全 文 ：多指标综合加权评分法优选法半夏炮制工艺
张　琳 ,吴　皓＊ ,朱　涛
(南京中医药大学中医药研究院 ,江苏南京 210029)
　　摘要　目的:用正交试验设计对现有法半夏的炮制工艺进行质量评价和优化。方法:选择生石灰用量 、甘草用
量 、炮制时间及炮制温度 4个因素 ,采用 L9(34)正交试验设计 ,以 RP-HPLC法测定炮制品中刺激性毒性成分草酸
钙针晶以及水溶性有效成分鸟苷及甘草酸的含量 ,家兔眼结膜刺激性评价刺激性程度 , 多指标综合加权评分 ,优选
法半夏炮制工艺。结果:根据正交试验结果 , 优选出法半夏炮制工艺:在 30℃下 , 每 100 g半夏 ,用生石灰 10 g、甘草
15 g, 浸泡 48 h。结论:优选的炮制工艺达到了降低半夏刺激性毒性的炮制目的 ,同药典法比较明确了炮制时间和
炮制温度 , 显著缩短了炮制时间。
关键词　法半夏;正交设计;草酸钙针晶;核苷;甘草酸
中图分类号:R283　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)01-0020-04
StudyonProcessingforRhizomaPineliaePraeparatumby
ComprehensiveEvaluationofMultipleMark
ZHANGLin, WUHao, ZHUTao
(NanjingUniversityofChineseMedicine, Nanjing210029, China)
Abstract　Objective:ToinvestigatethebestprocessingtechnologyofRhizomaPineliaePraeparatum.Methods:L9(34)orthogo-
naldesignwasusedwithfourfactors:quantitiesofquicklimeandGlycyrrhizauralensis, processingtimeandtemperature, thecontents
ofCalciumoxalatecrystals, GuanosineandGlycyrrhizicacidweredeterminedbyRP-HPLC, theirritationtestwasdetectedbyswollen
rabbitseyeswithprocessingproducts.Results:Theoptimizedprocessingtechnologywassatisfiedwithsomeconditionsasfollows:the
processingtimewas48 hours, theprocessingtemperaturewas30℃, quantitiesofquicklimeandGlycyrrhizauralensiswere10 gand
15 g.Conclusion:Theoptimizedprocessingmethodbyorthogonaldesignhasachievedthegoaltoreducetoxicity, theprocessingtime
andtheprocessingtemperatureareconfirmedrespectively, andtheprocessingtimeissignificantlyshortenedcomparingwithPharmaco-
poeia.
Keywords　RhizomaPineliaePraeparatum;Orthogonaldesign;Calciumoxalatecrystals;Nucleoside;Glycyrrhizicacid
基金项目:国家自然科学基金项目(编号 33772785);国家十一五支撑计划(编号 2006BAI09B06-10)作者简介:张琳(1980-),男 ,硕士研究生 ,研究方向:中药质量控制;E-mail:juezhangyan@gmail.com。＊通讯作者:吴皓 ,教授 ,博导 , Tel:025-86798163, Fax:025-86798230, E-mail:whao5795@vip.sina.com。
　　法半夏是半夏的一个炮制品种 ,炮制作用是降
低毒性 ,长于驱寒痰。自 1963年第二版药典收载起
至 2005版药典中 ,法半夏炮制方法仅有对辅料用量
