全 文 ：云南川百合 DALP 遗传变异分析
吴 刚1,2, 虞 泓2, 梁淑云1, 杨逢春1, 李永谊3, 毛 钧2
(1.中国热带农业科学院香料饮料研究所，海南 万宁 571533；2.云南大学生命科学院,云南 昆明 650091；
3.云南英茂生物技术实验室，云南 昆明 650106 )
摘 要：采用 DALP 分子标记技术，对 10 个川百合居群进行 DNA 指纹检测, 结果筛选出 5 个引物组合，扩增后共产生
192 条 DNA 基因片段，其中 178 条谱带具有遗传多态性，占 92.71%; 10 个居群的总等位基因数（Na）为 1.9271、平均为
1.0823，总有效等位基因数（Ne）为 1.4430、平均 1.0533， 基因多样性指数（H）为 0.2673、平均 0.0303， 总 Shannon 多样性指
数（I）为 0.4105、平均为 0.0447，基因分化系数（Gst）为 0.8874，即遗传变异有 88.74%发生在居群间、有 11.26%发生在居群
内，表明川百合居群间存在较大的遗传分化。 此外，昆明市西山的川百合野生居群（DC）的遗传多样性明显高于栽培居群，
这与川百合栽培品种长期人工驯化有直接关系。 同时野生居群受到人为活动干扰严重。 研究结果表明，DALP 分析可为川
百合遗传育种的可持续利用提供理论依据。
关键词：川百合； 居群； DALP； 遗传多样性
中图分类号：S644.1 文献标识码: A 文章编号:1004-874X(2009)07-0052-04
Study on the genetic variation of DALP
in Lilium davidii Duchartre
WU Gang1,2, YU Hong2, LIANG Shu-Yun1, YANG Feng-chun1, LI Yong-Yi3, MAO Jun2
(1. Spice and Beverage Research Institute,CATAS, Wanning 571533,China; 2. College of Life Science, Yunnan University,
Kunming 650091，China; 3. Inmol Laboratory of Biotechnology of Yunnan, Kunming 650106, China)
Abstract：DALP(Direct amplification of length polymorphism)was applied to detect genetic polymorphism of 10 populations
of Lilium davidii Duchartre.Five primer groups were screened, and a total of 192 DNA fragments were amplified, among which
178 were polymorphic, i.e. the percentage of polymorphic bands (PPB) was 92.71%. The total observed number of alleles (Na)
was1.9271 and the average Na was1.0823; the total effective number of alleles (Ne) was 1.4430 and the average Ne was 1.0533;
the total Nei’s gene diversity(H) was 0.2673 and the average H was0.0303; the total Shannons Information index (I) was 0.4105
and the average I was 0.0447. The coefficient of gene differentiation (Gst) was 0.8874 between populations, namely 88.74%
genetic variation occurring between populations and rest 11.26% within population,the result indicated that L. davidii had much
larger genetic differentiation among populations.The genetic diversity of population in Xishan Kunming (DC)was evidently higher
than that planting populations, this was directly related to the long acclimation of L. davidii by artificial culture, and wild
populations were severely interfered by human activities. DALP analysis provides this species with molecule evidence for the
sustainable exploitation of genetic breeding.
