全 文 ：收稿日期:2007-08-27初稿;2009-01-20二改稿
基金项目:福州市科技星火项目(2005-03)资助
作者简介:许端祥(1974-),男 ,硕士研究生 ,助理研究员 ,主要从事蔬菜遗传与育种研究
　＊通讯作者
上海农业学报　2009, 25(1):121-123
ActaAgriculturaeShanghai
文章编号:1000-3924(2009)01-121-03
瓠瓜 RAPD-PCR反应体系的优化
许端祥 1 ,高　山 1 ,林碧英1 ,钟开勤 2
(1福州市蔬菜科学研究所 , 福州 350012;2福建农林大学园艺学院 ,福州 350002)
摘　要:采用正交试验设计 ,研究瓠瓜 RAPD-PCR反应体系中 5个反应组分的不同浓度对 PCR扩增结果的
影响 , 以期建立瓠瓜 RAPD-PCR的最优反应体系。结果表明 , 在 25 μL的最优反应体系中各组分适合浓度为:1
×PCRbufer, 2.5 mmol LMgCl2 , 100 μmol LdNTP, 0.2μmol L引物 , 1 UTaqDNA聚合酶 , 30 ng模板 DNA。
通过梯度 PCR测验 , 37 ℃为最适的退火温度。
关键词:瓠瓜;正交设计;体系优化
中图分类号:S642　　　文献标识码:A
OptimizationofRAPD-PCRsystemofbotlegourd
XUDuan-xiang1 , GAOShan1 , LINBi-ying1 , ZHONGKai-qin2
(1FuzhouInstituteofVegetableCrops, Fuzhou350012, China;
2ColegeofHorticulture, FujianAgricultureandForestryUniversity, Fuzhou350002, China)
Abstract:Theefectsofthe5factorsandtheirdiferentlevelsofRAPD-PCRsystemonthePCRamplifica-
tionofbotlegourdwerestudiedthroughanorthogonalexperimentinordertoestablishanoptimalRAPD-PCR
systemofbotlegourd.Theresultsshowedthatitwasappropriatefora25 μLreactionsystemtocontain1×
PCRbufer, 2.5mmol LMgCl2 , 100μmol LdNTP, 0.2μmol Lprimer, 1 UTaqDNApolymeraseand30ng
templateDNA.ThegradientPCRtestindicatedthattheoptimalannealingtemperaturewas37 ℃.
Keywords:Botlegourd;Orthogonaldesign;Systemoptimization
瓠瓜 [ Lagenariasiceraria(Mol.)Stand.] ,别名瓠子 、扁蒲 、蒲瓜 ,原产赤道非洲南部低地。瓠瓜在我国
栽培历史悠久 ,是我国栽培的葫芦科最古老的蔬菜之一 ,其类型与品种十分丰富 。但是我国对瓠瓜的种
质资源研究甚少 ,基于分子水平的遗传多样性尚缺乏研究。
RAPD技术以其快速 、简便 、高效的优点 ,在蔬菜遗传研究中被广泛应用 ,该技术对阐明其他葫芦科
植物的亲缘关系十分有效 [ 1, 2] 。但是由于 RAPD分子标记技术用的引物较短(通常为 10 bp),退火温度
低 ,导致其对反应条件很敏感 , 重现性差 , 若仅以单因子试验的方法研究瓠瓜的 RAPD-PCR反应体
系 [ 3] ,就可能忽视各因子之间的相互作用效应 。因此 ,本试验采用正交试验设计 ,从 dNTP、引物 、Mg2+、
