全 文 ：植物资源与环境学报 2012，21(1) :42－46
Journal of Plant Resources and Environment
基于 SSR标记的 8 个山荆子
居群遗传多样性和遗传关系分析
王雷宏1，郑玉红2，汤庚国3
〔1． 安徽农业大学林学与园林学院，安徽 合肥 230036;2． 江苏省·中国科学院植物研究所(南京中山植物园) ，江苏 南京 210014;
3． 南京林业大学森林资源与环境学院，江苏 南京 210037〕
摘要:采用 10 对 SSR引物对 8 个山荆子〔Malus baccata (L．)Borkh．〕居群 140 个单株的基因组总 DNA进行 PCR扩
增，并据此对 8 个居群的遗传多样性和遗传关系进行了分析。结果表明:用 10 对 SSR引物共扩增出 91 条带，多态
性条带百分率达 100． 00%。8 个居群的遗传多样性参数差异较大，有效等位基因数为 1． 437 9 ～ 1． 535 0，Nei’s基
因多样性指数为 0． 256 0 ～ 0． 309 2，Shannon信息指数为 0． 376 7 ～ 0． 459 2，多态性条带百分率为 64． 84% ～
85． 71%。居群间的有效等位基因数为 1． 616 9，Nei’s基因多样性指数为 0． 355 1，Shannon信息指数为 0． 528 5，均
明显高于居群内;8 个居群间的基因流为 1． 739 5，基因分化系数为 0． 223 3，显示居群间的基因交换较多。UPGMA
聚类分析结果表明:在 Nei’s遗传距离 0． 148 6 处，8 个居群被分为 3 组，河北塞罕坝居群单独为一组，山西五台山
居群和北京东灵山居群为一组，其余 5 个居群为一组。据此推测:山荆子起源于中国华北和东北地区，山西灵空
山、黑龙江小兴安岭、吉林长白山和山西中条山居群可能是其遗传多样性的核心居群。
关键词:山荆子;居群;遗传多样性;遗传关系;SSR标记;聚类分析
中图分类号:Q946－33;S661． 9 文献标志码:A 文章编号:1674－7895(2012)01－0042－05
Analyses of genetic diversity and genetic relationship of eight populations of Malus baccata based
on SSR marker WANG Lei-hong1，ZHENG Yu-hong2，TANG Geng-guo3 (1． School of Forestry and
Landscape of Architecture，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China;2． Institute of Botany，
Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China;3． College of Forest
Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China) ，J． Plant Resour． ＆
Environ． 2012，21(1) :42－46
Abstract:PCR amplification of total genomic DNA from 140 individuals of eight populations of Malus
baccata (L．)Borkh． was carried out by using ten pairs of SSR primers，and hereby，their genetic
diversity and genetic relationship were analyzed． The results show that there are totally 91 bands
amplified by ten pairs of SSR primers and percentage of polymorphic band is 100． 00% ． The difference of
genetic diversity parameters of eight populations is great， and effective number of allele is 1． 437 9－
1． 535 0，Nei’s gene diversity index is 0． 256 0－0． 309 2， Shannon information index is 0． 376 7－
0． 459 2，percentage of polymorphic band is 64． 84% －85． 71% ． The effective number of allele，Nei’s
gene diversity index and Shannon information index among eight populations are 1． 616 9，0． 355 1 and
0． 528 5，respectively，which is obviously higher than those within population． The gene flow and gene
