全 文 ：Study on calcium homeostasis disorders of adriamycin resistant
human breast cancer cells MCF-7 /ADM and its mechanism
CAI Yan-fei，CHEN Yun，ZHU Rui-yu，MA Xin，YAO Xiao-qiang，JIN Jian
(Laboratory of Drug Design and Molecular Pharmacology，School of Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi Jiangsu 214122，China)
Abstract:Aim To investigate the calcium homeosta-
sis disorders of adriamycin-resistant human breast
cancer cells MCF-7 /ADM and its mechanism． Meth-
ods Detect the ( ［Ca2 +］)content of wild-type and
drug-resistant cells by the transformation of calcium in-
dicator plasmid GECO1. 2;Detect the expression of
transient receptor potential ion channel protein TRPC1，
TRPC3，TRPC4，TRPC5 and TRPC6 in these two cells
by Western blot;Suppress the TRPC5 activity with cal-
cium channel inhibitor 2-APB (100 μmol·L －1) ，and
then detect the( ［Ca2 +］)content in the drug-resistant
cells． Results The result shows that the significantly
up-regulation of( ［Ca2 +］)content in resistant cells，
and the TRPC5 protein shows over-expression，but the
( ［Ca2 +］)concentration became to decrease after the
inhibition of its activity． Conclusion Compared with
the wild-type cells，the calcium in resistant cells be-
came homeostasis disorder， maybe the underlying
mechanism is the up-regulation of TRPC5 caused
［Ca2 +］entry into the resistant cells． This study sug-
gests that there must be a close relationship between
calcium homeostasis disorders and the drug resistance
of cancer．
Key words:drug resistance;calcium homeostasis;TR-
PC5;P-gp;cancer;breast cancer
网络出版时间: 2013 － 5 － 28 14: 44 网络出版地址: http: / /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20130528． 1444． 028． html
虎耳草抗前列腺癌生物活性部位筛选研究
周 欣1，2，陈华国1，2，黄志金1，2，杨世林1，2，杨占南1，2
( 贵州师范大学 1．天然药物质量控制研究中心 2．山地环境环境保护重点实验室，贵州 贵阳 550001)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2013． 06． 028
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2013)06 － 0867 － 04
中国图书分类号:R282． 71;R284． 1;R329． 24;R737. 250. 531
摘要:目的 筛选虎耳草抗前列腺癌生物活性部位。方法
采用 MTT法研究虎耳草不同极性提取物对 PC-3 细胞的增
殖抑制作用，运用流式细胞法检测受试药对 PC-3 细胞周期
分布的影响以及凋亡情况，应用电镜观察 PC-3 细胞凋亡的
形态学特征，探讨抗前列腺癌作用机制。结果 虎耳草不同
提取部位对 PC-3 细胞的增殖均有一定抑制作用，随着药物
浓度和作用时间的增加而增强。结论 虎耳草乙醇提取后
乙酸乙酯萃取部位具有很好的抗前列腺癌活性。
收稿日期:2013 － 02 － 03，修回日期:2013 － 03 － 21
基金项目:贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目［黔科合