Key words：Lilium davidii Duchartre；population；DALP；genetic diversity
收稿日期：2009 -03-12
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30160073)；国家科技基
础条件平台项目（2005DKA21000-5-09）
作者简介：吴刚（1981-），男，硕士，研究实习员，E-mail：wugang
0225@sina.com
川百合 （LiLium davidii Duchartre） 为百合科
(Liliaceae)百合属（Lilium）卷瓣组多年生草本植物，在我
国主要产于四川、云南、陕西、甘肃、河南等省，生长在海
拔 850～3 200 m的山坡草地和林下潮湿处[1]。百合鳞茎
富含淀粉、营养丰富、菜中珍品，有润肺止咳、补脾健胃、
清热解毒、解无名肿毒等功效，特别是含有少量的秋水
仙碱等生物碱，具有抗癌作用，是一种理想的滋补佳品。
云南、 四川等地的农民有长期引种栽培川百合的历史，
其鳞茎食用和入药膳，其花观赏，有较高的经济价值［2］，
云南的食用百合以川百合为主。近年来，我国对川百合
的生殖生物学、核型染色体、组织培养、矿质元素含量等
方面进行了一些研究，但至今仍未见关于川百合居群遗
传多样性及其遗传结构研究的报道。
DALP（Direct amplification of length polymorphisms）
是 1998年法国科学家 Desmarais基于 AP－PCR发展起
广东农业科学 2009 年第 7 期52
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2009.07.046
引种来源
栽培种
栽培种
野生种
栽培种
栽培种
栽培种
栽培种
栽培种
栽培种
野生种
海拔高度(m)
1650
1850
2100
1900
1800
2100
2300
2800
1800
3300
生境
农田
农田
石灰岩草丛
农田
农田
农田
农田
农田
农田
草丛、悬崖边
原分布地
宜良县城郊
鹤庆县松桂乡
昆明市西山
鹤庆县金墩乡
宣威县来宾镇
丽江市古城区
淮西县塔城乡
丽江市巨甸镇
腾冲县城郊
宾川县鸡足山
居群编号
DD
DA
DC
DE
DF
DG
DI
DJ
DK
DL
表 1 供试川百合来源情况
来的一种用于检测基因多态性的新方法，该法巧妙地利
用了引物 M13 的序列特性并且出现多个位点 [3]。由于
DALP 法具有操作简单、扩增片段可直接测序的优点，
而且其引物序列比 RAPD引物长 7～10个碱基和采用了
双引物使得 DALP标记具有更高的重复性和稳定性，因
而在物种鉴定、 遗传多样性分析和系统进化等研究领域
中得到广泛的应用[4-8]。本研究对川百合的 10 个居群进
行了 DALP检测， 旨在为川百合的引种栽培、 遗传分
化、 亲缘关系以及野生资源保护利用等研究提供生物
分子学方面的依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试 10 个居群的川百合样本均种植在云南省昆
明英茂生物技术实验室川百合保育基地 (海拔 2 100
m)，各居群的原生地及引种来源见表 1。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA的提取 基因组 DNA 提取采用改良后的
CTAB 法 [9]。每株取 0.5 g 新鲜的叶片，提取的 DNA 用
琼脂糖凝胶电泳检测、λDNA 标定， 利用 Kodak Image
Station 440 CF 凝胶成像分析系统分析并标定到 20
ng/μL 备用。
1.2.2 PCR扩增条件 使用 PE9700扩增仪进行 PCR
反应（美国 PE 公司） 。扩增反应体系(20 μL): ddH2O
2.5 μL，10×Buffer 2.0 μL，Mg2+（25 mmol/L）2.5 μL，
dNTPs(0.25 mmol/L， 由上海生工公司分装 )2.0 μL，
0.5U Taq 酶 (Shanghai Promega)5.0 μL； 选择性引物
(5 pmol/L， 由上海生工公司合成) 3 μL， 反向引物(5
pmol/L， 由上海生工公司合成 ) 1 μL， 模板 DNA 2
μL，石蜡油半滴。扩增 40 个循环：95℃预变性 5 min，
94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，12 个
循环 ；94℃变性 30 s，50℃退火 30 s, 72℃延伸 0.5
min，28 个循环。最后, 于 72℃下延伸 10 min, 完成整
个 PCR反应。DALP－PCR扩增用等体积去离子 H2O 代
替 DNA 模板作为阴性对照。
1.2.3 引物组合筛选 检测前先进行预备试验， 以 2
份 DNA 样品分别与 12 对引物进行反应， 选出 5 对能
获得清晰条带、 反应稳定和图谱丰富的引物：P233 和
PR2、P234 和 PR2、P235 和 PR2、P242 和 PR2、P243 和
PR2。各引物的序列如下：
P233：GTTTTCCCAGTCACGACACG
P234：GTTTTCCCAGTCACGACCAG
P235：GTTTTCCCAGTCACGACCAC