differentiation coefficient of eight populations are 1． 739 5 and 0． 223 3，respectively，indicating that the
gene exchange among populations is more． The result of UPGMA cluster analysis shows that eight
populations of M． baccata are divided into three groups where Nei’s genetic distance is 0． 148 6． In
which，the population in Saihanba of Hebei Province is a group individually，two populations in Mt．
Wutai of Shanxi Province and Mt． Dongling of Beijing City are a group，the other five populations are a
group． Based on these results，it is presumed that M． baccata is originated from the North and Northeast
of China，M． baccata populations in Mt． Lingkong of Shanxi Province，Xiaoxing’anling of Heilongjiang
收稿日期:2011－01－19
基金项目:安徽省自然科学基金资助项目(10040606Q18)
作者简介:王雷宏(1977—) ，男，山西五台人，博士，讲师，主要从事树木学教学与科研工作。
Province，Mt． Changbai of Jilin Province and Mt． Zhongtiao of Shanxi Province may be core populations
of genetic diversity．
Key words:Malus baccata (L．)Borkh．;population;genetic diversity;genetic relationship;SSR
marker;cluster analysis
山荆子〔Malus baccata (L．)Borkh．〕是苹果属
(Malus Mill．)脱萼组 (Sect． Gymnomeles Koehne)种类
中分布范围最广的一个种，集中分布于中国，为东亚
分布型，是典型的多型性发达种［1］。山荆子生长速
度快、易繁殖，与苹果(M． pumila Mill．)嫁接后亲和力
强、耐寒性强，是东北、华北和西北山区苹果嫁接的主
要砧木材料;山荆子花、果美丽，果实、种子、嫩叶和木
材等均具有很高的经济价值，是苹果属的珍贵野生植
物资源［2］。有关该种形态变异、遗传多样性等方面
的研究结果表明:山荆子居群间的遗传分化和亲缘关
系较为复杂［3－6］。Nei［7］认为:物种表型进化是由相
互作用的基因突变引起的，不同分类等级物种的表型
多样性是新突变和遗传基因的累积产物，新突变基因
通过自然选择和基因漂变被纳入基因组中并产生遗
传保守性，从而影响表型进化的方向;Rouzine等［8］通
过对植物的病毒学实验，认为:低多样性居群受中性
变异控制，高多样性居群受自然选择控制，不同物种
的遗传变异差异明显。因此，探明山荆子的居群遗传
结构和遗传分化规律及地理居群的多样性是阐明其
系统进化和演化的主要途径，对山荆子的物种起源和
遗传进化研究具有重要意义。
作者采用 SSR 标记技术对山荆子主要分布区的
8 个居群 140 个单株的遗传多样性、居群遗传结构以
及居群间的亲缘关系进行了分析，以期为该种的起源
和地理演化规律研究提供一定的实验依据。
1 材料和方法
1． 1 材料
选取分布于黑龙江、吉林、河北、山西和北京等地
的 8 个山荆子居群进行取样，各居群的概况见表 1。
每个居群随机选取 20 株以上生长状况良好的植株作
为样株，总株数不足20株的居群则全部选为样株，
8 个居群共计 140 个样株。在样株上采集健康的幼
嫩叶片，用变色硅胶迅速干燥并带回实验室，常温条
件下保存、备用。
表 1 供试的 8 个山荆子居群概况
Table 1 Status of eight populations of Malus baccata (L．)Borkh． tested
居群编号
No． of
population
采集地
Locality
经度 /(°)
Longitude
纬度 /(°)
Latitude
海拔 /m
Altitude
样株数
Number of
sample individual
1 河北塞罕坝 Saihanba of Hebei Province E 117． 51 N 42． 30 1 400 21
2 山西灵空山 Mt． Lingkong of Shanxi Province E 112． 09 N 36． 65 1 550 33
3 黑龙江小兴安岭 Xiaoxing’anling of Heilongjiang Province E 129． 39 N 47． 73 296 12
