全 文 ：［收稿日期］ 20130405(006)
［基金项目］ 湖南省研究生科研创新项目(CX2012B344);长沙市科技局计划项目(K1203018-31)
［第一作者］ 匡双玉，博士研究生，从事中药质量与资源研究，Tel:18207424148，E-mail:kuangshuangyu@ yahoo． com． cn
［通讯作者］ * 刘塔斯，教授，从事中药质量与资源研究工作，Tel:0731-88458234，E-mail:liutasi@ 126. com
菝葜乙酸乙酯提取物对 THP-1 源性荷脂细胞
胆固醇蓄积及 SＲEBP-1 表达的影响
匡双玉1，2，李熠3，匡稳定2，刘塔斯1*
( 1. 湖南中医药大学药学院，长沙 410007; 2. 南华大学附属第二医院，湖南 衡阳 421001;
3. 南华大学医学院，湖南 衡阳 421001)
［摘要］ 目的:观察菝葜乙酸乙酯提取物对人单核 /巨噬细胞系(THP-1)源性荷脂细胞胆固醇蓄积的影响，并初步探讨
类固醇调节因子结合蛋白-1(SＲEBP-1)蛋白表达在其中的作用。方法:以 THP-1 源性荷脂细胞为模型，洛伐他汀(80 mg·L －1)
做阳性对照，菝葜乙酸乙酯提取物不同浓度(0，40，80，160 mg·L －1)作用于细胞 24 h以及 80 mg·L －1作用于细胞不同时间(0，
12，24，48 h)，高效液相色谱法测定细胞内总胆固醇(TC) ，游离胆固醇(FC)，胆固醇酯(CE)的含量，油红 O染色观察菝葜乙酸
乙酯提取物对 THP-1 源性荷脂细胞中脂滴形成的影响，Western blot印迹法检测细胞内 SＲEBP-1 蛋白表达变化。结果:菝葜乙
酸乙酯提取物明显降低 THP-1 源性荷脂细胞中脂滴含量，细胞内 TC，FC，CE水平呈现一定的剂量和时间依赖性下降趋势，同
时 SＲEBP-1 蛋白表达上调。结论:菝葜乙酸乙酯提取物能引起 THP-1 源性荷脂细胞 TC，FC，CE 含量下降，且这种作用与
SＲEBP-1 蛋白表达上调有一定关系。
［关键词］ 菝葜;乙酸乙酯提取物;胆固醇;类固醇调节因子结合蛋白-1
［中图分类号］ Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)03-0137-06
［doi］ 10． 11653 /syfj2014030137
Effect of Ethyl Acetate Extract from Smilax china on
Cholesterol Accumulation and SＲEBP-1 Expression
in THP-1-derived Lipid-loaded Cells
KUANG Shuang-yu1，2，LI Yi3，KUANG Wen-ding2，LIU Ta-si1*
(1. Medicine College，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，China;
2. Second Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang 421001，China;
3. Medical College，University of South China，Hengyang 421001，China)
［Abstract］ Objective:To observe the effect of ethyl acetate extract from Smilax china on the cholesterol
metabolism in monocyte /macrophage cell line (THP-1)-derived lipid-loaded cells，and to investigate the effect of
the expression of sterol regulatory element binding protein (SＲEBP-1)and caveolin-1 in this process． Method:
The ethyl acetate extract with different density (0，40，80，160 mg·L －1)were used to detect the level of total
cholesterol (TC)，free cholesterol (FC) ，cholesterol ester (CE)by using high performance liquid phase analytic
process and the expression of SＲEBP-1 by Western blot at different time (0，12，24，48 h)in THP-1 derived lipid-
loaded cells． Ｒesult:The ethyl acetate extract from S． china had some effects on THP-1-derived lipid-loaded
cells，the lipid droplet density decreased in cells and the level of TC，FC，CE was decreased with a dose and time-
dependent manner． The expression of SＲEBP-1 was upregulated． Conclusion:The ethyl acetate extract from S．
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2014 年 2 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 3
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china can decreased the level of TC，FC，CE in THP-1 derived lipid-loaded cells，and it is contributed to the up-
regulation of SＲEBP-1 expression at some degree．
［Key words］ Smilax china ;ethyl acetate extract;cholesterol;SＲEBP-1.
