全 文 ：　第 45卷　第 4期
2006年　7月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM　UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
Vo l. 45　No. 4
Jul.　2006 　
用 ISSR分子标记检测不同尾矿废弃地白茅居群的遗传多样性*
田胜尼 1, 2 , 王峥峰 1 , 高三红 3 , 郝艳茹1 , 彭少麟 1, 3
(1. 中国科学院华南植物园∥广东省数字植物园重点实验室 , 广东 广州 510650;
2. 安徽农业大学生命科学学院 , 安徽 合肥 230036;3. 中山大学生命科学学院 , 广东 广州 510275)
摘　要:采用 ISSR技术对安徽 4个铜尾矿 、 1个铅锌尾矿废弃地上自然定居的白茅和非矿区正常生境下 1个白
茅居群遗传多样性进行了研究。从 100条 ISSR引物中筛选出 10条引物对 6个居群 180个样品进行 PCR扩增 , 共
得到 139扩增带 , 其中多态位点为 132条 , 多态位点百分率为 94.96%。 POPGENE分析表明 , 白茅居群的总遗
传多样性为 0. 3125, 非矿区白茅的遗传多样性远高于另外 5个矿区居群 , 铅锌尾矿的遗传多样性最低 , 6个白茅
居群之间出现明显的遗传分化 (φst=0.030, P <0. 002), 各居群的个体各自聚在一起。 上述结果可能是在金属
尾矿废弃地胁迫下 , 白茅居群遗传本质上产生了明显的遗传分化。
关键词:ISSR;金属尾矿废弃地;白茅;遗传多样性
中图分类号:Q16　　文献标识码:A　　文章编号:0529-6579 (2006) 04-0087-06
　　尾矿 ( tailing s), 又称尾沙 , 是矿业部门在开
采过程中 , 将矿石经粉碎 、浮选中矿 、精矿后产生
大量的固体粉末 。这些尾矿除少量作为旧矿井的填
充料之外 , 其余绝大多数还以填充凹地或筑坝堆放
的方式储存 [ 1] 。长江中下游地区矿产资源分布较
多 , 这些矿产资源的开采 , 为国民经济的发展做出
了贡献 。但在开采过程中 , 产生了大量的矿业废弃
地 , 如尾矿场 (尾矿库)、 排土场等。这些堆放的
尾矿废弃地 , 初期往往寸草不生。在经历一定的时
间后 , 废弃地上开始自然定居少数植物或通过人工
的复垦方式定居一些植物。经过多年对安徽铜陵 、
安庆 、 池州等地的各种废弃地调查发现 , 白茅
(Impera ta cy lindrica (L. ) Beauv.var.)是铜尾矿废
弃地和铅锌尾矿废弃地的绝对优势种 , 在停止较久
的尾矿上形成大规模的群落[ 2] 。
ISSR (In te r - simp le sequence repeat), 简单重
复序列间扩增 , 是 Zietkiew icz等 1994年提出锚定
微卫星 (SSR)策略的一种分子标记 , 即在 SSR的
3’ 端或 5’ 端锚定 1 ～ 4个简并碱基 , 扩增两微卫
星体之间序列的一种分子标记技术[ 3] 。同时 ISSR
技术可快速 、高效和灵敏地检测出基因组 DNA的
多态性 , 而且重复性好 、 操作简单 , 成本较低 。目
前也广泛应用于植物品种鉴定 、遗传作图 、基因定
位 、遗传多样性 、 系统进化及分子生态学研
究[ 4 -6] 。本文通过定居在安徽省铜陵市 、 安庆市铜
尾矿以及池州市铅锌尾矿地自然定居的白茅作为研
究对象 , 以远离矿区正常土壤上生长的白茅居群作
为对照 , 用 ISSR分子标记技术检测白茅居群内
(间 )的遗传多样性 , 为探讨白茅在金属尾矿废弃
地定居机制以及为金属尾矿废弃地的复垦 、 重金属
污染的修复和治理提供理论依据 。
1　材料与方法
1. 1　样品采集
本试验所用样品白茅 , 采集于长江中下游地区
安徽省沿江安庆市月山铜尾矿场 (YS)、 池州市黄
山岭铅锌尾矿场 (HSL)、 铜陵市的五公里铜尾矿
废弃场 (WGL)、 铜官山尾矿库 (TGS)、 狮子山
尾矿库 (SZS)。对照样选定合肥市郊区 (HF),
距安庆月山铜矿 、 池州铅锌矿 、 铜陵市各矿均在
