全 文 ：西北农业学报　２０１４，２３（１０）：１０５－１１１
Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｂｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ　Ｓｉｎｉｃａ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１４．１０．０１８
网络出版日期：２０１４－１０－２１
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｏｉ／１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１４．１０．０１８．ｈｔｍｌ
西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基因的克隆及分析
收稿日期：２０１４－０６－０９　　修回日期：２０１４－０６－２６
基金项目：西北农林科技大学基本科研业务费项目（ＱＮ２０１１００３）；唐仲英育种基金。
第一作者：侯立江，男，硕士，研究方向为作物遗传育种。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｌｊ２０１３＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ
通信作者：王军卫，男，博士，副研究员，从事作物遗传育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｊｗ＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ
侯立江，牛　娜，马守才，宋亚珍，王　强，张改生，王军卫
（西北农林科技大学，国家杨凌农业生物技术育种中心／国家小麦改良中心杨凌分中心／小麦育种教育部
工程研究中心／陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室，陕西杨凌　７１２１００）
摘　要　旨在利用基因工程手段将ＡｅＳｅＰＡＰ１ 基因转入到小麦，为获得耐低磷胁迫的小麦品种奠定基础。
以西尔斯山羊草的叶片为材料，根据小麦和二穗短柄草的ＰＡＰ１ 基因设计特异引物，采用同源克隆的方法获
得西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基因的ｃＤＮＡ序列，并将其命名为ＡｅＳｅＰＡＰ１ 。该基因长１．０３ｋｂ，
编码３３５个氨基酸，分子质量为３７．９５ｋｕ，等电点为５．５５。与小麦ＰＡＰ１ 基因相比，西尔斯山羊草ＰＡＰ１ 基
因的ｃＤＮＡ的编码区有３６处发生碱基替代，包括２４处转换和１２处颠换，有１６处编码的氨基酸残基不同，其
序列一致性达９４．６６％。对ＡｅＳｅＰＡＰ１ 基因编码的蛋白质进行生物信息学分析发现，该蛋白具有信号肽和跨
膜结构，定位于质膜或分泌到胞外。系统进化树分析表明，西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基因与普通
小麦、短柄草、谷子的ＰＡＰ１ 基因同源性较高。
关键词　西尔斯山羊草；紫色酸性磷酸酶；耐低磷基因；抗逆性
中图分类号　Ｑ９４３．２　　　文献标志码　Ａ　　　　　文章编号　１００４－１３８９（２０１４）１０－０１０５－０７
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｕｒｐｌｅ　Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ
ＰＡＰ１　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＡｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉ
ＨＯＵ　Ｌｉｊｉａｎｇ，ＮＩＵ　Ｎａ，ＭＡ　Ｓｈｏｕｃａｉ，ＳＯＮＧ　Ｙａｚｈｅｎ，
ＷＡＮＧ　Ｑｉａｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｇａｉｓｈｅｎｇ　ａｎｄ　ＷＡＮＧ　Ｊｕｎｗｅｉ
（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｙａｎｇｌｉｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　＆Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ／Ｙａｎｇｌｉｎｇ　Ｂｒａｎｃｈ　ｏｆ　Ｓｔａｔｅ　Ｗｈｅａｔ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ
Ｃｅｎｔｅｒ／Ｗｈｅａｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ
Ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｈａａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ　Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｈｅｌｐ　ｆｏｒ　ｗｈｅａｔ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｗｅ　ｃｏｕｌｄ　ｇｅｔ　ｓｏｍｅ　ｌｏｗ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｇｅｒｍ－
ｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｖｉａ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｅＳｅＰＡＰ１ｉｎｔｏ　ｗｈｅａｔ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．Ｉｎ
ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ＰＡＰ１　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｓｅａｒｓｉｉ　ｗｉｔｈ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＰＡＰ１　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｗｈｅａｔ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）ａｎｄ　ｓｌｅｎｄｅｒ　ｆａｌｓｅｂｒｏｍｅ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ　ｄｉｓ－
ｔａｃｈｙｏｎ）ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｎａｍｅｄ　ＡｅＳｅＰＡＰ１ ．Ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ＡｅＳｅＰＡＰ１　ｇｅｎｅ
ｗａｓ　１．０３ｋｂ　ｉｎ　ｓｉｚｅ　ａｎｄ　ｅｎｃｏｄｅｄ　３３５ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，ｗｉｔｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｏｆ　３７．９５ｋｕ　ａｎｄ　ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ
ｐｏｉｎｔ　５．５５．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＡｅＳｅＰＡＰ１　ｗｉｔｈ　ＰＡＰ１　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　３６ｓｉｎｇｌｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，２４ｌｏｃｕｓ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　１２ｌｏｃｕｓ　ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ　ａｎｄ　ＡｅＳｅＰＡＰ１　ｈａｄ　ｈｉｇｈ　ｈｏ－
ｍｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ＰＡＰ１　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　９４．６６％．Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ
１６ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｏｆ　ＡｅＳｅＰＡＰ１　ｗｅｒｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｒｏｍＰＡＰ１　ｏｆ　ｗｈｅａｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ－
ｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ＡｅＳｅＰＡＰ１　ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｓｉｇｎａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓ－ｍｅｍｂｅｒａｎｃｅ　ｒｅ－
ｇｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃ　ｔｒｅｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＰＡＰ１　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｓｅａｒｓｉｉ　ｓｈａｒｅｄ　ｈｉｇｈ　ｓｉｍｉｌａｒｉ－
ｔｉｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ　ＰＡＰ１　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ，Ｂｒａｃｈｙｐｏ－
ｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ　ａｎｄ　Ｓｅｔａｒｉａ　ｉｔａｌｉｃａ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｓｅａｒｓｉｉ；Ｐｕｒｐｌｅ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ；Ｌｏｗ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｇｅｎｅ；Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
　　磷是植物生长所必需的重要元素之一，它不
仅对植物的营养有重要作用，而且还参与植物体
内能量代谢、光合作用、呼吸作用等重要过程，另
外，磷还有助于植物抗逆性的提高。植物若缺少
磷，会表现出植株红色或紫色，茎短而细，基部叶
片变黄，开花期推迟，种子小且不饱满等缺素症
状。植物主要以磷酸根（Ｐｉ）的形式吸收磷，其中
以 Ｈ２ＰＯ－４ 最易被吸收。尽管土壤中磷元素含量