P242：GTTTTCCCAGTCACGACCTAG
P243：GTTTTCCCAGTCACGACTCGA
PR2： AACAGCTATGACCATGA
1.2.4 扩增产物检测 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电
泳检测：以 1×TBE 作缓冲液，EB 染色，于 Kodak Image
Station凝胶成像系统下检测 DALP 带型， 最后进行聚
丙烯酰胺凝胶电泳及银染。
1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶制备、电泳、银染显色 凝胶制
备、电泳、银染显色,参照王海英等［7］和汤洪敏等 ［8］的方
法进行，电泳条件：Bio-Rad垂直电泳仪（美国 Bio-Rad
公司）800 V、150 min 。
1.3 数据处理 根据 DALP 指纹图谱 (图 1)中 Mark
的分子量标准估计扩增条带的分子量， 每个川百合居
群 DNA 样品的扩增带按有或无记录，“有” 赋值为 1，
“无”赋值为 0，得到原始数据表征矩阵，弱带及重复性
不好的条带不予统计。 利用 PopGene软件计算各川百
合居群 DNA 基因的多态位点百分率（PPB）、Shannon
多样性指数（I）、观察记录等位基因数（Na）、有效等位
基因数（Ne）、Nei’s 基因多样性指数（H）、总基因多样
引物 P243-PR2 引物 P233-PR2 引物 P242-PR2
图 1 川百合居群的 DALP 指纹图谱
53
DL
0.7281
0.6608
0.7193
0.6347
0.6774
0.7079
0.7193
0.7528
0.7001
DK
0.6963
0.6488
0.7053
0.6260
0.6724
0.7011
0.8476
0.8758
0.3565
DJ
0.7474
0.7003
0.7199
0.6784
0.6868
0.7689
0.8728
0.1326
0.2840
DI
0.7258
0.7016
0.7265
0.6933
0.7272
0.7765
0.1361
0.1653
0.3295
DG
0.6901
0.8048
0.7199
0.8188
0.7557
0.2529
0.2628
0.3552
0.3455
DF
0.8487
0.7204
0.7205
0.6619
0.2801
0.3186
0.3757
0.3970
0.3895
DE
0.6460
0.8751
0.7040
0.4127
0.1999
0.3663
0.3879
0.4685
0.4546
DC
0.7438
0.7177
0.3510
0.3278
0.3287
0.3195
0.3287
0.3491
0.3295
DA
0.7381
0.3317
0.1334
0.3280
0.2171
0.3544
0.3563
0.4326
0.4143
DD
0.3036
0.2959
0.4370
0.1640
0.3709
0.3205
0.2911
0.3620
0.3173
居群编号
DD
DA
DC
DE
DF
DG
DI
DJ
DK
DL
表 3 川百合遗传一致度和遗传距离统计分析结果
性（Ht）、居群内基因多样性（Hs）和居群间基因分化系
数（Gst）等相关指标，并根据居群间基因分化系数计算
居群每代迁移系数 （Nm）， 最后进行 UPGMA 聚类分
析。居群每代迁移系数（Nm）按以下公式计算：Nm=0.5
(1－Gst)/Gst。
2 结果与分析
2.1 川百合居群的遗传多样性
本试验采用 5 对 DALP 引物对川百合 10 个居群
的 DNA基因提取物进行扩增， 获得 192 条清晰条带，
平均每对引物扩增的条带数为 38.4 条；在 192 条条带
中有 178 条为多态条带， 平均每对引物扩增得到的多
态条带数为 35.6 条。各栽培居群多态条带比率均较低
（0.52%～9.38%），野生居群 DL 也显示了较低的多态条
带比率， 缘由供试 6 个样本采集距离较近 （10 m2以
内），野生居群 DC 显示了较高的遗传多样性。基于基
因频率矩阵，利用平均观察等位基因数（Na）、平均有效
等位基因数（Ne）和 Nei’s 基因多样性指数（H）对川百
合的遗传多样性进行评价， 得出与 Shannon 多样性指
数（I）分析一致的结果（表 2）。
2.2 川百合居群的遗传分化
遗传分化相关指标分析结果(表 3)显示，川百合的
总基因多样性指数 (Ht) 为 0.2691， 居群内多样性指数
I
0.0309
0.0500
0.2623
0.0101
0.0034
0.0023
0.0034
0.0515
0.0221
0.0111
0.0447
0.4105
H
0.0219
0.0334
0.1766
0.0071
0.0024
0.0014
0.0024
0.0351
0.0152
0.0074
0.0303
0.2673
Ne
1.0417
1.0558
1.3104
1.0130
1.0045
1.0020
1.0045
1.0618
1.0262
1.0130
1.0533
1.4430
Na
1.0469
1.0938
1.5052
1.0156
1.0052
1.0052
1.0052
1.0885
1.0365
1.0208
1.0823