TaqDNA聚合酶 、模板 DNA浓度 5个因素不同水平 ,对瓠瓜的 RAPD-PCR反应体系进行优化分析 ,并对
退火温度进行梯度测验 ,以期获得适合瓠瓜的 RAPD-PCR反应体系 ,为今后瓠瓜分子生物学的深入研究
奠定基础 。
1　材 料与 方 法
1.1　材　料
瓠瓜材料为福州市蔬菜科学研究所瓠瓜课题组收集的瓠瓜种质资源 ,采用穴盘育苗 ,待长至 2 ～ 3片
真叶时取嫩叶供试验用。 RAPD-PCR反应的 Taq酶 、dNTP、随机引物和 Mg2+均购自上海生工生物工程有
许端祥 ,等:瓠瓜 RAPD-PCR反应体系的优化
限公司 。
表 1　瓠瓜 RAPD-PCR反应体系因素水平
Table1　FactorsandlevelsofRAPD-PCRsystemofbotlegourd
水平
Level
因素 Factor
dNTP
μmol· L-1
Primer
μmol· L-1
MgCl2
mmol· L-1
TaqDNA
polymerase U
DNA
ng· μL-1
1 250 0.2 1.0 0.75 50
2 200 0.3 1.5 1.00 40
3 150 0.4 2.0 1.25 30
4 100 0.5 2.5 1.50 20
1.2　DNA的提取
DNA的提取采用微量 CTAB提取
方法[ 4] ,用紫外分光光度计检测 DNA
质量和浓度 。
1.3　PCR反应体系的正交试验
采用 L16(45)正交试验设计[ 5] ,对
dNTP、随机引物 S15、Mg2 +、Taq酶和
模板 DNA浓度进行 5因素 4水平筛选 ,方案如表 1和表 2。反应体系总体积为 25μL,包括 1×PCRbuf-
er,其他各成分按表 2加样 ,最后用 ddH2O补足 ,每个处理 2次重复。
表 2　RAPD-PCR正交试验设计表
Table2　OrthogonaldesignforRAPD-PCRsystem
实验号
Experimentno.
因素 Factor
dNTP μmol· L-1 Primer μmol· L-1 MgCl2 mmol· L-1 TaqDNApolymerase U DNA ng· μL-1
1 250 0.2 1.0 0.75 50
2 250 0.3 1.5 1.00 40
3 250 0.4 2.0 1.25 30
4 250 0.5 2.5 1.50 20
5 200 0.2 1.5 1.25 20
6 200 0.3 1.0 1.50 30
7 200 0.4 2.5 0.75 40
8 200 0.5 2.0 1.00 50
9 150 0.2 2.0 1.50 40
10 150 0.3 2.5 1.25 50
11 150 0.4 1.0 1.00 20
12 150 0.5 1.5 0.75 30
13 100 0.2 2.5 1.00 30
14 100 0.3 2.0 0.75 20
15 100 0.4 1.5 1.50 50
16 100 0.5 1.0 1.25 40
1.4　PCR扩增与退火温度的确定
初步确定的 RAPD-PCR扩增程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃ 15 s, 36 ℃ 90 s, 72℃ 120 s, 40个循
环;72 ℃ 7min;4℃保存 。反应结束后 , PCR产物在含有 0.5μg mLEB的 1.0%琼脂糖(BBI)凝胶中电
泳 1.5h,凝胶成像系统进行拍照分析 。
根据正交试验结果 ,选择合适的反应体系 ,设定退火温度为(36±2)℃,即 34℃、35℃、36 ℃、37℃、
38 ℃。除退火温度不同外 ,反应程序均与 PCR正交试验设计的反应程序相同 。
1.5　最佳反应体系和退火温度的验证
引物 S15更换为 S161,采用获得最佳反应体系和退火温度对 38个瓠瓜材料进行 RAPD-PCR扩增 ,
检测优化后的体系的可靠性和稳定性 。