菝葜系百合科菝葜属植物菝葜的干燥根茎，具
有消肿解毒、祛风利湿、抗炎镇痛等功效［1］。其药
理作用广泛，国内外研究主要包括抗炎、抑菌、抗肿
瘤、免疫调节、对心血管系统作用及降糖作用
等［2-9］。其对心血管系统的作用研究主要集中在对
血流动力学的影响方面，而其抗动脉粥样硬化作用
的研究较少。菝葜的化学成分中主要含有皂苷类与
黄酮类化合物［10-12］，而国内外研究发现，皂苷类与
黄酮类化合物是中药抗动脉粥样硬化作用的两类主
要成分，笔者推测菝葜可能也具有抗动脉粥样硬化
作用。本文拟在细胞层面观察菝葜乙酸乙酯提取物
对 THP-1 源性荷脂细胞胆固醇蓄积的影响，同时探
讨其对与胆固醇代谢密切相关的 SＲEBP-1 蛋白表
达的影响。
1 材料
1. 1 药材 菝葜药材(采自湖南衡阳集兵镇)，经
湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定为 Smilax china L．
1. 2 仪器 CO2 培养箱(美国 Shill 公司)，Elx-800
酶联免疫检测仪(美国 Bio-Tek 公司)，垂直电泳仪
及转膜系统(美国 BioＲad 公司)，高效液相色谱仪
(日本三洋公司)，UV-2500 型紫外分光光度计(日
本岛津)，AY220 型电子分析天平(日本岛津)。
1. 3 试剂 SＲEBP-1 一抗(Santa Cruz 公司)，油红
O(Sigma 公司)，人单核 /巨噬细胞(THP-1 细胞)
(中科院上海细胞生物所细胞中心)，小牛血清(购
于杭州四季青公司)，ＲPMI 1640 培养基(Gibco 公
司)，其他试剂均为进口或国产分析纯。
2 方法
2. 1 菝葜化学成分提取与分离 按照文献［13］方
法，菝葜根先粉碎，然后于 100 ℃水解，水解完后水
洗至中性，干燥后以 8 倍量的乙酸乙酯回流提取
2 h，重复回流提取 2 次，乙酸乙酯提取液真空旋转
蒸发干燥。
2. 2 THP-1 细胞的培养 用含 10%胎牛血清且已
加入 2. 5 g碳酸氢钠的 ＲPMI 1640 培养基调细胞密
度至 1 × 106 /mL，3 ～ 4 d 后换入含 0. 1%胎牛血清
的 ＲPMI 1640 培养基中，2 ～ 8 ℃冷冻后做相应
处理。
2. 3 荷脂细胞模型的建立 正常人血浆低密度脂
蛋白(密度 1. 040 ～ 1. 063 kg·L －1)采用序列超速离
心法制备。以 160 nmol·L －1的佛波酯诱导 THP-1 细
胞 24 h后分化成为巨噬细胞，继与 80 mg·L －1的氧
化型低密度脂蛋白孵育 48 h。
2. 4 对 THP-1 源性荷脂细胞胆固醇蓄积的影
响 以THP-1 荷脂细胞为模型，菝葜乙酸乙酯提取
物分别以不同质量浓度(0，40，80，160 mg·L －1)作
用于模型细胞 24 h以及 80 mg·L －1菝葜乙酸乙酯提
取物分别作用于模型细胞不同时间(0，12，24，48 h)
后，高效液相色谱法测定细胞内总胆固醇(TC)、游
离胆固醇(FC)、胆固醇酯(CE)的含量。
2. 5 菝葜乙酸乙酯提取物对 THP-1 源性荷脂细胞
脂滴含量的影响 80 mg·L －1的菝葜乙酸乙酯提取
物作用于 THP-1 源性荷脂细胞 24 h后，油红 O染色
法观察细胞内脂滴含量的变化。
2. 6 油红 O染色 将细胞培养于预先放有无菌盖
玻片的 6 孔培养板，处理结束后，用 PBS 冲洗盖玻
片 3 次，每次 5 min，50%异丙醇固定 15 min，油红 O
染色液染色 10 min，蒸馏水冲洗 3 次，每次 1 min，苏
木素染色 5 min，分色和返蓝后，HPIAS-1000 型图像
分析系统收集图像。
2. 7 细胞内胆固醇的检测 参照文献［14］方法制
备样品，采用 C18柱，柱温 4 ℃，流速 1 mL·min
－1，
250 nm紫外光检测，胆固醇以峰面积定量，内标校
准，以 μg·mg －1细胞蛋白为单位。细胞内胆固醇酯
含量为总胆固醇与游离胆固醇的差值。
2. 8 菝葜乙酸乙酯提取物对 THP-1 源性荷脂细胞
