全 文 ：平邑甜茶子叶和下胚轴离体再生不定芽的研究
刘霁菡，代红艳*，赵 恺，张志宏
（沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110866）
摘 要：为了建立高效的平邑甜茶离体再生体系，以平邑甜茶子叶和下胚轴为外植体，研究了不同外植体部
位、暗培养时间、基本培养基、激素种类和浓度对不定芽再生的影响。结果表明，近轴端子叶的再生频率是远轴端
子叶的3.1倍、下胚轴的3.7倍。在附加不同浓度的NAA、IBA与TDZ的SC培养基上，近轴端子叶的不定芽再生率达
90%以上。在附加1.0 mg·L-1 TDZ+ 0.2 mg·L-1 NAA的再生培养基上，平均每个外植体再生芽数达到12个。研究表明，
平邑甜茶近轴端子叶具有很强的离体再生不定芽能力，培养基中附加TDZ可有效提高平邑甜茶的不定芽再生效率。
关键词：平邑甜茶；子叶；再生；不定芽
中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2011）10-0090-05
In vitro adventitious bud regeneration from cotyledon and hypocotyl of
Malus hupehensis var. pingyiensis/LIU Jihan, DAI Hongyan, ZHAO Kai, ZHANG
Zhihong(College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)
Abstract: To establish a highly efficient in vitro regeneration system of Malus hupehensis var. pingyiensis,
the effects of types of explants, time of culture in darkness, basic medium, kind and concentration of plant growth
regulator on adventitious bud regeneration from cotyledon and hypocotyl were studied. The regeneration rate of
paraxial cotyledons was 3.1 times of that of abaxial cotyledons and 3.7 times of that of hypocotyls. On the SC
medium supplemented with different combinations of NAA, IBA and TDZ, the regeneration rates of paraxial
cotyledons of all the treatments were more than 90% . The number of regenerated buds per explant reached 12
when the medium was supplemented with TDZ 1.0 mg·L-1 and 0.2 mg·L-1 NAA. The study showed that the
paraxial cotyledons of M. hupehen-
sis var. pingyiensis had higher ability to regenerate adventitious bud, and TDZ supplemented in re-
generation medium could increase the regeneration rate of adventitious buds.
Key words: Malus hupehensis var. pingyiensis; cotyledon; regeneration; adventitious bud
平邑甜茶（Malus hupehensis var. pingyiensis）是
蔷薇科苹果属植物，是我国重要的苹果砧木之一。
平邑甜茶为三倍体（2n=3x=51），具有很强的无融
合生殖能力，无融合生殖率在95％以上[1]。平邑甜
茶的种胚由珠心壁细胞发育而成，其实生后代与母
本在遗传组成上一致[2]，是苹果实生砧木育种的宝
贵材料[3]。
20世纪 90年代以来，国内的一些学者致力于
以平邑甜茶为亲本通过杂交育种的方式培育苹果无
融合生殖矮化砧木的研究 [4-6]。但是近来的研究结
果表明，平邑甜茶有性后代的无融合生殖能力大幅
退化[1]，因此，通过有性杂交来培育苹果无融合生
殖矮化砧木的途径可能行不通。随着分子生物学理