的要求 ,但对炮制时间和炮制温度均没有明确的量
化指标 ,仅凭口尝和外观颜色控制炮制程度 ,缺乏客
观 、量化的质量评价标准 。本课题组已证实半夏中
的草酸钙针晶为半夏的主要刺激性毒性成分 [ 1] ,针
晶含量与家兔眼刺激程度呈确切的量效关系 ,本课
题组前期的研究还表明半夏药材中的水溶性核苷类
组分为半夏的有效部位之一 ,具有抗炎 、增强免疫作
用 ,炮制辅料甘草中的甘草酸 、甘草次酸类成分具有
抗炎 、抗菌等药理作用 [ 2] 。
本研究以草酸钙针晶的含量及家兔眼刺激性程
度为毒性评价指标 ,以法半夏中核苷类成分鸟苷含
量及甘草酸含量为有效成分指标 ,多指标综合加权
评价 ,采用正交设计方法 ,优选法半夏的炮制工艺 ,
现将实验结果报告如下。
1　材料
1.1　药材与试剂
药材:生半夏购于安徽亳州药材市场 (四川
产),甘草购于南京中医药大学门诊部 ,经本校中药
鉴定教研室王春根教授鉴定 ,分别为天南星科植物
半夏 Pineliaternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎和
豆科植物甘草 GlycyrrhizauralensisFisch.,生石灰为
市售 。含量测定用半夏药材 60℃干燥后 ,粉碎过 40
目筛 ,备用;家兔眼结膜刺激性实验用生半夏药材
60℃干燥后 ,粉碎过 200目筛 ,备用 。
标准品:草酸基准试剂(H2C2O4· 2H2O),纯度
>99.9%,购自江苏省药品检验所 ,鸟苷(中科院上
海生化研究所);甘草酸单铵盐(纯度 >98%,南京
青泽医药科技开发有限公司)。
试剂:10%四丁基氢氧化铵(AR,上海国药集团
化学试剂有限公司),磷酸二氢钾(AR,上海久亿化
学试剂有限公司),醋酸铵(TBA, AR,上海国药集团
·20· 中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 1期 2008年 1月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.01.011
化学试剂有限公司),亚沸蒸馏水(自制),其他试剂
均为分析纯 。
1.2 　仪器　数显恒温水浴锅(上海申胜生物技术
有限公司), Waters2690、Waters515高效液相色谱
仪(美国 Waters公司);BP211D电子天平 (德国);
KQ-500DE型医用数控超声波清洗器 (昆山市超声
仪器有限公司)。
1.3 　实验动物　大耳白种家兔 , 雌雄不限 ,体重
(1.5±0.2)kg,双眼正常 ,由南京中医药大学实验
动物中心(苏动质字 2003)提供 。
2 　方法与结果
2.1 　法半夏炮制样品的制备　以炮制时间(h),
炮制温度(℃),生石灰用量(g),甘草用量(g)四因
素 ,按 L9(34)表设计法半夏炮制工艺 。炮制辅料用
量按每 100g半夏药材计。见表 1。
　表 1 　法半夏炮制因素水平表
水平
因素
A炮制温度(℃)
B炮制时间(h)
C生石灰用量(g)
D甘草用量(g)
1 10 24 5 10
2 30 48 10 15
3 60 72 15 20
　　称取粒径 1 cm左右的净半夏 100 g,用水浸泡
至内无干心;另取不同用量的甘草 ,加水煎煮两次 ,
合并煎煮液 ,每种用量甘草的煎煮液体积大致相等 ,
倒入由不同量生石灰制成的石灰液中 ,搅匀 ,加入上
述已浸透的半夏 ,利用恒温数显水浴锅控制炮制温
度 ,在炮制过程中测定各炮制品溶液的 pH值 , pH
值一直保持在 12以上 。炮制样品制备时间:2006
年 12月中旬 ,当时环境温度:2 ～ 8℃。依次制备得
到 9个法半夏炮制供试样品 。
2.2 　含量测定
2.2.1　色谱条件的选择:草酸钙针晶含量测定色
谱条件:HypersilODS-C18(4.6 mm×250 mm, 5
μm)色谱柱;流动相 0.5% KH2PO4 -0.5 mmol/L
TBA水溶液(pH=2.0),以磷酸调节 pH值 ,流速
0.8ml/min;PDA扫描:200 ～ 400 nm;检测波长:254
nm;柱温:30℃。
鸟苷:HypersilODS-C18(4.6 mm×250 mm, 5
μm)色谱柱;流动相:甲醇-水 (2∶98), 流速 1 ml/