160 km以上。安庆月山铜矿位于池州和铜陵市的
长江上游 , 距池州黄山岭铅锌矿 80 km左右 。在上
述各采样点随机选择 30个植株 。每个体之间的距
离尽可能保持在相距 20 m以上 。但池州市黄山岭
铅锌尾矿场 , 只有早期排放约 15 a以上的铅锌尾
矿上有少量的白茅定居生长 , 面积约 100m 2左右。
因此无法保证个体的相距在 20 m以上 , 尽可能的
拉大距离采集样品 , 有少量个体采集于尾矿与正常
* 收稿日期:2005-08-04
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (30270282);广东省优秀团队资助项目 (003031);广东省重大基金资助项
目 (B20801002)
作者简介:田胜尼 (1971年生), 男 , 博士;通讯联系人:彭少麟;E-m ail: lsspsl@ zsu. edu. cn
中山大学学报 (自然科学版) 第 45卷　
土壤交错区 。样品采集时间为 2004年 8月 。选好
植株 , 采集 2 ～ 3片新鲜叶片放入装有硅胶的封闭
塑料袋中 , 待硅胶颜色变红时 , 重新更换新硅胶 ,
以便叶片尽快干燥 , 供 DNA提取用 。有关样品采
样信息如表 1所示。
1.3　PCR扩增 、条件优化和检测
ISSR引物购于加拿大哥伦比亚大学 。对 ISSR
反应体系进行优化 , 优化后的反应体系如表 2所
示。扩增反应在美国 M J公司 PTC - 100扩增仪进
行。 PCR扩增条件:95℃预变性 5m in, 94℃变性
45 s, 50 ～ 55 ℃复性 45 s (依引物不同而改变 ),
72 ℃延伸 45 s, 35个循环之后 72 ℃反应 10m in。
PCR扩增产物在 w =1.5%琼脂糖电泳分离 , EB染
色后在 KODAK凝胶成像系统观察并拍照。
表 1　6个白茅居群样地特征 1)
Tab. 1　The cha rac te r o f the six I. cy lindrica popu la tion sites
居群代号 经纬度 居群地点 多度 植被状况 采样数
HF 31°51′N, 117°18′E 合肥郊区荒野 4 自然植被良好 , 盖度 80% ～ 100% 30
WGL 30°56′N, 117°48′E 铜陵五公里铜尾矿场 4 主要为自然定居草本植物 , 人工栽植少量柳树 , 盖度约 70% 30
TGS 30°56′N, 117°48′E 铜陵铜官山铜尾矿库 5 自然定居草本植物 , 盖度约 75% 30
SZS 30°56′N, 117°48′E 铜陵狮子山铜尾矿库 5 自然定居草本植物 , 盖度约 50% 30
YS 30°31′N, 117°01′E 安庆月山铜尾矿库 5 人工复垦栽培及自然定居有草本植物 ,人工栽植少量柳树 , 盖度约 70% 30
HSL 30°39′N, 117°28′E 池州黄山岭铅锌尾矿库 3 自然定居少量草本植物 , 盖度 5% 30
1)多度 5表示极丰富 , 4表示丰富 , 3表示不常见
表 2　白茅 ISSR扩增反应体系
Tab.2　The ISSR am plifica tion sy stem of I. cy lindrica
成份 10×
Buffe r
M gC l
2
25m o l /L
DNTP
2. 5 m o l /L
P rim e r
20pmo l /μL
EX Taq
5U
Temp late
10ng /μL H2O
总体积
μL
体积 /μL 1. 0 1. 2 0. 8 0. 4 0. 1 1 5. 4 10
1.4　数据处理与分析　在电泳图谱上每一 DNA片
段被看作一个可区分的分子标记 , 代表引物的结合
位点。同一标记位点有圹增带者记作 1, 没有扩增
带作 0。选取长度在 200 ～ 1 700 bp并且可重复的
DNA带记录分析。用 POPGENE1. 31分析软件对
整个居群和单个居群遗传多样性进行参数分析 [ 8] ,
分别计算了多态点百分率 (PPB , pe rcentage of
po lymo rphic bands)、居群总的遗传多样性 (Ht),