论和技术的发展，基因工程成为培育苹果无融合生
收稿日期：2011-03-21
基金项目：辽宁省高等学校创新团队项目（2008T177）
作者简介：刘霁菡（1985-），女，硕士研究生，研究方向为果树生物技术。E-mail: liujihan2007@163. com
*通讯作者：代红艳，教授，研究方向为果树生物技术与遗传育种。E-mail: daihy1970@163. com
Journal of Northeast Agricultural University
东 北 农 业 大 学 学 报第42卷第10期 42(10): 90~94
2011年10月 Oct. 2011
殖矮化砧木的新途径。建立高效的离体再生体系
是转基因获得成功的基础。张军科等的研究表
明，平邑甜茶的叶片离体再生能力很低，不定芽
再生频率仅为 16%，并认为这是遗传导致的[7]。韩
小娇等通过在培养基添加NO供体、暗培养等方式
使平邑甜茶叶片再生频率达到67.8%，但是平均再
生芽数较少，达不到遗传转化的要求[8]。通常，子
叶和胚轴较真叶具有较强的离体再生能力，本研
究比较了平邑甜茶子叶和下胚轴的离体再生能
力，优化子叶离体再生不定芽体系，以期为平邑
甜茶的遗传转化奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
2009年 10月，从沈阳农业大学果树试验基地
种植的平邑甜茶植株上采集种子。将种子用 0.1%
的HgCl2进行消毒，剥去种皮后将胚接种在胚萌发
培养基中进行培养，7~10 d后剪取子叶和下胚轴，
接种在再生培养基上。
1.2 培养基和培养条件
基本培养基为MS培养基或 SC培养基[9]，所有
的培养基均添加 3%蔗糖，用 7 g·L-1琼脂固化。灭
菌前将培养基的pH调至5.8，然后在121 ℃下灭菌
20 min。胚萌发培养基为 SC+0.5 mg·L-1 BA+0.5
mg·L-1 GA3，再生培养基为附加细胞分裂素（TDZ或
BA）、生长素（NAA或 IBA）、赤霉素（GA3）的MS或
SC培养基。外植体在再生培养基上培养6周后转入
新梢抽生培养基，配方为 SC+2.0 mg·L-1 BA+0.2
mg·L-1 NAA。
培养室温度为（24±2）℃，光周期16 h·d-1，光
强约2 000 lx。
1.3 试验设计
1.3.1 外植体类型
从萌发的胚上剪取子叶，将其平均分成两部
分，即近轴端子叶（与胚轴相连的部分）和远轴端
子叶。剪取子叶的同时剪取下胚轴。将不同类型
的外植体分别接入MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.2 mg·L-1
NAA+0.5 mg·L-1 GA3培养基上，暗培养14 d后置光
下培养。
1.3.2 暗培养时间
以近轴端子叶为外植体，再生培养基为MS+
1.0 mg·L-1 TDZ+0.2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 GA3，暗
培养时间设 3个处理，分别是 7、14和 21 d。暗培
养结束后置光下培养。
1.3.3 基本培养基种类
以近轴端子叶为外植体，比较MS和SC两种基
本培养基，培养基中附加1.0 mg·L-1 TDZ+0.2 mg·L-1
NAA+0.5 mg·L-1 GA3，暗培养14 d后置光下培养。
1.3.4 激素种类和浓度
以近轴端子叶为外植体，选用 SC基本培养
基，设计不同的激素配方。暗培养14 d后置光下培
养。
1.4 试管苗生根
再生不定芽在新梢抽生培养基上生长 40 d后，
剪取 2~4 cm高的苗，先接种到 SC+4.0 mg·L-1 IBA
培养基上，暗培养4 d，然后转到不添加激素的SC
基本培养基上，在光下培养。
1.5 数据调查与统计分析
外植体转入新梢抽生培养基20 d后调查再生芽
状况，统计高度在 5 mm以上的再生芽，并计算再
生频率和平均再生芽数。生根培养50 d后调查生根
率和平均生根数。
再生频率（%）=再生芽的外植体数/调查外植体
数×100%；
平均再生芽数=再生芽总数/再生芽的外植体
数；
生根率（%）=生根株数/调查株数×100%；
平均生根数=根总数/生根株数。
2 结果与分析
2.1 不定芽再生及生根过程
平邑甜茶的成熟胚在 SC+0.5 mg·L-1 BA+0.5
mg·L-1 GA3上培养 3~5 d后子叶张开，7 d后子叶转
绿，真叶开始萌动（见图 1A）。在真叶展开之前，
剪取子叶和下胚轴，接种在再生培养基上。14 d
暗培养结束后，不定芽显现（见图 1B）；接种 1个
月后，外植体上分化出不定芽丛（见图 1C、D），
不定芽丛在新梢抽生培养基上培养 20 d后，部分
不定芽发育成新梢（见图 1E）。当新梢成长到 2~
4 cm高时，进行生根培养， 50 d后完成生根（见