min;PDA扫描:200 ～ 400 nm;检测波长:254 nm;柱
温:28℃。
甘草酸:HypersilODS-C18(4.6 mm×250mm, 5
μm)色谱柱;流动相:甲醇-0.2 mol/L乙酸铵 -冰醋
酸(67∶33∶1),流速:1.0ml/min,检测波长:250nm,
柱温:25℃。
2.2.2　对照品溶液的配制:精密称取草酸 、鸟苷和
甘草酸单铵盐对照品适量 ,分别用蒸馏水和甘草酸
单铵盐流动相配制成浓度分别为 0.2 mg/ml、0.1
mg/ml、0.3 mg/ml(甘草酸单铵盐折合甘草酸为
0.2938mg/ml)的标准品溶液。
2.2.3 　供试品溶液的制备:草酸钙针晶测定供试
品溶液的制备:分别精密称取法半夏各炮制样品 60
目粉末各 0.1g,置玻璃容器中 ,加入 3ml蒸馏水混
匀 ,振荡 5 min, 然后置 60℃水浴加热并搅拌 10
min, 3000 r/min,离心 5 min,残渣以热纯水洗涤 2
次 ,每次 2 ml,混匀离心 ,取药材残渣 ,加 0.2 mlHCl
(1∶1)溶液 , 3.0 ml纯水混匀 ,置 70℃水浴 ,边搅拌
边加热 , 10 min,离心 ,条件同上 ,分离沉淀与上清
液 ,沉淀用 0.1mol/L的 HCl,同上法处理 2次 ,每次
2ml,离心 ,合并上清液 ,置 10 ml量瓶 ,纯水定容至
刻度 。
鸟苷含量测定供试品溶液的制备:将法半夏各
炮制品粉末(40目)于 80℃恒温干燥 8 h备用 ,精密
称定各样品粉末约 1 g,每个样品平行 2份 ,置 50 ml
磨口具塞锥形瓶中 ,分别加水 10 ml,超声提取 3次 ,
每次 30min,于 3500r/min离心 5min,上清液合并 ,
水浴浓缩 ,定容至 10 ml,于 3500 r/min离心 5 min,
上清液过 0.22 μm微孔滤膜 ,得样品液。每份进样
2次 ,进样量 20μl,测定。
甘草酸含量测定供试品溶液的制备:精密称取
法半夏各炮制品 1g,置 25 ml锥形瓶中 ,加流动相 8
ml,超声处理 1 h,放冷 ,置于 10 ml容量瓶 ,加流动
相至刻度 ,摇匀 ,进样前用 0.45 μm微孔滤膜滤过 。
2.2.4 　线性关系考察:分别精密吸取草酸对照品
溶液 2、4、6、10、15、20μl;鸟苷对照品溶液 1、2、4、6、
10、15μl;甘草酸单铵盐对照品溶液 1、2、4、 6、10、
15、20μl。以对照品进样量为横坐标 ,峰面积平均
积分值为纵坐标绘制标准曲线 ,结果经回归分析 ,草
酸在 0.4 ～ 4 μg范围内呈良好的线性关系 ,回归方
程 Y=538950X-34353, r=0.9999;鸟苷在 0.1 ～
1.5 μg范围内呈良好的线性关系 ,回归方程 Y=
1669988X-142181, r=0.9996;甘草酸单铵盐在
0.3 ～ 6μg范围内呈良好的线性关系 ,回归方程 Y=
178585X-39904, r=0.9997。
2.2.5　精密度试验:分别精密吸取草酸对照品 、鸟
苷对照品 、甘草酸单铵盐对照品溶液 10 μl,重复进
样 6次 ,以峰面积计算 RSD,草酸 RSD=0.19%,鸟
苷 RSD=0.71%;甘草酸单铵盐 RSD=0.88%。
·21·中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 1期 2008年 1月
2.2.6　稳定性试验:分别精密吸取法半夏样品溶
液 10、40、10μl,于 0, 2, 4, 8, 12 h进样 ,测定各样品
锋面积 , 结果草酸 RSD=0.53%, 鸟苷 RSD=
1.66%,甘草酸单铵盐 RSD=1.09%。
2.2.7　重复性试验:取法半夏样品 5份 ,分别按样
品含量测定法测定 ,结果草酸 RSD=0.07%,鸟苷
RSD=1.03%,甘草酸单铵盐 RSD=0.94%。
2.2.8　加样回收率试验:精密吸取一已知含量的
法半夏供试品溶液 5ml,各 5份 ,分别加上述对照品
溶液 1 ml,定容至 10 ml,平行进样 ,计算回收率 ,草
酸平均回收率 98.18%(n=5), RSD=1.22%;鸟苷
平均回收率 101.26%(n=5), RSD=1.21%;甘草
酸单铵盐平均回收率 99.118%(n=5), RSD=
