重要指标 [ 1～ 3 ]。
目前 ,国内对黄酮含量的测定多采用硝酸铝比
色法和高效液相色谱法 [4～ 7 ] ,后者测定精度高 ,但仪
器价格昂贵 ,而且要有合适的标样。前者虽专一性
差 ,测定结果受杂质干扰大 ,但它适合测定样品中的
总黄酮 ,且不需价格昂贵的仪器 ,一般实验室均可完
成。作者在用硝酸铝比色法测定杜仲叶及其提取物
中的总黄酮时 ,发现结果往往偏高 ,为了消除干扰因
素 ,寻求较为准确的测定方法 ,本研究对影响结果的
干扰因素及杜仲叶中黄酮的测定方法进行了研究。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
　　杜仲叶采自西北农林科技大学校园内 ;杜仲纯
粉 (杜仲叶水提取液浓缩干燥所得 ) ;杜仲黄酮粗品
(杜仲叶乙醇提取液浓缩后经大孔树脂吸附 ,用质量
分数为 85%乙醇洗脱 ,收集洗脱液后 ,回收溶剂浓
缩干燥所得 ) ;试剂均为分析纯。
1. 2　仪　器
754型紫外 -可见分光光度计 (上海第三分析仪
器厂 ) ; 365 nm紫外分析仪 (上海科艺光学仪器厂 ) ;
H6605超声清洗机 (无锡超声电子设备厂 )。
1. 3　测定波长的选择和工作曲线的绘制 [8 ]
精密称取芦丁 20 mg ( 120℃烘至恒重 )置 100
mL容量瓶中 ,加质量分数为 60%的乙醇定容至刻
度 ,摇匀 ,取 25 mL用蒸馏水稀释至 50 m L( 0. 1
mg /mL) ,准确吸取 0, 1. 0, 2. 0, 3. 0, 4. 0, 5. 0 mL分
别置于 10 mL具塞试管中 ,先加质量分数为 5%的
亚硝酸钠溶液 0. 3 mL,摇匀 ,放置 6 min,再加入质
量分数为 10%的硝酸铝溶液 0. 3 mL,摇匀 ,放置 6
min;再加入 1 mol /L NaOH溶液 4. 0 mL,分别用质
量分数为 30%的乙醇稀释至刻度 ,摇匀 ,放置 15
min,在 480～ 540 nm的波长范围内进行扫描 ,选择
最佳吸收峰波长 ,并在此波长下作工作曲线。
1. 4　供试液的制备
1. 4. 1　杜仲叶样品液制备　精密称取 5 g杜仲叶
粉 ,用质量分数为 70%的乙醇提取 3次 ,每次 1. 5
h,合并滤液 ,浓缩定容至 50 mL,吸取 2 mL于 50
mL容量瓶中 ,用质量分数为 30%的乙醇定容 ,备
用。
1. 4. 2　杜仲纯粉样品液制备　精密称取杜仲纯粉
0. 1 g ,用质量分数为 60%的乙醇定容在 100 mL容
量瓶中 ,然后吸取 25 mL于 50 m L容量瓶中用水稀
释定容至刻度 ,备用。
[收稿日期 ]　 2001-03-14
[基金项目 ]　陕西省科技研究重大项目 ( 97K04-G2)
[作者简介 ]　尉　芹 ( 1958- ) ,女 ,山西临猗人 ,副教授 ,主要从事林产品分析和开发利用研究。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2001. 05. 032
1. 4. 3　杜仲黄酮粗品供试液制备　精密称取杜仲
黄酮 0. 1 g ,用水溶解在 100 mL容量瓶中 ,备用。
2　结果与分析
2. 1　测定波长与标准曲线的确定
　　以芦丁为标样 ,硝酸铝为显色剂 ,测得的最大吸
收波长为 510 nm。回归方程为:
A = 0. 007 3+ 10. 588 6c, r = 0. 999 2。
2. 2　绿原酸对测定杜仲叶总黄酮含量的影响
作者在用水提铅沉法对杜仲叶总黄酮用硝酸铝
比色法进行测定时 ,含量竟高达 92. 11% ,此结果与
其他现象不符。鉴于绿原酸是杜仲叶中的主要有效
成分 [ 9 ] ,初步判断可能是绿原酸对测定结果具有正
性影响。将测试液经纸层析后 ,在 365 nm荧光灯下