图1F）。
2.2 不同类型外植体的再生能力
将平邑甜茶的子叶和下胚轴接入相同的再生培
养基中，从表1可以看出，近轴端子叶和远轴端子
刘霁菡等：平邑甜茶子叶和下胚轴离体再生不定芽的研究第10期 ·91·
叶的再生频率均高于下胚轴，但是远轴端子叶的平
均再生芽数低于下胚轴。近轴端子叶的再生能力远
远高于远轴端子叶，近轴端子叶的不定芽再生频率
是远轴端子叶的3.1倍（82.9%/26.5%），平均再生芽
数是远轴端子叶的2.5倍（6.4个/2.6个）。而且远轴端
子叶分化的不定芽也较小。由于平邑甜茶近轴端
子叶较远轴端子叶和下胚轴具有较强的再生能力，
因此下面的研究中仅以近轴端子叶为外植体。
表1 平邑甜茶不同外植体类型对不定芽再生情况的影响
Table 1 Effect of different types of explants on in vitro adventitious bud regeneration of Malus hupehensis var. pingyiensis
外植体类型
Explants type
近轴端子叶 Paraxial cotyledon
远轴端子叶 Abaxial cotyledon
下胚轴 Hypocotyl
调查外植体数（个）
No. of explants
42
49
22
再生芽的外植体数（个）
No. of explants with
adventitious buds
34
13
5
再生频率（%）
Regeneration
rate
82.9
26.5
22.7
再生芽总数（个）
No. of regenerated
buds
211
34
29
平均再生芽数（个）
No. of regenerated
buds per explant
6.4
2.6
5.8
2.3 暗培养时间对近轴端子叶再生效率的影响
苹果离体叶片再生培养过程中，前期暗处理被
认为是必不可少的，可以显著提高叶片再生频率，
以暗培养2~3周为宜[10]。为此，本文研究了暗培养
时间对平邑甜茶近轴端子叶再生不定芽的影响，结
果表明，暗培养时间也是影响平邑甜茶近轴端子叶
再生不定芽效率的因素之一， 14 d是适宜的暗培
养时间（见表 2）。暗培养7和21 d的处理在近轴端
子叶再生频率上与暗培养14 d的处理相差不到1/4，
但是平均再生芽数不足暗培养14 d处理的一半。
2.4 基本培养基对近轴端子叶再生不定芽的影响
MS和 SC在大量元素上差异较大，MS培养基
中无机氮含量为 60 mmol·L-1，NH4 +/NO3-比例为
1􀏑2，而 SC培养基中无机氮含量为 30 mmol·L-1，
NH4+/NO3-比例为 1􀏑8[9]。本研究比较了这两种基本
培养基对平邑甜茶近轴端子叶再生不定芽效率的影
响。结果表明，以 SC为基本培养基时，再生频率
达到 100%，平均再生芽数达到 12.0个，而在附加
A B C
D E F
A-培养7 d后子叶转绿；B-子叶分化出不定芽；C-下胚轴分化出不定芽丛；
D-子叶分化不定芽丛；E-不定芽抽生出嫩梢；F-试管苗生根情况
A-Cotyledon turned green after 7 d culture; B-Adventitious bud regenerated from cotyledon; C-Adventitious bud regenerated from hypocotyl;
D-Adventitious bud regenerated from cotyledon; E-Bud developed into shoot; F-Rooted plants of Malus hupehensis var. pingyiensis
图1 平邑甜茶胚萌发、子叶和下胚轴离体再生不定芽及试管苗生根情况
Fig. 1 Germination of embryo, in vitro adventitious buds regeneration from cotyledons and
hypocotyls and rooted plants of Malus hupehensis var. pingyiensis
东 北 农 业 大 学 学 报·92· 第42卷
相同激素的MS培养基上，再生频率和平均再生芽
数分别为 82.9%和 6.4个。因此，SC是适宜平邑甜
茶近轴端子叶再生的基本培养基，在下面的激素种
类和浓度试验中，以SC为基本培养基。
表2 暗培养时间对平邑甜茶近轴端子叶再生不定芽效率的影响
Table 2 Effect of times of darkness culture on adventitious bud regeneration from
paraxial cotyledon of Malus hupehensis var. pingyiensis