0.59%。
2.2.9　样品测定　精密吸取对照品溶液与供试品
溶液适量 ,分别注入液相色谱仪中 ,依法测定 ,按外
标法计算 ,结果见表 2。
2.3　家兔眼结膜刺激性实验　取家兔随机分组 ,
实验时将 20%的各炮制品混悬液及生品混悬液分
别滴加到兔左右眼中 ,每组样品用兔眼 6只 ,每只眼
给药 2滴 。给药后 ,轻轻使上下眼睑被动闭合 5 ～
10 s,使药液和眼充分接触 , 2 min后立即用 40 ～ 50
ml生理盐水冲洗眼睛至眼中无任何异物 ,随后观察
1.5 ～ 3 h内兔眼情况 ,并拍照记录家兔眼的刺激反
应情况。家兔眼刺激性评分标准及刺激程度评分标
准参考文献[ 3]制定。家兔眼刺激程度结果见表 2。
　　表 2 　正交试验结果分析表
试验号
因素
A　 B　 C　 D　
指标
草酸钙针晶含量(X1 /%)
刺激程度得分(X2)
鸟苷含量(X3 /%)
甘草酸含量(X4 /%) 综合评分(Y)
1 1 1 1 1 0.166 2.67 3.419 61.08 89.144
2 1 2 2 2 0.151 2.50 5.262 61.94 53.293
3 1 3 3 3 0.143 2.17 4.307 71.05 34.364
4 2 1 2 3 0.159 2.50 5.265 75.28 53.440
5 2 2 3 1 0.146 2.33 5.651 81.13 27.474
6 2 3 1 2 0.137 2.00 4.298 92.65 24.275
7 3 1 3 2 0.152 2.33 3.836 36.76 75.082
8 3 2 1 3 0.141 2.00 3.524 39.54 59.04
9 3 3 2 1 0.130 1.83 3.426 42.06 45.554
K1 61.93 72.56 57.49 54.06
K2 35.06 46.60 50.76 50.88
K3 59.89 37.73 48.64 51.95
R 26.87 34.83 8.85 3.18
　表 3 　正交试验方差分析结果表
方差来源 离均差平方和 自由度 方差 F 显著性差异
A 1342.680 2 671.34 85.756 ＊
B 1964.993 2 982.50 125.50 ＊＊
C 127.974 2 63.987 8.174
D 15.657 2 7.784
　　注:＊P<0.05;＊＊P<0.01
2.4　实验结果　按照 L9(34)正交设计表的条件进
行试验 ,分别测得草酸钙针晶 、鸟苷和甘草酸的含量
和家兔眼结膜刺激程度 ,并进行多指标综合的加权
评分。草酸钙针晶和鸟苷分别作为半夏的刺激性毒
性成分指标和有效成分指标 ,其含量的高低对半夏
的质量控制有重要影响 ,设定其主观权重为 0.3,家
兔眼刺激程度由眼睛直接观察打分得到 ,有一定的
主观性 ,设定其主观权重为 0.2,甘草酸是炮制辅料
甘草的有效成分之一 ,设定其主观权重为 0.2;以熵
值法 ,按照综合加权评分值越小越好的评判标准 ,求
得各指标的客观权重依次为 0.24、 0.31、 0.18、
0.27,取偏好系数为 0.6 ,计算各标准的综合权重依
次为 0.28、0.24、0.25、0.23,求得各指标的综合加
权评分值 。结果见表 2。
3　炮制工艺的优选
表 3表明因素 A即炮制温度对试验结果呈显
著性影响 ,因素 B即炮制时间对试验结果呈极显著
性影响 ,因素 C、D对试验结果影响不显著。从表 2
可以直观分析出:由极差 R值可知各因素作用的主
次顺序为 B>A>C>D, 最优水 平组合为
A2B3C3D2 ,按照加权评分值越小越好的原则 ,最优
水平组合为 A2B3C1D2 ,两工艺的生石灰用量不同 ,
·22· 中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 1期 2008年 1月
通过方差分析 ,生石灰量是影响鸟苷含量的次要因
素 ,而且用量为 10 g时鸟苷含量均值最大 ,取两个
最优工艺生石灰用量的平均值 ,选择生石灰用量为
10 g。 30℃条件下 ,有效成分鸟苷的含量浸泡两天
达到最高 ,三天时含量下降很多 ,甘草酸的含量相差
不大。而且经炮制后的所有炮制品口尝均没有麻辣
感 ,对家兔眼结膜也没有刺激性 。说明在 30℃条件