4 山西管涔山 Mt． Guancen of Shanxi Province E 111． 98 N 38． 67 1 545 10
5 吉林长白山 Mt． Changbai of Jilin Province E 127． 49 N 42． 24 1 190 18
6 山西中条山 Mt． Zhongtiao of Shanxi Province E 111． 69 N 35． 42 1 200 23
7 山西五台山 Mt． Wutai of Shanxi Province E 113． 77 N 38． 76 1 600 10
8 北京东灵山 Mt． Dongling of Beijing City E 115． 48 N 40． 01 1 300 13
1． 2 方法
参照 Doyle 等［9］的 CTAB 法提取叶片基因组总
DNA。将获得的 DNA 溶解于灭菌双蒸水中，－20 ℃
贮存、备用。根据文献［10－12］确定 30 对引物进行扩
增反应预实验，通过预实验筛选出扩增条带丰富、信
号强的 10 对引物用于 SSR扩增反应。引物均由上海
英骏生物工程技术有限公司合成。
采用 PE－9700 PCR 仪(美国 GeneAmp 公司)进
行 SSR－PCR扩增反应，PCR 反应相关试剂均购自宝
生物工程(大连)有限公司。反应体系总体积 10 μL，
包含 0． 4 μmol·L－1的 dATP、dGTP、dCTP和 dTTP，1×
Taq DNA 聚合酶缓冲液(含有 10 mmol·L－1 Tris －
HCl、50 mmol·L－1 KCl 和体积分数 0． 1% Trion X－
100，pH 8． 4) ，2． 5 mmol·L－1 MgCl2，0． 5 U Taq DNA
34第 1 期 王雷宏，等:基于 SSR标记的 8 个山荆子居群遗传多样性和遗传关系分析
聚合酶，20 ng模板 DNA，0． 4 μmol·L－1上下游引物，
双蒸水补足至 10 μL。扩增程序为:94 ℃预变性 4
min;94 ℃变性 30 s，55 ℃ ～60 ℃退火 1 min，72 ℃延
伸 1 min，共 35 个循环反应;最后于 72 ℃延伸 5 min。
扩增产物置于 4 ℃冰箱中保存。
用质量体积分数 10%的聚丙烯酰胺凝胶对扩增
产物进行电泳检测，采用 50 bp Marker〔购自宝生物工
程(大连)有限公司〕进行分子量标记，电压 240 V，电
泳时间 1 h。电泳结束后用银染法染色，染色方法为:
凝胶先用体积分数 10%乙醇和体积分数 0． 5%冰乙
酸混合溶液固定 12 min，然后用质量体积分数 0． 2%
AgNO3水溶液处理 12 min;水洗后用含质量体积分数
1． 5% NaOH、体积分数 0． 4%甲醛和质量体积分数
0． 02%Na2S2O3的混合液显色 5 ～ 10 min，至谱带清晰
为止。染色结束后，将凝胶用自来水冲洗干净，用
FR－200A凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)观
察电泳结果并拍照。
1． 3 数据分析
人工判读条带，并应用 POPGENE v1． 31 软件［13］
计算等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性
指数、Shannon信息指数和多态性条带百分率;基于等
位基因频率，在假设遗传平衡的条件下，计算居群间
的基因分化系数(Gst)和基因流(Nm) ，并用 UPGMA
法进行聚类分析。
2 结果和分析
2． 1 SSR扩增结果分析
采用 10 对 SSR引物对 8 个山荆子地理居群 140
个单株的基因组总 DNA 进行 SSR 扩增，引物的序列
及扩增结果见表 2。10 对引物共扩增出 91 条带，平
均每对引物扩增出 9． 1 条带，多态性条带百分率达
100． 00%。其中，引物 CH02b12 扩增出的条带最多，
达 13 条;引物 U78949 扩增出的条带最少，仅 4 条。
表 2 8 个山荆子居群的 SSR－PCR扩增结果
Table 2 Amplified results of SSR-PCR of eight populations of Malus baccata (L．)Borkh．
引物
Primer
5→3序列 5→3 sequence
上游序列
Forward sequence
下游序列
Reverse sequence
退火温度 /℃
Annealing
temperature
扩增条带数
Number of
amplified band
多态性条带数
Number of
polymorphic band
CH02a08 GAGGAGCTGAAGCAGCAGAG ATGCCAACAAAAGCATAGCC 60 11 11
CH02b12 GGCAGGCTTTACGATTATGC CCCACTAAAAGTTCACAGGC 60 13 13
CH04e03 TTGAAGATGTTTGGCTGTGC TGCATGTCTGTCTCCTCCAT 60 9 9
CH04g09 TTGTCGCACAAGCCAGTTTA GAAGACTCATGGGTGCCATT 60 11 11
GD96 CGGCGGAAAGCAATCACCT GCCAGCCCTCTATGGTTCCAGA 55 11 11