SＲEBP-1 表达的影响 实验分 3 组:正常对照组;荷
脂细胞组;80 g·L －1菝葜乙酸乙酯提取物作用于
THP-1 源性荷脂细胞 24 h 组。Western-blot 检测细
胞内 SＲEBP-1 蛋白表达。在收获好的细胞中加入
三去污剂裂解缓冲液进行细胞裂解，于4 ℃离心
10 min，弃除沉淀，BCA法进行蛋白质定量，取 30 μg
蛋白质加入 2 × SDS 凝胶加样缓冲液中，在 100 ℃
加热 10 min以使蛋白质变性．聚丙烯酰胺凝胶进行
电泳分离，转 PDVF 膜，丽春红染色观察转移效果，
并确定蛋白质相对分子质量标准位置． 封闭液封闭
2 h，按 1 ∶ 500 加入一抗，4 ℃孵育过夜，TBST 洗 3
次，按1∶ 1 000的稀释倍数加入辣根过氧化物酶标记
二抗，室温孵育 1 h，TBST 洗 3 次，用蛋白质印迹荧
光检测试剂盒显示于 X 光片．结果用 Labwork 凝胶
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中国实验方剂学杂志
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Vol． 20，No． 3
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图像分析系统对胶片扫描，以对照组的面积灰度值
为 100%与实验组进行比较和半定量分析。
2. 9 统计学处理 数据以 珋x ± s表示，用 SPSS 11. 0
for windows软件作统计分析，两样本均数比较采用 t
检验，以 P ＜ 0. 05 为差异有显著性意义。
3 结果
3. 1 对 THP-1 源性荷脂细胞胆固醇蓄积的影响
与正常组比较，荷脂细胞组 TC，FC，CE 水平显著升
高(P ＜ 0. 05);与荷脂细胞组比较，菝葜乙酸提取物
低、中、高剂量组 TC，FC，CE 均显著降低(P ＜
0. 01)。细胞内 TC，FC，CE 呈现一定的剂量和时间
依赖性下降趋势，见表 1 ～ 2。
3. 2 对 THP-1 源性荷脂细胞脂滴含量的影响 结
果表明，荷脂细胞组细胞内脂滴较正常组明显增加;
菝葜乙酸乙酯提取物组细胞内的脂滴含量较荷脂细
胞组明显降低，见图 1。
表 1 菝葜乙酸乙酯提取物
对荷脂细胞胆固醇水平影响的量效变化(珋x ± s，n =)mg·g － 1
组别
终质量浓度
/ g·L －1
TC FC CE
正常对照 － 162 ± 14 150 ± 15 12 ± 2
荷脂细胞 － 805 ± 651) 470 ± 331) 335 ± 351)
菝葜提取物 40 500 ± 532) 320 ± 342) 180 ± 172)
80 310 ± 252) 243 ± 242) 67 ± 82)
160 320 ± 272) 250 ± 262) 70 ± 62)
洛伐他汀 80 305 ± 192) 235 ± 272) 70 ± 102)
注:与正常对照组比较1) P ＜ 0. 05;与荷脂细胞组比较2)P ＜
0. 05，(表 2 同)。
表 2 80 mg·L －1菝葜乙酸乙酯提取物
对荷脂细胞胆固醇水平影响的时效变化(珋x ± s，n =)mg·g － 1
组别 时间 /h TC FC CE
正常对照 － 162 ± 14 150 ± 15 12 ± 2
荷脂细胞 － 805 ± 651) 470 ± 331) 335 ± 351)
菝葜提取物 12 430 ± 372) 294 ± 322) 136 ± 152)
24 310 ± 252) 243 ± 242) 67 ± 82)
48 314 ± 362) 248 ± 262) 66 ± 62)
3. 3 对 THP-1 源性荷脂细胞 SＲEBP-1 表达的影响
荷脂细胞内 SＲEBP-1 蛋白表达较正常组低;菝葜
乙酸乙酯提取物作用后，荷脂细胞内 SＲEBP-1 蛋白
表达上调。见图 2。
4 讨论
从中草药中寻找防治动脉粥样硬化的有效药物
一直是人们关注的课题。国内已开展了大量、多角