1.9271
PPB
（%）
4.69
9.38
50.52
1.56
0.52
0.52
0.52
8.85
3.65
2.08
8.23
92.71
多态条带
数（条）
9
18
97
3
1
1
1
17
7
4
15.8
178
样本
数（个）
10
10
10
10
10
10
10
10
9
6
9.5
95
居群编号
DD
DA
DC
DE
DF
DG
DI
DJ
DK
DL
平均
总计
表 3 供试川百合居群的 DALP 遗传多样性分析结果
注：PPB 代表多态条带比率、Na 代表总等位基因数、Ne 代表
总有效等位基因数 、H 代表 Nei’s 基因多样性指数 、I 代表总
Shannon 多样性指数。
（Hs）为 0.0303，居群间基因分化系数（Gst）为 0.8874，说
明供试的 10个川百合居群存在较大的遗传分化， 川百
合有 88.74%的遗传变异来自居群之间、11.26%来自居
群内，居群间的分化极其显著。根据川百合居群间基因
分化系数（Gst）测定值计算居群每代迁移系数（Nm），结
果显示川百合居群每代迁移系数为 0.0634，当（Nm<1）
时，有限的基因流会加大居群之间的遗传分化。
2.3 川百合居群的遗传关系
川百合 10 个居群的遗传一致度和遗传距离分析
结果见表 3。从表 3 可以看出，在川百合 10 个居群中，
遗传一致度最大的为 DJ 和 DK 居群， 遗传一致度为
0.8758，其次是 DA和 DE居群间的 0.8751。
从供试川百合居群遗传距离的 UPGMA 聚类图
（图 2）可以看出，栽培居群 DD 和 DF 先聚为一类，再
和野生居群 DC 聚为另一小类， 显示了较近的亲缘关
系； 野生居群 DL 和栽培居群 DI、DJ、DK 聚为另一小
类；另外，DA 和 DE 先聚为一类，亲缘关系较近，再和
DG居群聚为另一小类。
3 结论与讨论
基于 5 对引物的 DALP 分析结果表明， 昆明市西
山上分布的川百合野生居群 DC 的多态条带比率
54
注：图中对角线上半部为遗传一致度，下半部为遗传距离。
图 2 供试川百合居群的 UPGMA 聚类图
（50.52%） 明显高于其他栽培居群的多态条带比率
（0.52%～9.38%），野生居群 DL 由于 6 个样本的采集距
离较近 ，显现几乎相同的特征条带，可能出自 1 个母
系。由于长期的人工栽培和人工选择，川百合栽培居群
和栽培变种的有性生殖几乎完全丧失， 只开花不结
实[2]，主要以鳞茎进行无性繁殖，人为降低了栽培居群的
遗传多样性。在本研究中，供试的 DF、DG、DI 等栽培居
群内的 10 个川百合样本 都显示出相似的特征带型。
据多年调查研究，川百合野生居群有性生殖正常，能开
花结实，种子萌发率高达 90%以上，而栽培品种或居群
和野生居群杂交能结实，种子苗生长正常。在本研究中，
昆明市西山和大理市宾川鸡足山的野生川百合分布地
被开发为旅游区， 人为破坏和干扰严重，2个居群的生
境完全退缩至石灰岩缝和悬崖边陡峭处而处于濒危状
态。本研究结果还表明，野生居群遗传多样性丰富，是栽
培川百合遗传育种重要的野生外源种质基因。
植物的分配系统和繁殖方式是影响居群生物学最
重要的因素。 植物居群中只要有少量的异花传粉就能
阻止居群出现分化 [10]。当居群基因流即每代迁移系数
（Nm）较小（Nm<1）时，有限的基因流会加大居群之间
的遗传分化。因此，往往当 Nm 减小时，居群间基因分
化系数（Gst）就会升高。本研究结果显示，川百合居群
每代迁移数仅为 0.0634， 而居群基因分化系数达到
0.8874，表明川百合居群间分化剧烈，居群之间的基因
交流受到较大的阻碍， 其原因是栽培居群长期靠鳞茎
无性生殖，有性生殖丧失或减弱的结果，而本研究供试
的栽培居群较多可能也是造成 Nm较低的原因之一。
本研究的聚类分析结果表明，川百合野生居群 DC
和栽培居群 DD、DF 聚为一小类，野生居群 DL 和栽培
居群 DI、DJ、DK 聚为一小类显示了较近的亲缘关系，
其中 DC、DD、DF居群分布于滇东至滇中地区，DL、DI、
DJ、DK 居群分布于滇西北地区，表明这 2 个区域某些
地方种植的川百合可能起源于当地农民长期采集野生
川百合栽培驯化的结果 。
本研究结果还表明， 川百合在物种水平上具有丰
富的遗传多样性和进化潜力， 但在居群水平上川百合
栽培种出现遗传多样性较低的情况， 由于长期靠鳞茎
进行无性繁殖和人工选择， 使其遗传结构和遗传多样
性的丰富度受到严重威胁。 野生资源在育种中一般具
有许多优良性状，如耐冷、耐旱、抗病虫害和有独特品
质等， 拥有和掌握的农作物野生种及其野生近缘种的
种质资源越多，培育出优良新品种的潜力就越大，川百
合遗传育种也不例外。 本研究供试的野生居群具有丰
富的遗传多样性，但人为破坏和干扰严重，野外调查还
发现，在滇西北野生川百合已作为特色菜大量推介，同
时也存在直接采挖野生川百合出售的现象， 这对野生
资源造成了一定的破坏， 因此对川百合的保护迫在眉
睫，对其生长的地方，可以通过制定法规条例来增进和
提高民众保护资源的意识， 禁止人为破坏等措施进行
保护，而对一些破坏地残留的居群，要恢复和加强居群
的生活力，才能有效地保留现有野生川百合资源，这也
是持续利用遗传资源的前提和基础。
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55