检测 ,果然发现在与绿原酸 Rf 值相同处存在强烈
荧光 ,为进一步验证干扰物质为绿原酸 ,用绿原酸进
行了检验。
2. 2. 1　定性检验　称取绿原酸标准品 0. 01 g,用质
量分数为 30%的乙醇定容至 100 mL,加入显色剂 ,
在 510 nm处测定吸收光度。结果表明 ,当绿原酸质
量浓度为 0. 03, 0. 05和 0. 07 g /L时 ,其吸光度分别
为 0. 338, 0. 564, 0. 789,说明绿原酸加入黄酮显色
剂后 ,在 510 nm处确有吸收 ,吸光度随绿原酸加入
量的增加而增大 ,且呈线形关系。 因此可以认为 ,绿
原酸对测定杜仲叶中总黄酮有干扰。
2. 2. 2　定量检验　为了确定绿原酸对硝酸铝比色
法测定黄酮的影响程度 ,本研究采用了外标法 ,即硝
酸铝比色法测定样品中总黄酮含量 (样品为杜仲纯
粉 ) ,同时测定样品中的绿原酸含量 [2 ]。然后在样品
中加入等量绿原酸 ,再用硝酸铝比色法测定加入绿
原酸后的样品的总黄酮含量。
表 1　绿原酸对总黄酮含量测定的影响
Table 1　 Th e influence o f chlo ro genic acid on the measur ement o f to tal flav onoids mg /g
样品中绿原酸含量
Con tent of chlorog enic acid in sample
未加绿原酸时总黄酮含量
Conten t of f lavonoids
wi th out adding chlo-
rogenic acid
加入绿原酸后总黄酮含量
Conten t of f lavon oid s af ter
adding chlo rogenic acid
150. 0 248. 7 547. 5
　　测定结果 (表 1)显示 ,在样品中加入等量绿原
酸后 ,用硝酸铝比色法测得的总黄酮含量比未加入
绿原酸的高出 1倍多 ,因此可以认为 ,用该法测定杜
仲叶中总黄酮含量时 ,绿原酸的干扰大于 50% ,故
绿原酸的影响不容忽视。因此 ,直接用硝酸铝比色法
测定杜仲叶中总黄酮含量时 ,必须设法消除绿原酸
的干扰。
2. 2. 3　绿原酸的干扰原因探讨　以杜仲纯粉为对
照 ,处理 1和处理 2分别加入等量邻苯二酚和对苯
二酚 ,测定酚类化合物对杜仲总黄酮含量的影响。结
果 (表 2)表明 ,加入邻苯二酚后 ,在 510 nm处吸光
值大增 ,而对苯二酚却没有影响。因此 ,可以确定与
Al3+ 配合显色。 绿原酸为 3-咖啡酰奎尼酸 ,分子中
的咖啡酰基上含有邻二酚羟基 ,故可以与 Al3+ 配合
显色 ,从而对硝酸铝法测定杜仲中的总黄酮产生干
扰。
表 2　酚类化合物对硝酸铝比色法测定杜仲总黄酮的影响
Table 2　 Influence o f pheno ls on
the measurement of flavonoids
处理
Treatmen t
CK
处理 1
Treatmen t 1
处理 2
Tt reatmen t 2
吸光度
Absorbency
0. 563 2. 72 0. 536
2. 3　纸层析-硝酸铝比色法测定杜仲叶总黄酮含量
为了消除绿原酸的干扰 ,本研究首先采用纸层
析法将样品中的黄酮与绿原酸分离 ,对分离出的黄
酮用硝酸铝比色法进行测定。
2. 3. 1　标准曲线的绘制　精密称取于 120℃干燥
至恒重的芦丁 20 mg ,用甲醇在 10 mL容量瓶中定
容 ,用 10μL微量进样器点样 ,点样量分别为 10,
20, 30, 40, 50μL,然后用 BAW溶剂系统 (正丁醇∶
冰醋酸∶水= 4∶ 1∶ 2(体积比 ) )分别在层析缸中展
开 ,挥干溶剂后在 365 nm紫外分析仪下观察 ,将褐