丰富，但可利用的有效磷（Ｐｉ）却普遍缺乏［１－３］，只
能靠外施磷肥进行补充，因此需要长期施用。有
研究［４］表明，植物对磷的当季利用率仅为１０％～
２５％。
生产上磷肥的大量施用，不仅增加农业生产
的成本，而且污染水质，同时，加剧磷资源的消耗。
因此，研究植物磷营养的生理学和分子生物学机制，
通过基因工程手段对农作物进行改良，培育磷高效
作物品种，具有重大的科学意义和应用价值［５］。
研究表明，低磷胁迫下，作物会表现出各种适
应机制，其中诱导根系分泌酸性磷酸酶是高等植
物的一个普遍机制。紫色酸性磷酸酶（Ｐｕｒｐｌｅ
ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ，ＰＡＰ），是一类金属水解酶，它
能催化磷酸酯或酸酐的水解而生成无机磷酸根
（Ｐｉ）［６－１０］。目前，已在几种植物中发现缺磷能诱
导紫色酸性磷酸酶基因的转录或者诱导ＰＡＰ蛋
白分泌至胞外，显示ＰＡＰｓ可能在植物磷营养中
起重要的作用［１１－１３］。有研究发现，在以植酸盐为
唯一磷源条件下，转ＰＡＰ１ 基因植物的磷吸收能
力优于野生型，且生物产量也得到明显改善。例
如，Ｍａ等［１４］研究转 Ｍｔ　ＰＡＰ１ 白三叶草时发现，
转基因植株的磷吸收量和生物产量均高于野生
型；肖凯等［１５］在研究转 Ｍｔ　ＰＡＰ１ 基因的拟南芥
植株时也得出相同的结论。
西尔斯山羊草（Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｓｅａｒｓｉｉ）为小麦近属
植物，在生物进化过程中，西尔斯山羊草不但适应
各种逆境条件，而且还保留许多优良的抗逆性状，
因此，被广泛应用为远缘杂交抗病育种的试验材
料。本研究从西尔斯山羊草中克隆获得紫色酸性
磷酸化酶基因，并进行分子生物学分析，以期为进
一步利用基因工程手段将紫色酸性磷酸化酶基因
转入普通小麦品种，获得耐低磷胁迫能力增强的
小麦品种提供种质基因，从而为提高小麦产量和
改善小麦品质奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料与试剂
西尔斯山羊草与大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株
ＤＨ５α均由陕西省作物杂种优势研究与利用重点
实验室提供和保存。Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶限制性内
切酶和Ｔ４ＤＮＡ连接酶、载体Ｔ－ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ均购
于ＴａＫａＲａ公司。反转录试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｎ－
ｇｅｎ公司。Ｔｒｉｚｏｌ　ＲＮＡ提取试剂盒购于天根公
司。引物合成及测序由北京华大公司完成。
１．２　方 法
１．２．１　ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ合成　将采集的西
尔斯山羊草幼叶用液氮研磨，参照Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒
说明书，提取总ＲＮＡ，然后用ＤｎａｓｅⅠ（ＴａＫａＲａ）
处理去除存在的痕量ＤＮＡ。ｃＤＮＡ第一链合成
采用 Ｍ－ＭＬＶ反转录酶（Ｉｎｖｉｔｒｏｎｇｅｎ）进行。
１．２．２　西尔斯山羊草紫色磷酸酶基因ＰＡＰ１ 的
克隆 　 依据小麦ＰＡＰ１ 基因 （基因登录号：
ＡＢ５１８８６．１）和二穗短柄草ＰＡＰ１ 基因（基因登录
号：ＸＭ＿００３５５８３５３．１）的ｃＤＮＡ序列，合成兼并
引物，其正向引物为：５′－ＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴ－
ＧＧＣＧＡＧ－３′，反向引物为：５′－ＣＣＴＣＡＴＴＹＴＫ－
ＣＡＧＴＧＡＣＡＴＡ－３′。以西尔斯山羊草叶片的
ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增。２５μＬ反应体系：
２μＬ　ｃＤＮＡ模板，１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，ｄＮＴＰ
（２ｍｍｏｌ·Ｌ－１）０．５μＬ，上游和下游引物（１０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１１）各１．５μＬ，Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５
Ｕ·μＬ
－１）０．２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补齐至２５μＬ。ＰＣＲ
反应程序为：９５ ℃预变性３ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ｓ，
６７．５℃（↓０．５℃）３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；
９４℃３０ｓ，５０℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环，
７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。扩增产物经琼脂糖
凝胶电泳检测后与ｐＭＤ１８－Ｔ连接，转化感受态
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ɑ，挑取转化子进行序列测定。
１．２．３　ｃＤＮＡ序列和编码蛋白质特征分析　将
测序得到的序列采用Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ软件进行序列拼
·６０１· 西　北　农　业　学　报 ２３卷