中药字(2010)5023 号］;贵州省科技创新人才团队建设项
目［黔科合人才团队(2011)4008］;贵阳市科学技术计划项
目［(2010)筑科合 同字第 1-中-23 号］;贵州省教育厅特色
重点实验室项目［黔科合 KY(2012)005 号］
作者简介:周 欣(1962 －) ，女，博士，教授，博士生导师，研究方向:
中药、民族药质量控制，中药指纹图谱以及中药新药研发，
通讯作者，Tel:0851-6702167，E-mail:alice9800@ sina． com
关键词:虎耳草;前列腺癌;活性部位;MTT 法;PC-3 细胞;筛
选
前列腺癌是男性生殖系最常见的恶性肿瘤［1］，
在西方国家，该病发病率在男性恶性肿瘤患者中居
第 2 位，东方人发病率通常较低，但近年来由于人口
老龄化，我国前列腺癌发病率却呈明显上升趋
势［2］。前列腺癌病因尚不清楚，尚无法实现一级或
二级预防［3］。目前前列腺癌治疗大多采用激素类
药物，治疗效果有限，且价格昂贵［4 － 5］，市场上迫切
需要疗效确切，价格低廉的治疗性药物。天然产物
是药物研发中极具潜力的原料资源［6］，从天然产物
中研究并获取抗癌活性成分是现代研究的大趋势之
一［7 － 8］，本文对虎耳草(Saxifraga stolonifera (L)
Meerb)这一贵州特色苗药材进行抗前列腺癌活性
研究，为抗前列腺癌的治疗性药物研发提供科学依
据。
1 材料与方法
1． 1 药品与试剂 PC-3 人前列腺癌细胞，购于中
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国科学院上海细胞库;RPMI 1640 培养基，购于美国
HYCLONE公司;胎牛血清，购于杭州四季青生物工
程材料有限公司;碘化丙啶、二甲基亚砜、Rnase 酶、
胰蛋白酶、台盼蓝染色液，购于美国 Sigma 公司;双
抗 (青霉素和链霉素)、MTT (四甲基偶氮唑盐) ，
购于美国 AMRESCO 公司。虎耳草石油醚提取物、
水提取物、乙醇提取物和乙醇提取后乙酸乙酯萃取
物均为实验室自备。
1． 2 PC-3 细胞培养 PC-3 细胞用 RPMI 1640 培
养基培养，内含 15%新生小牛血清、1 × 105 U·L －1
青霉素、1 × 105 U·L －1链霉素、10 mg·L －1氧化考
的松以及 0. 01 U /ml 胰岛素。置 37℃、5% CO2 培
养箱中培养。
1． 3 MTT 法检测虎耳草提取物对 PC-3 细胞的生
长抑制作用 取对数生长期 PC-3 细胞于 96 孔培养
板中培养 24 h，待细胞贴壁后，分别加入不同体积试
药溶液。培养板中取 6 孔作为空白调零组，仅加入
RPMI 1640 细胞培养液;另取 6 孔为对照组，每孔加
入 0. 2 ml RPMI 1640 细胞培养液。继续培养 48、72
h后各取出 1 块培养板，每孔加入 MTT 20 μl。继续
培养 4 h后，吸弃旧培养液，每孔加入 150 μl DMSO，
放入 CO2 培养箱中 10 min 后，在酶标仪 490 nm 下
测定每孔吸光度 OD值，计算生长抑制率。
1． 4 倒置显微镜观察细胞形态 取对数生长期的
PC-3 细胞，用 0. 25%胰蛋白酶将其消化成单细胞悬
液。调节细胞浓度为 5 × 107个·L －1接种于 24 孔板
中，各孔 1 ml。于培养箱中培养 24 h 后，每 3 孔为
一组，分别加入不同体积试药溶液，用 RPMI 1640 细
胞培养液补至终体积一致，使其终浓度达到所需浓
度。取其中 3 孔为对照组，每孔仅加入 1 ml细胞悬
液，继续培养。在继续培养 48、72 h 后，分别取出细
胞培养板，在倒置显微镜下观察细胞状态。
1． 5 细胞周期检测 取对数生长期 PC-3 细胞接种
于 24 孔板，每孔 1 ml，培养 24 h 后，分别加入不同
体积试药溶液，取 3 孔为对照组，不加试药。继续培
养 72 h 后，取出细胞培养板，胰酶消化，离心，收集
细胞，用 PBS 溶液洗涤 2 次，离心去上清液，加入预
冷的 70%的乙醇，固定 2 h 以上;取出，加 PBS 溶液
洗涤 2 次，离心去上清液，加入 Rnase 酶，37℃孵育
30 min，最后加入 PI染液避光染色 30 min，200 目尼
龙网滤过。用流式细胞仪进行 DNA倍性分析，单光
束，激发波长为 488 nm。采集数据，用 Multicycle 分
析软件进行细胞周期的分析，分别计算 G0 /G1 期、S
期和 G2 期的细胞分布百分率。
1． 6 统计学处理 结果数据以 珋x ± s 表示，采用
SPSS 18. 0 软件进行统计分析。
2 结果
2． 1 虎耳草提取物对 PC-3 细胞的生长抑制作用
虎耳草不同提取部位对 PC-3 细胞均有一定的抑
制作用，但不同提取部位之间有明显差别。如 Tab 1
所示，水提和醇提部位在作用 72 h 后，具有明显的
抑制 PC-3 细胞生长作用。通过 IC50分析软件计算
得到水提物作用 72 h的 IC50为 1. 317 g·L
－1，而醇
提物作用 72 h后 IC50为 0. 980 g·L
－1，效果较水提
部位好;石油醚部位，达到 1. 5 g·L －1后虽然对 PC-