1～ 16:表 2处理组合编号 Experimentno.;
M1:100 bp+1.5kbDNAladder
图 1　瓠瓜 RAPD-PCR反应体系正交试验结果
Fig.1　Orthogonalexperimentresultsof
RAPD-PCRsystemofbottlegourd
2　结 果与 分 析
对 PCR扩增结果依据琼脂糖电泳条带的强弱及杂带的
多少进行直观分析[ 6] 。从图 1中可以看出 ,在不同反应体系
中出现的扩增带数目 、亮度和清晰度是不同的。 1、2、11、16
号处理没有出现扩增带;5、6、7、8、10、12号处理扩增带清晰 ,
条带数少;4号处理扩增带条多 ,扩增背景呈弥散状;14号处
理扩增带条多 ,重复性和亮度差。 13号处理扩增条带数清
晰 ,带条数稳定且重复性好 。 13号处理为最佳处理 ,即:在 25
μL反应体系中 , 含 1 ×PCRbufer, 2.5 mmol LMgCl2 , 100
μmol LdNTP, 0.2μmol L引物 , 1UTaqDNA聚合酶 , 30ng模
板 DNA。
122 25卷　
选择 13号处理反应体系 ,进行退火温度的梯度测验 。由图 2可见 ,退火温度 34 ℃时 ,扩增带数少且
不清晰;退火温度 38℃时 ,小分子片段模糊;退火 35 ℃、36℃时 ,扩增带多且清晰 ,但空白有少量模糊的
扩增带;当退火温度为 37 ℃时 ,扩增带多 ,条带清晰 ,空白无扩增产物。 37℃为瓠瓜 RAPD-PCR扩增的最
佳退火温度 。
利用最佳的反应体系和退火温度对 38个瓠瓜材料进行 RAPD-PCR扩增表明(图 3), 38个供试材料
均能扩增出明显清晰的条带 ,扩增片段长 200bp～ 1.5kb,多态性条带数目多且清晰。
3　结　论
试验结果表明 , RAPD-PCR扩增的结果受 Mg2+浓度影响显著 。Mg2+浓度主要通过 Taq酶的活性影响
RAPD的扩增 , Mg2+是 Taq酶的激活剂 , Mg2+浓度过低对 Taq酶的活化作用不够 ,降低扩增产率 ,反之 ,容
易产生非特异性扩增 。Mg2+还能与反应液中的 dNTP、模板 DNA及引物结合 ,影响引物与模板的结合效
率 。试验表明 ,如果 dNTP和引物浓度过低 , Mg2+浓度再高也无法扩增出条带 ,由于 dNTP会对 Mg2+产生
拮抗作用 ,低浓度的 dNTP扩增条带的数量和效果好于高浓度的 dNTP的扩增 。
引物 、Taq酶和模板 DNA浓度须适量。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增 ,且会增加引物之
间形成二聚体的机会 。模板 DNA浓度过高易导致引物或 dNTP过早耗尽 ,出现扩增条带不稳定的现象 。
因此 ,以最低模板 DNA和引物浓度产生所需要的结果为好。Taq酶用量少会使扩增的条带变弱 ,反之 ,则
非特异性扩增产物含量增加 ,一般认为 Taq酶的用量以 1 U扩增效果较好 ,这在本试验得到验证 。
退火温度是 PCR扩增时影响扩增特异性主要的因子 。在一定的温度范围内 ,退火温度越高 ,扩增的
特异性越高 ,同时越容易消除背景。随着退火温度降低 ,扩增产生的特异性也降低。本试验结果认为最
佳的退火温度为 37 ℃。
本试验利用正交试验法对影响 RAPD反应体系的 5个主要因素同时进行研究 ,较快建立了瓠瓜
RAPD的反应体系 。选出的最佳反应体系能有效地进行瓠瓜 RAPD-PCR扩增 ,为瓠瓜分子水平的进一步
研究奠定基础。但利用该方法进行反应体系的优化还存在一定局限性 ,对试验结果优劣进行直观分析存
在主观判断的成分 ,不能很好的估计试验误差 ,说明各个反应条件之间的相互作用等 。
参　考　文　献
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123　1期 上　　海　　农　　业　　学　　报