接，应用ＤＮＡＭＡＮ软件进行序列比对；依据Ｅｘ－
Ｐａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）对西尔斯山羊
草ＰＡＰ　１蛋白进行氨基酸组成、等电点等理化性
质及亲水性／疏水性进行分析；利用 ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ｓｉｇｎａｌ　Ｐ－４．１／进行
信号肽分析；利用 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／
ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨ　ＭＭ进行跨膜结构预测。
１．２．４　同源蛋白的系统进化分析　以ｃＤＮＡ核
苷酸序列为基础，在 ＮＣＢＩ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）进行ＢＬＡＳＴ，找到其他植物
种属同源的ＰＡＰ１氨基酸序列，进行同源性分析；
利用 ＭＡＧＡ　５软件建立系统进化树。
２　结果与分析
２．１　西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基因
的克隆
以西尔斯山羊草的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ
扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析，结果得到１．０３ｋｂ
的特异性 ＰＣＲ 条带 （图 １）。将目的片段与
ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接并转化大肠杆菌ＤＨ５α，通过
蓝白斑筛选，随机挑选５个白色菌落进行ＰＣＲ检
测，其中３个克隆扩增到目的条带，对其进一步测
序分析。测序结果表明，该基因ｃＤＮＡ序列组成
与ＮＣＢＩ中已知的小麦紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基
因（登录号：ＡＢ５１８８６．１）高度同源，两者在ｃＤＮＡ
碱基的同一性为９５．８３％。由此推断所克隆得到
的ｃＤＮＡ序列为紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ　１基因序
列，并将其命名为ＡｅＳｅＰＡＰ１ 。
图１　紫色酸性磷酸酶ＡｅＳｅＰＡＰ１ 基因克隆电泳检测
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ
ＡｅＳｅＰＡＰ１　ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ
２．２　全长ｃＤＮＡ序列的分析
西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基因
长为１．０３ｋｂ，与小麦ＰＡＰ１ 基因（１．０２８ｋｂ）匹配
度最高，起始密码子为ＡＴＧ，终止密码子为ＴＧＡ
（图２）。在ｃＤＮＡ的编码区共有３６处发生了碱
基的替代，包括２４处转换（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）和１２处颠
换（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ）（表１）。
２．３　西尔斯山羊草ＰＡＰ１氨基酸序列与其近缘
物种ＰＡＰ１氨基酸序列的比对
　　从西尔斯山羊草ＰＡＰ１氨基酸序列与其近缘
物种ＰＡＰ１氨基酸序列的比对结果（图３）中可以
发现，它们氨基酸同源一致性相当高，许多位点只
存在单个氨基酸多态性；另外，也可以看出西尔斯
图２　西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基因与小麦ＰＡＰ１ 基因的序列比对
Ｆｉｇ．２　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＡｅＳｅＰＡＰ１　ｗｉｔｈ　ＰＡＰ１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ
·７０１·１０期 侯立江等：西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基因的克隆及分析
表１　 西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＡｅＳｅＰＡＰ１ 基因与普通小麦ＰＡＰ１ 基因的比较分析
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＡｅＳｅＰＡＰ１　ａｎｄ　ＰＡＰ１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ
位 点
Ｌｏｃｕｓ
碱基Ｂａｓｅ
ＰＡＰ１ ＡｅＳｅＰＡＰ１
氨基酸 Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
ＰＡＰ１ ＡｅＳｅＰＡＰ１
位 点
Ｌｏｃｕｓ
碱基Ｂａｓｅ
ＰＡＰ１ ＡｅＳｅＰＡＰ１
氨基酸 Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
ＰＡＰ１ ＡｅＳｅＰＡＰ１
１０ Ｇ Ａ　 Ｇ　 Ｓ　 ４３９ Ｃ Ｇ　 Ｌ　 Ｖ
２３ Ｃ Ｔ　 Ａ　 Ｖ　 ４７２ Ａ Ｇ　 Ｉ　 Ｖ
８７ Ｇ Ｔ　 Ｌ　 Ｌ　 ５５５ Ｇ Ａ　 Ｋ　 Ｋ
１３３ Ｇ Ａ　 Ｖ　 Ｉ　 ６４２ Ｃ Ａ　 Ｔ　 Ｔ
１７５ Ｇ Ａ　 Ｖ　 Ｉ　 ６４５ Ｇ Ｃ　 Ｍ　 Ｉ
２０６ Ｇ Ａ　 Ｒ　 Ｋ　 ６５１ Ｔ Ｃ　 Ｓ　 Ｓ
２４６ Ｔ Ｃ　 Ｆ　 Ｆ　 ６６０ Ｃ Ｔ　 Ｈ　 Ｈ
２５５ Ｔ Ｃ　 Ｎ　 Ｎ　 ６９３ Ｔ Ｃ　 Ｌ　 Ｌ