GD100 ACAGCAAGGTGTTGGGTAAGAAGGT TGCGGACAAAGGAAAAAAAAAAGTG 55 8 8
Hi01d06 GGAGAGTTCCTGGGTTCCAC AAGTGCACCCACACCCTTAC 60 9 9
Hi04d02 TTCGTGGCTGAGAAAGGAGT GTTTGTACGGTGCATTGTGAAAG 60 9 9
Hi04f09 ACTGGGTGGCTTGATTTGAG GTTTCAACTCACACCCTCTACATGC 60 6 6
U78949 TTTGTCTACCTCTGATCTTAACCAA CAGCATCGCAGAGAACTGAG 60 4 4
2． 2 居群的遗传多样性分析
根据 SSR标记分析结果得出的 8 个山荆子居群
的遗传参数见表 3。由表 3 可知:吉林长白山山荆子
居群的有效等位基因数最大，为 1． 535 0;山西中条山
山荆子居群的 Nei’s基因多样性指数和 Shannon信息
指数最高，分别为 0． 309 2 和 0． 459 2;河北塞罕坝居
群的有效等位基因数和 Nei’s 基因多样性指数最低，
分别为 1． 437 9 和 0． 256 0;山西管涔山居群的
Shannon 信息指数最低，为 0． 376 7。吉林长白山居群
和山西中条山居群的多态性条带最多，均为 78 条;山
西五台山居群的多态性条带最少，仅 59 条。从居群
的多态性条带百分率来看，山西五台山居群最低，为
64． 84%;吉林长白山居群和山西中条山居群最高，均
为 85． 71%。
由表 3 还可以看出:供试的 8 个山荆子居群间的
有效等位基因数为 1． 616 9，Nei’s基因多样性指数为
0． 355 1，Shannon 信息指数为 0． 528 5，多态性条带百
分率达 100． 00%，居群间的各项遗传多样性指数均高
于居群内。
2． 3 居群的聚类分析结果
基于 Nei’s 遗传距离获得的 8 个山荆子居群的
UPGMA聚类结果见图 1。在 Nei’s遗传距离 0． 148 6
44 植 物 资 源 与 环 境 学 报 第 21 卷
表 3 基于 SSR标记分析的 8 个山荆子居群的遗传多样性分析结果
Table 3 Analysis results of genetic diversity of eight populations of Malus baccata (L．)Borkh． based on SSR marker analysis
居群编号1)
No． of
population1)
等位基因数
Number of
allele
有效等位基因数
Effective number
of allele
Nei’s基因多样性指数
Nei’s gene
diversity index
Shannon信息指数
Shannon
information index
多态性条带数
Number of
polymorphic band
多态性条带百分率 /%
Percentage of
polymorphic band
1 1． 714 3 1． 437 9 0． 256 0 0． 381 9 65 71． 43
2 1． 846 2 1． 531 0 0． 305 6 0． 453 2 77 84． 62
3 1． 736 3 1． 463 2 0． 270 4 0． 402 0 67 73． 63
4 1． 659 3 1． 460 8 0． 257 9 0． 376 7 60 65． 93
5 1． 857 1 1． 535 0 0． 306 8 0． 455 5 78 85． 71
6 1． 857 1 1． 532 1 0． 309 2 0． 459 2 78 85． 71
7 1． 648 4 1． 459 2 0． 260 8 0． 380 9 59 64． 84
8 1． 670 3 1． 451 8 0． 259 4 0． 381 3 61 67． 03
居群间
Among populations
2． 000 0 1． 616 9 0． 355 1 0． 528 5 91 100． 00
1)1:河北塞罕坝居群 Population in Saihanba of Hebei Province;2:山西灵空山居群 Population in Mt． Lingkong of Shanxi Province;3:黑龙江小兴
安岭居群 Population in Xiaoxing’anling of Heilongjiang Province;4:山西管涔山居群 Population in Mt． Guancen of Shanxi Province;5:吉林长白
山居群 Population in Mt． Changbai of Jilin Province;6:山西中条山居群 Population in Mt． Zhongtiao of Shanxi Province;7:山西五台山居群
Population in Mt． Wutai of Shanxi Province;8:北京东灵山居群 Population in Mt． Dongling of Beijing City．
处，8 个居群被分成 3 个大组:第 1 组包括山西五台山
居群和北京东灵山居群;第 2 组包括山西中条山居
群、吉林长白山居群、黑龙江小兴安岭居群、山西灵空