3 细胞也有抑制作用，但在高浓度下，可能已不是药
物本身的作用，所以不做考虑。乙醇提取物的 IC50
较高可能由于粗提物中成分复杂，有效成分的含量
较低。进一步考察醇提乙酸乙酯萃取部位，结果显
示:48 h 和 72 h 其 IC50分别为 872 mg·L
－1和 390
mg·L －1，提示乙酸乙酯萃取部位，对 PC-3 细胞的
生长有明显的抑制作用。
Tab 1 Inhibitory effect on the growth of prostate cancer cell
Group
Concentration /
g·L －1
After 48 h
Inhibition ratio /%
After 72 h
Inhibition ratio /%
Control 0． 00 － －
0． 50 3． 41 ± 0． 01 3． 07 ± 0． 02
Petroleum ether extract 1． 00 10． 31 ± 0． 02 12． 58 ± 0． 05
1． 50 19． 68 ± 0． 01* 32． 73 ± 0． 12
0． 50 12． 59 ± 1． 02 25． 55 ± 0． 89
Water extract 1． 00 18． 73 ± 2． 96* 42． 97 ± 3． 01
1． 50 33． 59 ± 2． 90* 53． 26 ± 2． 87
0． 50 14． 67 ± 3． 19 39． 11 ± 2． 56
Ethanol extract 1． 00 31． 09 ± 0． 59* 48． 64 ± 1． 42
1． 50 36． 93 ± 0． 21* 58． 42 ± 0． 68
0． 25 26． 21 ± 3． 53* 33． 45 ± 2． 11
Ethyl acetate extract 0． 50 40． 41 ± 4． 34* 65． 69 ± 3． 55
1． 00 52． 01 ± 0． 01＊＊ 70． 89 ± 0． 34
* P ＜0. 05，＊＊P ＜0. 01 vs control
2． 2 细胞形态观察 从 Fig 1 可见试药处理过后，
部分细胞由梭形分支状收缩变圆;给药后 48 h，水
提、醇提和乙酸乙酯萃取组细胞形态均发生明显改
变，细胞多呈类圆形，少数呈梭形，细胞周缘毛糙不
规则，胞质中颗粒较多，贴壁能力明显下降，各组均
出现悬浮细胞;而给药后 72 h，水提、醇提和乙酸乙
酯萃取组大部分细胞均呈圆形，胞质中颗粒也明显
增多，可看到有细胞碎片存在，细胞轮廓模糊，折光
率明显下降;而对照组细胞贴壁较牢，多呈梭形分支
状，胞质中颗粒很少，大量细胞收缩呈圆形，贴壁细
胞明显减少。随着试药浓度的增加，对细胞的毒性
也相应变大。
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Fig 1 PC-3 cell morphology diagram
2． 3 细胞周期分布 从 Fig 2 和 3 可以看出，虎耳
草醇提 －乙酸乙酯萃取物作用后 PC-3 细胞的周期
分布图中在 G1 期峰前出现一个亚二倍体峰凋亡峰，
峰 1 为 Apoptosis峰即凋亡峰，而其他提取部位，未
发现明显的凋亡峰。推断乙酸乙酯萃取部位可能有
一定的诱导 PC-3 细胞凋亡的作用，数据结果见 Tab
2 和 3。而从 Fig 4 可以清楚看到，经药物处理 48 h
和 72 h后，PC-3 细胞的各周期细胞分布发生了一定
的变化:与对照组相比，给药组 G0 /G1 期细胞分布
明显增加，而 S 期和 G2 /M 期细胞所占比例总和逐
渐减少。可以推断试药能使细胞的生长阻滞在 G0 /
G1 期，通过改变 PC-3 细胞周期，阻止细胞有丝分
裂，从而起到抑制其增殖的作用。
Fig 2 Forty-eight hours cycle pattern for PC-3 cells
1:hypodiplorid peak
Fig 3 Seventy-two hours cycle pattern for PC-3 cells
1:Hypodiploid peak
Fig 4 Different cell cycle distribution proportion for PC-3 cells
A:After 48 h;B:After 72 h
Tab 2 Different extracted parts for the
PC-3 cell cycle impact (After 48 h)
Group
Concentration /
g·L － 1
Cell cycle distribution /%
G0 /G1 S G2 /M
Control 0． 0 49． 57 ± 0． 88 45． 38 ± 1． 24 5． 05 ± 0． 37
Water extract 1． 0 67． 54 ± 2． 26 28． 11 ± 5． 13 5． 96 ± 2． 86
Ethanol extract 1． 0 66． 74 ± 1． 00 25． 29 ± 0． 70 8． 68 ± 1． 70
Ethyl acetate extract 0． 5 60． 97 ± 2． 23 36． 20 ± 2． 61 2． 84 ± 0． 37