居群平均遗传多样性 (Hs), 群体的遗传分化系数
(G st=1 -Hs H/ t)、 单个居群 N ei基因多样性 ( h)
和香农信息指数 (I), Ne i遗传距离 (GD)和遗
传一致度 (GI)。用 AMOVA 1.55软件分析白茅种
群间和种群内的遗传差异[ 9] 。个体基因型之间的
差异用 (1—S)来衡量 , S为 Ne i和 Li相似性系
数 [ 10] , 由下式得出:
S =2NAB / (NA +NB )
其中 NAB为两基因型共有扩增带 , NA为基因
型 A拥有的扩增带 , NB为基因型 B拥有的扩增
带[ 17 -18] 。基于 Ne is距离 , 用 MEGA1. 01对白茅
群体进行 UPGMA聚类分析[ 11] , 构建树状图 , 用
GenA lEx软件对 6个白茅居群 180个样本进行 PCA
分析 [ 12] 。
2　结果与分析
2.1　引物的筛选结果
从 100个引物中筛选出 10个扩增带多 、 多态
性高 、重复性好的引物 。各引物的扩增结果如表 3
所示 。 10个引物共扩增 139条带 , 其中多态性带
132, 多态位点百分比为 94.96%。各引物扩增带
数和片段大小及多态百分比如表 3所示 , 其中 811
引物扩增带数最多 , 有 18条 , 其它引物多在 12条
到 17条之间。
2.2　6个居群内的遗传多样性分析
表 4为各单个居群遗传多样性 、香农信息指数
和多态位 点百分比以及整体居群的遗传多样性 、
香农信息指数和多态位点百分比。从表 4中可知 ,
88
　第 4期 田胜尼等:用 ISSR分子标记检测不同尾矿废弃地白茅居群的遗传多样性
6个白茅居群总的遗传多样性为 0.312 5, 香农信
息指数为 0.472 1。整个居群的多态位点百分率达
到 94.96%。在 6个居群中 , 位于非尾矿废弃地合
肥白茅居群 (HF)遗传多样性最高 , 为 0. 256 8。
香农指数 0.393 5, 多态位点百分比 82.01%, 也
高出其它尾矿废弃地的白茅居群 。在 4个铜尾矿废
弃地中 , 遗传多样性指数和香农信息指数均比对照
组合肥居群低 , 说明由于铜尾矿不良环境的胁迫 ,
导致白茅种遗传多样性下降。在 5个金属尾矿废弃
地的白茅居群中 , 铜官山尾矿居群遗传性多样性香
农指数最高 , 接近于对照居群的遗传多样性及香农
指数 , 这可能是由于铜官山尾矿库停止时间较久 ,
有较多个体的缘故 。黄山岭铅锌尾矿废弃地白茅居
群遗传多样性 、香农指数和多态位点百分比最低 ,
分别为 0.199 7、 0.298 7和 57.55%。这说明铅锌
尾矿废弃地对白茅居群选择性最强 , 只有少量特殊
表 3　ISSR反应引物及扩增结果 1)
Tab.3　The ISSR prime rs and the ir sequences amp lification results
引物 序列(5’ - 3’ ) 总带数 片段大小 多态带 多态百分率
807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 12 300 -1200bp 10 83. 33%
808 AGAAGAGAGAGAGAGG 12 400 -1500bp 11 91. 66%
810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 17 250 -1700bp 17 100%
811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 18 200 -1600bp 15 83. 33%
815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 10 320 -1500bp 8 80%
825 ACACACACACACACACT 13 380 -1300p 12 92. 3%
826 ACACACACACACACACC 13 350 -1500bp 13 100%
836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 17 200 -1200bp 14 82. 35%