色带状部分剪成细条 ,分别装在 10 mL具塞试管
中 ,各加入 5 mL甲醇 ,超声波震荡 20 min,取出加
入硝酸铝显色剂 ,在 510 nm下测定吸光度 ,绘制出
标准曲线 ,回归方程为 A= 0. 002+ 6. 1c, r =
0. 999 2。其中 , A为吸光度 ; c为浓度 ( mg /g ) ; r为回
归系数。
2. 3. 2　测定步骤　将杜仲叶的乙醇提取物 (或各种
杜仲制品的溶液 )定量点样于层析纸上 ,用 BAW溶
剂系统展开 ,在 365 nm紫外分析仪下 ,杜仲中所含
的各种黄酮为棕褐色的谱带 (自然光下为淡黄色 ) ,
120 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 29卷
绿原酸为强烈的蓝色荧光带。将代表黄酮的谱带用
铅笔标记后剪下 ,处理方法同 2. 3. 1,测定吸光度并
根据标准曲线计算总黄酮含量。若需要 ,可将发荧光
的绿原酸谱带剪下 ,并进行含量测定。
2. 3. 3　精密度试验　以杜仲粗黄酮为样品 ,平行称
取 5份 ,用上述方法进行测定 ,结果如表 3所示。 从
表 3可以看出 ,用纸层析 -硝酸铝比色法测定杜仲中
的总黄酮 ,标准差为 10. 6 mg /g,说明该法重现性
好。
表 3　纸层析 -硝酸铝比色法测定黄酮的精密度试验
Table 3　 Precision test o f PC-a luminum nitr ate colo rime try method mg /g
编号
Serial No.
总黄酮含量
Content of f lav onoids
编号
Serial No.
总黄酮含量
Conten t of f lavon oid s
1 257. 7 4 268. 0
2 243. 4 5 243. 3
3 257. 7
　　注:标准差为 10. 6。
Note: S tandard deviation is 10. 6.
2. 3. 4　回收率试验　以杜仲黄酮粗品为供试样 ,加
入芦丁标准品 ,进行回收率试验 ,结果如表 4所示。
由表 4可以看出 ,该方法测定的平均回收率为
99. 75%。
表 4　纸层析 -硝酸铝比色法测定黄酮的回收率试验
Table 3　 Reclaim test o f PC-aluminum nitra te colorimet ry meth od
样品编号
Serial
No.
黄酮含量 /mg
Conten t of
f lavonoids
加入芦丁量 /mg
Amoun t of
rut in add ed
理论值 /mg
Theoretic
v alue
测定值 /mg
Measu ring
value
回收率 /%
Reclaim
rate
1 0. 140 3 0. 01 0. 150 3 0. 146 9 97. 74
2 0. 140 3 0. 02 0. 160 3 0. 163 2 101. 8
3 0. 140 3 0. 03 0. 170 3 0. 169 8 99. 71
2. 3. 5　杜仲叶总黄酮含量的测定　用纸层析 -硝酸
铝比色法对杜仲叶中的总黄酮进行了测定 (表 5)。
由表 5可见 ,总黄酮平均含量为 13. 6 mg /g。这一结
果 ,与实际情况较为相符。
表 5　纸层析 -硝酸铝比色法测定的杜仲叶中的总黄酮的含量 mg /g
Table 5　 Content of flav onoids in the leaves o f Eucommia ulmoides by PC-aluminum nitra te colorimet ry meth od
编号
Serial
No.
总黄酮含量
Content of f lav onoids
编号
Serial
No.