２６４ Ｃ Ｇ　 Ｇ　 Ｇ　 ７１４ Ｔ Ｃ　 Ｎ　 Ｎ
２８５ Ｔ Ｃ　 Ｆ　 Ｆ　 ７５３ Ｃ Ｇ　 Ｌ　 Ｌ
２８８ Ａ Ｇ　 Ｅ　 Ｅ　 ７７７ Ｔ Ｃ　 Ｓ　 Ｓ
３１６ Ｃ Ａ　 Ｑ　 Ｋ　 ８５０ Ａ Ｃ　 Ｉ　 Ｌ
３１９ Ａ Ｇ　 Ｓ　 Ｇ　 ９５１ Ｇ Ａ　 Ｅ　 Ｅ
３６４ Ｃ Ａ　 Ｒ　 Ｒ　 ９５３ Ｔ Ｇ　 Ｆ　 Ｃ
３６９ Ｃ Ｔ　 Ｇ　 Ｇ　 ９５６ Ｃ Ｇ　 Ｔ　 Ｓ
３９０ Ｃ Ｔ　 Ｄ　 Ｄ　 ９６２ Ａ Ｇ　 Ｈ　 Ｒ
４１５ Ａ Ｃ　 Ｒ　 Ｒ　 ９６８ Ｃ Ｔ　 Ｔ　 Ｉ
４３８ Ｔ Ｃ　 Ｆ　 Ｆ　 ９７３ Ｃ Ｔ　 Ｈ　 Ｙ
图３　西尔斯山羊草ＰＡＰ１ 氨基酸序列与其近缘物种间ＰＡＰ１ 氨基酸序列比对
Ｆｉｇ．３　 Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＡｅＳｅＰＡＰ１　ｗｉｔｈ　ＰＡＰ１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｌｏｓｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ
·８０１· 西　北　农　业　学　报 ２３卷
山羊草ＰＡＰ１与普通小麦ＰＡＰ１氨基酸序列一致
性最高，说明二者亲缘关系最近。
２．４　ＡｅＳｅＰＡＰ１编码蛋白的理化性质及结构分析
西尔斯山羊草紫色磷酸酶ＰＡＰ１ 基因编码
的蛋白质含氨基酸３３５个，与小麦ＰＡＰ１ 基因有
１６处编码的氨基酸残基不同，二者序列一致性达
９４．６６％。西尔斯山羊草ＰＡＰ１ 基因编码的蛋白
质的等电点５．５５，分子质量为３７．９５ｋｕ。蛋白质
氨基酸序列保守结构域分析表明，这２个蛋白一
致。根据该蛋白的一级结构进行疏水作图发现平
均疏水性分析显示负峰值个数多于正峰值个数，
说明ＡｅＳｅＰＡＰ１ 为亲水性蛋白，属于可溶性蛋白
（图４－Ａ）；对编码蛋白进行二级结构预测发现α
螺旋、延伸链以及无规则卷曲分别占１５．２％、
２７．５％和５７．３％。对该编码蛋白进行三级结构
预测（图４－Ｂ）发现，该蛋白含有金属离子结合中
心，预测它属于金属蛋白，这与前人的研究一致。
２．５　ＡｅＳｅＰＡＰ１ 编码蛋白的跨膜与信号肽分析
蛋白跨膜区域和信号肽序列分析结果显示，
ＡｅＳｅＰＡＰ１ 在在１～３０氨基酸之间含有１个跨膜
结构域（图５－Ａ）和１个信号肽（图５－Ｂ），说明Ａｅ－
ＳｅＰＡＰ１ 编码的蛋白质属于膜蛋白，预测其可能
为分泌蛋白，经亚细胞定位发现其作用于细胞外
（包含细胞壁）的概率最高，预示植株根系表达的
ＡｅＳｅＰＡＰ１ 可以分泌到植物根际周围以充分利用
根际土壤中的有机态磷，这与上述跨膜区、信号肽
的预测结果一致。但是 ＡｅＳｅＰＡＰ１蛋白的具体
功能，还有待进一步探究。
Ａ．疏水性分析　Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｂ．三维结构预测　３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ
图４　ＡｅＳｅＰＡＰ１ 编码蛋白的结构分析
Ｆｉｇ．４　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＡｅＳｅＰＡＰ１
Ａ．跨膜结构域分析　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｄｏｍａｉｎ；Ｂ．信号肽分析　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ
图５　ＡｅＳｅＰＡＰ１ 的功能预测
Ｆｉｇ．５　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｏｆ　ＡｅＳｅＰＡＰ１
·９０１·１０期 侯立江等：西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基因的克隆及分析
２．６　不同植物紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基因系统
进化分析
将获得的西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶Ａｅ－
ＳｅＰＡＰ１ 基因氨基酸序列与 ＧｅｎＢａｎｋ蛋白质数
据库进行氨基酸序列同源性（Ｂｌａｓｔ）比对，发现与
小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌ－
ｇａｒｅ）、短柄草（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、高粱
（Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ）、水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、谷子
（Ｓｅｔａｒｉａ　ｉｔａｌｉｃａ）、玉米（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）、山羊草属的
节节麦（Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉｉ）等的ＰＡＰ１ 基因有较
高的同源性，这些基因的一致性都在７０％以上。
基于氨基酸序列的系统进化树分析（图６）表明，
西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＡｅＳｅＰＡＰ１ 基因
与普通小麦的亲缘关系最接近，与玉米、大麦、短
花药野生稻、谷子亲缘关系较近，与水稻、高粱、二
穗短柄草、乌拉尔图小麦和节节麦等植物的亲缘
关系较远。
图６　西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基因的分子进化分析