A. 正常组;B. 对照组 (荷脂细胞组);
C. 菝葜乙酸乙酯提取物 80 g·L －1组(图 2 同)
图 1 菝葜乙酸乙酯提取物作用于 THP-1 源性荷脂细胞对
脂滴含量的影响油红 O染色
图 2 菝葜乙酸乙酯提取物
对 THP-1 源性荷脂细胞 SＲEBP-1 表达的影响
度的研究，现代药理学从调节血脂、抗氧化、血管内
皮细胞功能及血液流变学等多方面对中药抗动脉粥
样硬化作用进行了研究。同时国内外研究发现，皂
苷类与黄酮类化合物是中药抗动脉粥样硬化作用的
两类主要成分。文献报道，菝葜中含有伪原薯蓣皂
苷元、甲基原薯蓣皂苷元、纤细薯蓣皂苷、甲基原纤
细薯蓣皂苷、薯蓣皂苷次皂苷、二氢山柰酚、黄杞苷
和槲皮素 4-O-β-D-葡糖苷等。
本文在细胞层面观察菝葜乙酸乙酯提取物对
THP-1 源性荷脂细胞胆固醇蓄积的影响，同时探讨
其对与胆固醇代谢密切相关的 SＲEBP-1 蛋白表达
的影响，为从菝葜中开发抗动脉粥样硬化新药提供
一定的理论支持。
SＲEBPS是膜结合的转录因子和细胞内胆固醇
代谢的重要调控蛋白，它定位于内质网，由一个调节
亚基和 DNA结合亚基构成。调节亚基对细胞内游
离胆固醇(FC)浓度高度敏感，当细胞内游离胆固醇
浓度下降时，调节亚基与 DNA 结合亚基分离，后者
进入核内与目的基因序列中 SＲE 元件结合，调控基
因转录［15］。
本文初步探讨了菝葜乙酸乙酯提取物对与胆固
醇代谢密切相关的 SＲEBP-1 蛋白表达的影响，为菝
葜乙酸乙酯提取物抗动脉粥样硬化作用的机制研究
提供了一个新的方向。
［参考文献］
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［责任编辑 聂淑琴］
［收稿日期］ 20130408(009)
［基金项目］ 广东省科技厅项目(2012B060300035)
［第一作者］ 龚梦鹃，硕士，副教授，从事神经药理学研究，Tel:18719379003，E-mail:gongmengjuan@ yahoo． com． cn
［通讯作者］ * 邹忠杰，副教授，从事中药药效学评价，E-mail:zouzhongjie@ hotmail． com
基于小鼠游泳计算机自动控制系统的人参抗疲劳作用研究
龚梦鹃1，谢媛媛2，邹忠杰1*
( 1. 广东药学院中药学院，广州 510006; 2. 清华大学化学系，北京 100084)
［摘要］ 目的:基于小鼠游泳计算机自动控制系统，考察人参的抗疲劳作用。方法:将小鼠随机分成 5 组，人参低、中、高
剂量组每天分别灌胃给予 2. 5，5，10 g·kg －1的人参水煎液，空白组和气虚模型组则灌胃给予等体积的蒸馏水，连续灌胃 14 d，
每天 1 次。除空白组给足量饲料外，其余 4 组限制饲料(125 g·kg －1·d －1)。选用已完善的小鼠游泳计算机自动控制系统，观
察人参对游泳计算机自动管理系统的指标评价体系的影响及对气虚小鼠体重，运动后血乳酸(LAC)和尿素氮(BUN)的影响。
结果:10 g·kg －1人参水煎液能延长气虚小鼠负重游泳的下沉时间(ST)和死亡时间(TD)，增加不动时间(IT)、游泳时间
(SWT)、首次下沉时间(FST)、游泳距离(SWD)及不动时间比率(ITＲ)，减少游泳时间比率(SWＲ) ;并能明显增加气虚小鼠体
重;降低运动后的血乳酸(LAC)、血清尿素氮(BUN)。结论:人参能提高气虚小鼠的抗疲劳能力，且从行为学上看人参可使不
动时间比率延长、游泳时间比率缩短而增加耐力。
［关键词］ 人参;气虚;抗疲劳
［中图分类号］ Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)03-0140-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2014030140
·041·
第 20 卷第 3 期
2014 年 2 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 3
Feb．，2014