总黄酮含量
Conten t of f lavon oid s
1 13. 4 3 15. 0
2 12. 5 平均 13. 6
3　结论与讨论
据文献报道 [ 10] ,硝酸铝比色法测定黄酮的主要
依据是铝离子 Al3+ 与黄酮母核中的 3位 (或 5位 )
上的羟基和 4位羰基配合形成稳定结构 (图 1) ,从
而可用比色法对黄酮含量进行测定。
图 1　 Al3+ 与黄酮母核中 3位 (或 5位 )羟基和 4位羰基形成的稳定结构
Fig . 1　 Coo rdinate str uc ture betw een Al3+ and hydroxy l
and ca rbony l g roups in flav ono ids
　　杜仲中的黄酮类化合物目前发现有以下几 种 [11 ] (图 2)。从图 2可以看出 ,杜仲中所含的黄酮类
121第 5期 尉　芹等: 杜仲叶总黄酮含量测定方法研究
化合物 ,均在 3位 (或 5位 )含有羟基 ,因此可用硝酸 铝进行比色 ,从而对杜仲中的总黄酮进行测定。
图 2　杜仲中的黄酮类化合物
( 1)山柰酚 ; ( 2)紫云英甙 ; ( 3)山柰酚 3-O-6″-乙酰葡萄糖甙 ; ( 4)山柰酚 3-O-芸香糖甙 ;
( 5)槲皮素 ; ( 6)陆地锦甙 ; ( 7)槲皮素 3-O木糖 ( 1→ 2)葡萄糖甙 ; ( 8)芦丁
Fig. 2　 Flavonoids contained in Eucommia ulmoides
( 1) Kaempferol; ( 2) As tragarin; ( 3) Kaempferol 3-O-6″-acetyl-glusosid e; ( 4) Kaempferol 3-O-ru tinoside;
( 5) Quercet in; ( 6) Isoquerci trin; ( 7) Qu ercetin 3-O-sam busbioside; ( 8) . Rutin
　　另一方面 ,本研究结果表明 ,邻二酚类化合物也
可与 Al3+形成稳定结构 (图 3) ,从而干扰测定。
图 3　邻二酚类化合物与 Al3+ 形成的稳定结构
Fig . 3　 Coo rdinate str uc ture fo rmed be tween
Al3+ and or tho-diphenolic compounds
杜仲中的邻二酚类化合物主要为绿原酸 ,该化
合物中的咖啡酰基具有邻二酚类结构 ,因此 ,直接用
硝酸铝比色法测定杜仲中的黄酮含量时 ,绿原酸会
对测定结果产生正性干扰 ,且干扰程度大于 50% 。
本研究将纸层析法与硝酸铝比色法结合测定杜仲中
的总黄酮含量 ,可排除绿原酸的干扰 ,测定结果准
确 ,方法简便易行。 同时 ,还可对杜仲中的绿原酸进
行测定。
据报道 [12 ] ,酚性物质在植物中的存在较为普
遍 ,倘若分子中存在邻二酚结构 (如绿原酸、咖啡酸
等 ) ,直接用硝酸铝比色法测定总黄酮含量时 ,就会
使含量偏高。因此 ,测定植物中总黄酮含量时 ,首先
要确定样品中是否存在会对测定产生干扰的邻二酚
性物质。如果不存在 ,可用硝酸铝比色法直接进行测
定。如果存在 ,则应考虑用纸层析 -硝酸铝比色法进
行测定。
122 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 29卷
[参考文献 ]
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A study on the measurement of flav onoids in the leaves of Eucommia ulmoides
WEI Qin
1 , WANG Dong-mei
1 ,MA Xi-han
2 , ZHANG Kang-jian
1
( 1 College of Forestry; 2 College of Lif e Sciences,Northwest Sci-Tech University of Agricul ture and Forestry , Yangling, Shaanx i 712100,China)
Abstract: It w as found tha t w hen aluminum nit rate w as used as a ch romogenic agent in the
colo rimetric measurement of to tal flavonoids in the leaves of Eucommia ulmoides , the result w as deeply
interfered by chlo rogenic acid, a main chemical contained in the leaves, which possessed a st ructure o f o-
phenolic di-hydro xy ls. Sa tisfacto ry result will be obtained i f the paper chromato g raphy is integ ra ted w ith
colo rimetric measurement.
Key words: Eucommia ulmoides leaf; measurement of f lav onoids; chlo ro genic acid
123第 5期 尉　芹等: 杜仲叶总黄酮含量测定方法研究