暗培养时间（d）
Time of darkness
culture
7
14
21
调查外植体数（个）
No. of
explants
34
42
41
再生芽的外植体数（个）
No. of explants with
adventitious buds
27
34
27
再生频率（%）
Regeneration
rate
79.4
82.9
65.9
再生芽总数（个）
No. of regenerated
buds
74
211
73
平均再生芽数（个）
No. of regenerated
buds per explant
2.7
6.4
2.7
2.5 激素种类和浓度对近轴端子叶再生不定芽的
影响
研究结果表明，对于平邑甜茶近轴端子叶再
生不定芽，TDZ的细胞分裂素活性显著高于 BA，
这与前人在其他苹果属植物上研究一致[11]。虽然平
邑甜茶近轴端子叶在附加 1.0 mg·L-1 TDZ的培养基
上和在附加 2.0 mg·L-1 BA的培养基上都能达到
100%的再生频率，但是在附加TDZ的培养基上的
平均再生芽数是在附加BA培养基上的2.2倍（12个/
5.5个）。将TDZ浓度从0.5 mg·L-1提升至1.0 mg·L-1，
平均再生芽数增加（见表 3），提高幅度为 16.7%~
60.5%。
表3 激素种类和浓度对平邑甜茶近轴端子叶再生效率的影响
Table 3 Effect of hormones on adventitious bud regeneration from paraxial cotyledon of Malus hupehensis var. pingyiensis
激素浓度（mg·L-1）Concentration of hormone
NAA
0.2
-
-
0.2
-
-
IBA
-
0.2
-
-
0.2
-
TDZ
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
GA
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
再生频率（%）
Regeneration rate
93.3
100
100
100
100
100
平均再生芽数（个）
No. of regenerated buds per explant
9.7
6.6
3.8
12.0
7.7
6.1
培养基中附加生长素可以提高平均再生芽数
（见表3）。在相同的TDZ浓度下比较NAA和 IBA的
效果可以看出，在附加NAA的培养基上近轴端子
叶分化出更多的不定芽，平均再生芽数最高可达
到12.0个。
2.6 试管苗生根
用于生根培养的植株总数为 32株，其中生根
的植株数为 17株，根总数为 26条，其中单株根
数最多的为 3条。平邑甜茶试管苗的生根率为
53.1%，平均生根数是1.5个。
3 讨论与结论
本研究发现，以平邑甜茶胚的不同部位作为
外植体时，近轴端子叶的再生率最高，分别是远
轴端子叶和下胚轴的 3.1和 3.7倍，而且远轴端子
叶的再生芽较其他两种外植体产生的芽矮小。而
下胚轴虽然可以产生大量的愈伤组织，但在后期
培养过程中难以生成不定芽。这表明在相同培养
条件下，即使是同一植株的不同外植体，其愈伤
组织的诱导能力也不同，这可能与构成不同外植
刘霁菡等：平邑甜茶子叶和下胚轴离体再生不定芽的研究第10期 ·93·
体的细胞生长发育规律及调节其生长的内源激素
不同有关[12]。
平邑甜茶近轴端子叶不定芽再生率要比其叶
片的再生率高，据魏国芹等的报道，叶片再生率
最高为 93.3%[13]，而本研究近轴端子叶的再生率可
达 100%。同时平邑甜茶近轴端子叶的再生频率也
较国光、元帅等品种的苹果子叶再生率高[14]，这可
能是由于不同的遗传基础导致的[15]。
前人的研究结果表明，TDZ较BA更利于离体
不定芽的再生[11, 16]，这与本研究的结果相一致。在
附加 TDZ培养基上再生的平邑甜茶的不定芽多以
芽丛形式出现，成苗缓慢，同时玻璃化现象也较
为严重，而且后期须将不定芽丛转入附加BA的培
养基中，以促使新梢抽生（见图 1E）。因此，与附
加BA相比，再生培养基中附加TDZ延长了不定芽
苗形成的时间。
本研究对平邑甜茶子叶和下胚轴不定芽离体
再生体系做了较为系统的探索，结果表明平邑甜
茶近轴端子叶具有很强的离体再生不定芽能力，以
SC为基本培养基，附加1.0 mg·L-1 TDZ+0.2 mg·L-1
NAA+0.5 mg·L-1 GA3，暗培养 14 d，近轴端子叶的
不定芽再生频率达 100%，平均再生芽数为 12个。
利用此再生体系，我们已经建立了农杆菌介导的
平邑甜茶的遗传转化体系，获得了转基因植株。
[ 参 考 文 献 ]
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