Ｆｉｇ．６　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＡｅＳｅＰＡＰ１　ｇｅｎｅ
３　讨 论
小麦是中国乃至世界上主要的粮食作物，在
农业生产中占有重要的地位。随着社会的发展，
小麦产量越来越受到世界的关注。生产上，为提
高小麦产量，人类大量施用磷肥，这不但增加农业
生产的成本，也加剧不可再生磷矿资源的耗竭，而
且也造成水体富营养化和生态环境的污染。因
此，培育磷高效的转基因作物既可节约生产成本，
又可改良生态环境，是解决磷营养问题的有效途
径之一。
野生植物经过长期进化，其抗逆性状得到改
善和保留。为获得和利用这些的抗逆种质，人们
往往利用远缘杂交等手段，获得生产中可以利用
的材料。西尔斯山羊草就是抗逆性研究方面的一
种重要的种质材料，由于其长期野生，必然适应自
然环境下的低磷环境，因此它拥有耐低磷的抗性。
紫色酸性磷酸酶（ＰＡＰ）是植物在低磷环境中分泌
的一种磷酸酶。已有的研究表明，在植物中，
ＰＡＰ为约５５ｋｕ的同源二聚体，属高分子量ＰＡＰ
类群，与其结合的金属离子为 Ｆｅ３＋ －Ｚｎ２＋ 或
Ｆｅ３＋－Ｍｎ２＋ ［１６－１９］；体外的生化酶催化分析表明，
它们能水解多种含磷底物，但不同ＰＡＰ对含磷底
物的作用有选择性［２０－２２］。植物受低磷胁迫诱导时
ＰＡＰ会大量表达，并分泌到根际土壤中水解根
际土壤中的磷脂化合物释放出Ｐｉ供植物利用，李
·０１１· 西　北　农　业　学　报 ２３卷
东屏等［２３］从拟南芥中克隆到的７个ＡｔＰＡＰ 中，
有２个基因是与磷饥饿应答紧密相关的。
　　本研究从小麦近属植物西尔斯山羊草中克隆
获得酸性磷酸酶ＡｅＳｅＰＡＰ１ 基因。该基因ｃＤ－
ＮＡ序列组成与已报道的小麦紫色酸性磷酸酶
ＰＡＰ１ 基因高度同源，两者在ｃＤＮＡ碱基的同一
性为９５．８３％，但是在ｃＤＮＡ的编码区存在多处
单核苷酸多态性 （Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒ－
ｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）差异，编码的氨基酸发生了非同义突
变。由此推测这些ＳＮＰ差异引起西尔斯山羊草
９０７６与小麦耐低磷能力的差异，这就为进一步探
索和改善小麦耐低磷机理奠定了基础。
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ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｎｅｗ　ｈｅｓｓｉａｎ　ｆｌｙ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ（Ｈ３０）ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ
ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｇｒａｓｓ　Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｔｒｉｕｎｃｉａｌｉｓ　ｔｏ　ｈｅｘａｐｌｏｉｄ
ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ，２００３，１０６：１２４８－１２５５．
［２１］　ＲＵＮ　Ｈａｉｌｉ（闰海丽）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ａｖａｉｌａｂｉｌ－
ｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｗｈｅａｔ　ｇｅｎｏ－
ｔｙｐｅｓ［Ｄ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉ－
ｅｎｃｅｓ（中国农业科学院），２００７（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ
ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［２２］　ＣＨＡＮＧ　Ｓｈｅｎｇｈｅ（常胜合），ＳＨＵ　Ｈａｉｙａｎ（舒海燕），
ＴＯＮＧ　Ｙｉｐｉｎｇ（童一平）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｗｈｅａｔ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．
Ａｃｔａ　Ｂｏｔａｎｉｃａ　Ｂｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉａ　Ｓｉｎｉｃａ（西北植物学报），
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ｓｔｒａｃｔ）．
［２３］　ＬＩ　Ｄｏｎｇｐｉｎｇ（李东屏），ＷＡＮＧ　Ｄａｏｗｅｎ（王道文）．Ｒｅｓｐｏｎ－
ｓｅｓ　ｏｆ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｐｕｒｐｌｅ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐ－
ｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ（ＡｔＰＡＰ）ｔｏ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（生命科学研究），２００３，７（１）：６５－６９（ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
·１１１·１０期 侯立江等：西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶ＰＡＰ１ 基因的克隆及分析