下 ,经 48小时后 ,既可以消除半夏的刺激性毒性 ,又
可以使有效组分保持较高的含量 ,同时结合大生产
实际 ,选择 48 h作为浸泡时间。根据以上实验结
果 ,选择较佳工艺为:A2B2C2D2 ,即半夏在 30℃条件
下 , 100 g半夏 ,用 10g生石灰 , 15g甘草浸泡 48h。
4 　讨论
2005版中国药典对法半夏炮制程度的判断 ,仍
采用口尝无麻辣感以及观察断面颜色是否为黄色或
淡黄色为标准。本课题组前期已作了大量研究工
作 ,发现半夏的毒性主要表现为刺激性毒性 ,已证明
草酸钙针晶是半夏主要的刺激性毒性成分 [ 1] ,证实
半夏药材中的水溶性核苷类成分为半夏的有效部位
之一 ,具有抗炎作用。
本实验选择草酸钙针晶的含量为刺激性毒性成
分指标 ,鸟苷和甘草酸含量为有效成分指标 ,同药典
法比较 ,使饮片质量控制标准更加客观 、数值化 ,采
用 L9(34)正交试验设计 ,优化了法半夏炮制工艺 。
本研究设定 10℃和 30℃两个温度 ,分别作为冬季和
夏季的室温温度 ,设定 60℃来考察加温是否可以缩
短炮制时间 。本研究结果表明 ,升高温度确实可以
缩短消除麻辣感的时间。优选的法半夏炮制工艺:
100 g半夏在 30℃条件下 ,用 10g生石灰 , 15g甘草
浸泡 48h。优选的法半夏炮制工艺同药典法比较 ,
明确了炮制时间和炮制温度 ,显著缩短了炮制时间。
在小试过程中 ,测定了不同程度的生石灰溶液 pH
值最大相差只有 0.2左右 ,浸泡过程中辅料溶液的
pH值一直保持在 12以上 ,各法半夏炮制品通过口
尝和家兔眼结膜刺激实验都没有麻辣感和刺激性 ,
说明半夏药材和生石灰比例在 20∶1时 ,就可以达到
半夏减毒的炮制要求。减少生石灰用量是否可行 ,
本课题组将进一步研究 。
本试验采用综合加权评分 ,将多指标试验问题
转化为单指标试验问题 ,然后按单指标分析方法进
行综合分析 ,同时避免了主观赋权的偏向性 ,使各指
标的权重更加客观 、真实 ,使分析结果更趋合理 、可
靠。
参 考 文 献
[ 1] 钟凌云 ,吴皓 , 张科卫 ,等 .生半夏中草酸钙针晶的刺激
性作用研究 .中国中药杂志 , 2006, 31(20):1706-1710.
[ 2] GiancarloAStati, RosaTundis, GianniSacchetti, etal.
Variabilityinthecontentofactiveconstituentsandbilogi-
calactivityofGlycyrrhizaglabra.Fitoterapia, 2004, 75(3
～ 4):371-374.
[ 3] 刘彦群 , 刘凯 ,何静 .壳聚糖家兔眼刺激实验 .徐州医
学院学报 , 2002, 22(3):201-202.
(2007-08-16收稿)
基金项目:新疆医科大学科研创新基金(No.2006-10)作者简介:盛萍(1967-),女 ,山东人 ,副教授 ,硕士 ,长期从事中药 、维药的教学 、科研工作;Tel:(0991)8381112, E-mail:xjsphwy@163.com。
栀子炒炭止血活性部位的药效学筛选研究
盛　萍 1 ,白　杰2 ,张　冰 1
(新疆医科大学 1.中医学院;2.药学院 ,新疆乌鲁木齐 830054)
　　摘要　目的:确定栀子炭止血作用活性部位。方法:对栀子炭按不同提取方法 、不同溶剂极性提取 ,以小鼠的
止血时间为筛选指标对各部位进行筛选。结果:栀子炭水煎煮法可明显缩短小鼠凝血时间;栀子炭的乙酸乙酯部
位 、正丁醇部位 、水部位可以明显缩短小鼠的凝血时间。结论:正丁醇部位 、水部位 、乙酸乙酯部位为栀子炭止血作
用的主要活性部位。
关键词　栀子炭;止血;活性部位
中图分类号:R283　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)01-0023-03
　　栀子为临床常用中药 ,系茜草科植物栀子 Gar-
deniajasminoidesElis的干燥成熟果实 ,具有泻火除
烦 、清热利尿 、凉血解毒的功效 ,常用于治疗热病心
烦 ,黄疸尿赤 , 扭挫伤痛等症 [ 1] 。在临床应用时除
·23·中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 1期 2008年 1月