842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 13 200 -1100bp 12 92. 3%
864 ATGATGATGATGATGATG 13 400 -1300bp 11 84. 61%
1) Y=(C, T)
基因型的个体才能在铅锌尾矿废弃地正常 。这与野
外调查时 , 白茅居群只有小面积的分布结果相一致。
从整个白茅居群的遗传多样性来看 , 白茅具有
较高的遗传多样性 , 这可能是白茅具有对不良环境
较强适应能力 , 成为铜尾矿废弃地上优势物种的原
因。
表 4　6个白茅居群的遗传多样性变化 1)
Tab. 4　Genetic v ariab ility of six I. cy lindrica l populations
样地 Nei遗传多样性(H) 香农信息指数(I) 多态位点百分比 P(%)
HF 0. 2568(0. 1715) 0. 3935(0. 2390) 82. 01%
WGL 0. 2042(0. 1871) 0. 3147(0. 2632) 71. 22%
TGS 0. 2547(0. 1787) 0. 3888(0. 2471) 80. 58%
SZS 0. 2004(0. 1887) 0. 3085(0. 2653) 69. 06%
YS 0. 2433(0. 1970) 0. 3648(0. 2755) 74. 82%
HSL 0. 1997(0. 2012) 0. 2987(0. 2875) 57. 55%
M ean 0. 2265(0. 0279) 0. 3448(0. 0425) 72. 54%
To ta l 0. 3125(0. 0248) 0. 4721(0. 2039) 94. 96%
1)括号内为标准差(S .t Dev)
2.3　白茅居群遗传结构及遗传分化
根据总的遗传多样性 (Ht)和居群内遗传多
样性 (Hs) 计 算 出居 群 的 遗传 分 化水 平 。
POPOGENE软件分析结果表明 , 白茅居群间的遗
传分化系数 Gst为 0.2753。即在总的遗传变异中 ,
27.53%的遗传分化位于居群间 , 72.47%遗传分化
位于个 体 内。 AMOVA 分子 方 差分 析 发 现 ,
30.00%的遗传变异发生在居群间 (P <0.002),
70.00%遗传分化位于居群内。
89
中山大学学报 (自然科学版) 第 45卷　
表 5　白茅居群的 N ei遗传一致性和遗传距离 1)
Tab. 5　Ne i s gene tic identity and gene tic distance be tw een I. cy lindrica popula tions
居群代号 HF WGL TGS SZS YS HSL
HF **** 0. 8613 0. 8772 0. 8664 0. 8712 0. 8712
WGL 0. 1493 **** 0. 9087 0. 8190 0. 8759 0. 8742
TGS 0. 1310 0. 0957 **** 0. 8580 0. 8949 0. 8570
SZS 0. 1434 0. 1996 0. 1531 **** 0. 8658 0. 8338
YS 0. 1378 0. 1325 0. 1110 0. 1441 **** 0. 8713
HSL 0. 1379 0. 1345 0. 1543 0. 1818 0. 1377 ****
1)斜线右上方为各居群的遗传一致性 , 斜线左下为各居群之间的传距离
　　为了进一步说明白茅居群间的遗传关系 , 利用
POPOGENE软件计算出 6个白茅居群的遗传距离和
遗传一致度 , 结果见表 5所示 。从表 5可以看出 ,
黄山岭铅锌尾矿与狮子山铜尾矿白茅居群之间遗传
距离最大 , 达到 0.1818 , 而五公里白茅居群与铜官
山白茅居群之间的遗传距离最小。尾矿地金属类型
不同 , 居群间的遗传多样性差异不同 , 黄山岭铅锌
尾矿与其它尾矿之间差异较大 , 而铜尾矿之间居群
差异较小。根据居群间的遗传距离 , 利用 MEGE1.