山居群和山西管涔山居群;第3组仅含河北塞罕坝
1 个居群。由图 1 可见:发生明显地理分化的是山西
五台山居群、北京东灵山居群、山西管涔山居群和河
1:河北塞罕坝居群 Population in Saihanba of Hebei Province;2:山西灵
空山居群 Population in Mt． Lingkong of Shanxi Province;3:黑龙江小兴
安岭居群 Population in Xiaoxing’anling of Heilongjiang Province;4:山西
管涔山居群 Population in Mt． Guancen of Shanxi Province;5:吉林长白
山居群 Population in Mt． Changbai of Jilin Province;6:山西中条山居群
Population in Mt． Zhongtiao of Shanxi Province;7:山西五台山居群
Population in Mt． Wutai of Shanxi Province;8:北京东灵山居群
Population in Mt． Dongling of Beijing City．
图 1 基于 SSR标记分析结果的 8 个山荆子居群的 UPGMA聚类图
Fig． 1 UPGMA cluster dendrogram of eight populations of Malus
baccata (L．)Borkh． based on SSR marker analysis result
北塞罕坝居群;山西灵空山居群、黑龙江小兴安岭居
群、吉林长白山居群和山西中条山居群可能是山荆子
的多样性核心居群。山西五台山居群和北京东灵山
居群的地理位置较近，遗传关系也最近，而其他居群
间的遗传关系与地理位置没有明显的相关性。
2． 4 居群间的基因分化分析
对 8 个山荆子居群进行基因分化分析，居群间的
基因分化系数(Gst)为 0． 223 3，说明在总的遗传变异
中有 22． 33%存在于居群间;基因流(Nm)为 1． 739 5，
说明居群间的基因交换较多。
3 结论和讨论
采用 10 对 SSR引物对 8 个山荆子居群的基因组
总 DNA进行 PCR扩增，根据其基因位点多态性可知:
山西中条山居群的遗传多样性最高，其Nei’s基因
多样性指数(H)为 0． 309 2，Shannon 信息指数(I)为
0． 459 2;山西灵空山居群的遗传多样性也较高，H 为
0． 305 6，I为 0． 453 2。陈曦等［5］根据山荆子居群的
RAPD分析结果，认为山西灵空山居群的遗传多样性
最高(H=0． 304 5，I = 0． 452 6)。虽然 2 种方法的结
果不一致，但从绝对数值来看，二者差异不大。本研
究结果表明:与苹果属植物的遗传多样性［14］相比，山
荆子居群间的遗传多样性(H = 0． 355 1，I = 0． 528 5)
明显低于苹果属野生种 (H=0． 86，I=2． 07)及苹果砧
木(H= 0． 76，I = 1． 63) ，其原因与居群划分方法的不
54第 1 期 王雷宏，等:基于 SSR标记的 8 个山荆子居群遗传多样性和遗传关系分析
同有关;但本研究结果与苹果属其他种类，如新疆野
苹果〔Malus sieversii (Ledeb．)Roem．〕［8］、湖北海棠
〔M． hupehensis (Pamp．)Rehd．〕［15］、变叶海棠〔M．
toringoides (Rehd．) Hughes〕［16］ 和小金海棠 (M．
xiaojinensis Cheng et Jiang)［17］等种类的遗传多样性水
平相近。
聚类分析结果表明:在 Nei’s 遗传距离 0． 148 6
处，供试的 8 个山荆子居群被分成 3 组，居群间的
Nei’s遗传距离最大值为 0． 227 4，与 RAPD标记的聚
类分析结果相似(RAPD 标记的 Nei’s 遗传距离最大
值为 0． 224 9)［5］。但是，同一地域内小居群间基于
SSR和 RAPD标记的遗传关系分析结果并不完全一
致，其中山西中条山和管涔山居群以及黑龙江小兴安
岭居群的差异较大，推测这些山荆子居群在遗传上可
能具有特定的杂合性和分化方向，也可能与这些居群
处于从随机进化向定向进化的过渡状态有关。
基于 SSR标记的 8 个山荆子居群的遗传组成和
基因流大小与其 RAPD 标记［5］和 ISSR 分析［18］的结
论基本一致，按照 Wright［19］的理论，表明山荆子群体
相对稳定，不存在遗传漂变，但分化程度较高。聚类
结果显示:地理位置相近的居群并没有聚在一起，如
山西五台山居群、北京东灵山居群和山西管涔山居群
地理位置相近，但仅前二者紧密相聚，山西管涔山居
群则与中部的核心居群聚在一起。推测山荆子的迁
移扩散可能是从核心居群向外扩展，由于同区域内小
居群间基因流不对称或不均等，加之特定地理居群可
能受到强有力的外界选择压力，产生了遗传分化。结
合“多样性中心就是起源中心”的理论推测:山荆子起
源于我国的华北和东北地区，向四周扩散后在基因流
不对称和生境的强有力选择压力下形成了现有的多
样性分布格局。
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(责任编辑:佟金凤)
64 植 物 资 源 与 环 境 学 报 第 21 卷