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Tab 3 Different extracted parts for the
PC-3 cell cycle impact (After 72h)
Group
Concentration /
g·L － 1
Cell cycle distribution /%
G0 /G1 S G2 /M
Control 0． 0 61． 67 ± 0． 98 37． 22 ± 2． 55 1． 11 ± 1． 57
Water extract 0． 5 73． 23 ± 1． 75 22． 47 ± 3． 01 3． 64 ± 2． 15
1． 0 78． 44 ± 0． 34 16． 23 ± 2． 45 5． 33 ± 2． 11
Ethanol extract 0． 5 75． 23 ± 0． 32 19． 62 ± 1． 16 5． 14 ± 0． 97
1． 0 78． 94 ± 1． 68 16． 27 ± 1． 60 4． 79 ± 1． 76
Ethyl acetate extract 0． 5 79． 85 ± 2． 48 16． 60 ± 4． 16 3． 55 ± 2． 82
1． 0 87． 23 ± 2． 60 12． 53 ± 2． 31 0． 25 ± 0． 29
3 讨论
本文通过虎耳草不同提取部位对体外 PC-3 细
胞的增殖抑制研究，发现乙醇提取 －乙酸乙酯萃取
部位对 PC-3 细胞的抑制作用较明显，而乙醇提取和
水提部位次之，石油醚只有在高浓度时才有微弱作
用。因此，将乙醇提取 －乙酸乙酯萃取部位确定为
抗前列腺癌活性部位。
给药组 PC-3 细胞在 G0 /G1 期的细胞分布比例
有所增加，有一定的浓度依赖关系;给药后 72 h 趋
势较明显。而 S 期的细胞分布明显减少，阻断了
PC-3 细胞 DNA的合成;综合上述，可以推断试药改
变 PC-3 细胞的周期分布，很可能就是其抑制 PC-3
细胞增殖作用的机制之一。
虎耳草乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物可以通过
影响细胞周期发生变化和直接作用细胞表面，破坏
细胞形态，从而起到抑制细胞增殖的作用。故可对
其有效部位进行化学成分的分离研究，为虎耳草抗
前列腺癌活性的进一步研究提供物质基础，进而探
讨和发现虎耳草中有效的抗前列腺癌药效成分。
( 致谢:感谢贵阳中医学院杨长福博士对本研
究提供的宝贵支持和帮助! )
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Screening of anti-prostate-tumor parts from Saxifraga stolonifera
ZHOU Xin1，2，CHEN Hua-guo1，2，HUANG Zhi-jin1，2，YANG Shi-lin1，2，YANG Zhan-nan1，2
(1． Research Center for Quality Control of Natural Medicine;2． Key Laboratory for Information
System of Mountainous Areas and Protection of Ecological Environment，Guizhou Normal
University，Guiyang 550001，China)
Abstract:Aim To screen the anti-prostate-tumor
parts from Saxifraga stolonifera． Methods MTT assay
was used to detect anti-prostate-tumor activity of each
extraction． The cell ratio in the different stages of the
cell cycle and apoptotic ratio of PC-3 cells were detec-
ted by flow cytometry(FCM)． Electron microscopy was
used to observe the morphological features of PC-3 ap-
optosis． Results Different extract fractions had cer-
tain inhibition on the proliferation of PC-3 cells． The
effect was enhanced with the increase in drug concen-
tration and time． Conclusion Ethanol extracted with
ethyl acetate extract has good anti-prostate -tumor ac-
tivity．
Key words:Saxifraga stolonifera;prostate-tumor;ac-
tivity parts;MTT Method;PC-3 cell;screen
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