1软件就 6个居群遗传距离进行聚类分析 , 得到树
状如图 1所示。
从图 1中可以看出 , 6个居群分为 3大组 , 铜
陵五公里 、 铜官山和安庆月山铜尾矿废弃地的 3个
居群聚成一组 , 对照组合肥居群和黄山岭铅锌尾矿
的居群聚成一组 。铜陵狮子山铜尾矿上的白茅单独
聚为一组。
图 1　白茅 6个居群的 Ne i遗传距离 UPGMA树状图
F ig. 1　UPGMA dend rogram of Ne i s distances
am ong I. Cy lindrica popu la tions
基于居群个体间的遗传距离 , 用 GenA lEx软件
对 6 个白茅居群 180 个样本进行 PCA 分析
(Principal coordina te ana ly sis), 其各个体的遗传距
离关系如图 2所示。从图 2可以看出 , 同一居群的
个体相互聚集在一起 , 不同居群之间遗传结构存在
分化。其中铜官山与月山两铜尾矿两居群个体遗传
分化较小 , 狮子山 、 铜官山黄山岭居群的遗传结构
分化较大。在主成分析图中 , 黄山岭居群有几个体
与合肥白茅居群个体之间距离较近 , 这可能与黄山
岭铅锌尾矿地上因白茅居群分布面积小 , 有些个体
采集于尾矿与正常土壤交错区的缘故 , 遗传结构分
化不明显所致。
图 2　白茅居群的主分量分析
F ig. 2　P rinciapl Coordina tes ananysis is o f
I.cy lindrica popu la tions
3　讨　论
白茅是一种多年生的阳生草本植物 , 具有地下
根状茎 , 能进行无性生殖和有性生殖 。白茅具抗
旱 、耐贫瘠的能力 , 是荒地 、 山坡等废弃地先锋植
物 , 有良好保持水土流失能力 , 在我国南方地区分
布广泛 [ 12] 。在群落的演替中 , 特别是不良的环境
条件下 , 白茅往往是群落的先锋种和建群种 。野外
调查发现 , 金属尾矿废弃地对植物的自然定居生长
产生严重的抑制作用。尾矿废弃地停放多年堆置 ,
仍然寸草不生 , 许多木本植物种子如马尾松 P inus
massoniana等在尾矿萌发后 , 很快死亡 。这与尾矿
废弃地金属含量高 , 营养元素如 N、 P、 K以及有
机质含量极低 , 表层不稳定 、 风浊 、 水浊严重 、 持
水肥能力差等因素制约因素有关。而白茅是铜尾矿
废弃地和铅锌尾矿废弃地自然定居物种之一 , 也是
铜尾矿和铅锌尾矿废弃地上定居的优势种 。白茅在
尾矿废弃地的入侵和定居 , 减轻了尾矿给周边地区
带来的环境污染 , 改善了基质的理化性质 , 同时为
新的物种在尾矿上定居提供了小环境 , 加速尾矿废
90
　第 4期 田胜尼等:用 ISSR分子标记检测不同尾矿废弃地白茅居群的遗传多样性
弃地植物群落的演替 。从我们的研究结果来看 , 白
茅可在尾矿废弃地定居 , 与其具有较高遗传多样性
有明显的关系 。G rant[ 13]认为一个物种的进化潜力
和抵制不良环境的能力取决于遗传达多样性水平的
高低。 Nybom和 Bartish[ 15]对一年生 , 短命多年生
及长命多年生的遗传多样性 (RAPD结果 )进行了
归纳 , 表明一年生草本植物的遗传多样性为
0.125, 短命多生年的草本植物为 0.207, 多年生草
本植物的遗传多样性为 0.242。本研究针对安徽地
区 6个白茅居群的遗传多样性发现 , 总的遗传多样
性为 0.312 5, 高于生活史相同的多年年生草本遗
传多样性的遗传水平 。对于任何一个物种来说 , 其
遗传多样性越丰富 , 对环境变化的适应能力就越
强 , 就越容易扩展其分布范围和开拓新的生存空
间 。在尾矿废弃地定居植物来说 , 物种应有较高的
遗传多样性 , 才能拓展到尾矿废弃等新的环境。在
金属尾矿废弃地上 , 植物自然定居受到抑制 , 这可
能与定居的物种本身遗传多样性的较低有关。因此
在尾矿废弃地复垦中 , 通过自然定居的物种调查和
遗传结构的研究 , 筛选一些遗传多样性高的物种用
于铜 、 铅锌尾矿废弃地复垦。
4　结　论
(1)白茅有较高的遗传多样性 , 总的遗传多
样性达到 0.312 5, 高于同类生活型的遗传多样性 ,
这可能是白茅分布广 , 能在铜尾矿和铅锌尾矿废弃
地定居的主要原因之一。
(2)由于尾矿环境的胁迫 , 定居尾矿废弃地
上的白茅居群的遗传多样性都发生下降 , 表现为铜
尾矿废弃地白茅居群均低于对照组 , 铅锌尾矿的白
茅居群遗传多样性最低。
(3)从聚类分析和主分量分析可以看出 , 在
不同金属尾矿废弃地环境条件下 , 白茅居群发生明
显的遗传分化。这一方面可能是生境对物种的选择
作用和物种在不环境条件胁迫下相互适应的结果。
通过研究 , 我们认为在尾矿废弃地复垦中 , 应
根据不同的金属类型的尾矿来选择合适的居群和物
种 , 以免造成事倍功半的效果 。
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Genetic D iversity of Impera ta cy lindrica Populations Colonizing on the
M etalTa ilingsW aste Lands by ISSR Techn ique
TIAN Sheng-ni1, 2 , WANG Zheng-feng1 , GAO San-hong3 , HAO Yan-ru1 , PENG Shao-lin1, 3
(1. South China Bo tanicalG arden, Ch inese Academy of Sciences, Guangdong Prov inca l
K ey Laboratory o fD ig ital Botanica lGa rden, Guangzhou 510650, Ch ina;
2. School of L ife Sciences, A nhuiAg ricultu ra lUniversity, He ife i 230036, China;
3. Schoo l o f L ife S ciences, Sun Y at-Sen Unive rsity, Guangzhou 510275 , China)
Abstract:The gene tic d iversities o f six I. cy lindrica populations we re determ ined by ISSR technique. The sample
ma terials w ere co llected in Anhui province from four different copper ta ilings, one lead - zinc tailing s w aste land
and the norma l so il far aw ay from m ine a reas. Out of 100 ISSR primers, 10 primers genera ted high ly rep roducib le
and stable DNA bands. U sing these primers, 139 discernib le DNA fragments we re produced fo r the 180 samp les o f
six I. cy lindrica popula tions. The number o f po lymorphic loci w as 132, and the percentage o f po lymorph ic loci
w as 94.96%. The result o f POPGENE ana ly sis indicated the w ho le gene tic diversity (Ht) of I. cy lindrica was
0.312 5, and the genetic diversity (Hs) among the popu lations w as 0.226 5. The gene tic diversity, Shannon
index and percentage o f polymorphic loci for the popula tion grow ing on the no rmal soilw ere higher than o ther five
popu lations on the meta l tailings w aste land. The resu lts of AMOVA and PCA ana lysis indicated genetic
diffe rentiation had taken place signally among the six populations co lonizing (φst =0.030, P <0.002). F rom the
resu lts of this stud ie s, the high genetic d iversity of I. cy lindricalmay contribu te to co lonize on the coppe r tailings
and lead - zinc ta ilings.
Key words:ISSR (In te r - simple sequence repea t);me tal tailings w aste land;Impera ta cylindrica l;genetic
dive rsity
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