全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(3): 517525 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10Z1E6和 2008AA10Z147), 引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目(2006-Q04)
和中国博士后科学基金资助项目(20090460717)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 李加纳, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: drlukun@swu.edu.cn; kkccaing@163.com **共同第一作者
Received(收稿日期): 2009-09-18; Accepted(接受日期): 2009-12-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00517
甘蓝和白菜紫色酸性磷酸酶 17基因家族的克隆和比较分析
卢 坤 1,2 张 凯 1,2,** 柴友荣 1,2 陆俊杏 1,2 唐章林 1,2 李加纳 1,2,*
1 西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400716; 2 重庆市油菜工程技术研究中心, 重庆 400716
摘 要: 从甘蓝和白菜中分别克隆到 2个 PAP17, 根据序列相似性, 将 PAP17分为类型 I (BoPAP17-1和 BrPAP17-1)
和类型 II (BoPAP17-2和 BrPAP17-2)。Southern杂交表明, 白菜和甘蓝中均只存在 2个 PAP17成员, 与克隆结果吻合。
系统发育和分子进化分析表明, PAP17基因家族受纯化选择, 编码低分子量 PAP蛋白。荧光定量 PCR结果表明, PAP17
在所检测的 9个组织器官中均有表达, 尤以花和蕾中的表达量特别高, 种子中也有一定程度的表达, 表明其与体内储
备态磷的动用有关, 尤其在花和蕾的发育阶段。磷饥饿诱导表达结果表明, 除 BrPAP17-2 在幼苗叶片中表达受抑制
外, BrPAP17和 BoPAP17在幼苗根部和叶片中均受磷饥饿诱导, 表达量先降后升, 诱导 4 d或 8 d后达到峰值; 恢复
供磷 4 d 后, 表达量迅速降低至基础表达水平以下。与幼苗叶片相比, 白菜和甘蓝幼苗根部的 PAP17 磷饥饿诱导表
达似乎更为强烈。这些结果表明 PAP17在白菜和甘蓝根部可能参与了根外磷的活化与吸收及无机磷由根部向其他组
织器官的转运。
关键词: 白菜; 甘蓝; 紫色酸性磷酸酶; 基因家族; 磷饥饿
Cloning and Comparative Analysis of PURPLE ACID PHOSPHATASE 17 Gene
Families in Brassica oleracea and Brassica rapa
LU Kun1,2, ZHANG Kai1,2,**, CHAI You-Rong1,2, LU Jun-Xing1,2, TANG Zhang-Lin1,2, and LI Jia-Na1,2,*
1 College of Agronomy and Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Chongqing Rapeseed Technology Research Center,
Chongqing 400716, China
Abstract: Two PAP17 genes were cloned from parent species of Brassica napus, B. oleracea, and B. rapa, respectively. Accord-
ing to sequence similarity, PAP17 genes could be divided into two types, type I (BoPAP17-1 and BrPAP17-1) and type II
(BoPAP17-2 and BrPAP17-2). Southern hybridization resulted in two bands both in B. oleracea and B. rapa, this is accordance
with former cloning results. Phytogenetic and molecular evolution analysis indicated that PAP17 genes in Brassica species un-
derwent purifying selection, and their deduced proteins are typical low molecular weight PAP proteins. Expression patterns of
BoPAP17 and BrPAP17 genes were assayed by fluorescent quantitative PCR. The results revealed that PAP17 genes expressed in
all nine tested tissues and organs, with the extremely high expression in flower and bud, and certain expression in seeds at differ-
ent stages, implying these PAP17 genes most likely mobilize phosphorus reserves in plants, particularly during flower and bud
development stages. Under phosphate starvation conditions, expression of BrPAP17-2 in seedling leaf was restrained, while that
of BrPAP17 and BoPAP17 in seedling root and leaf was induced, the expression levels declined in the first 24 hours, and then
continuously increased with the maximal levels between four days and eight days after treatment. After four days of Pi-resupply,
their expression declined below un-induced basal levels. In comparison with seedling leaf, it seems that BrPAP17 and BoPAP17
showed stronger phosphate starvation induced expression in seedling root. These results thus suggested that PAP17 genes in B.
oleracea and B. rapa may be involved in external phosphorus assimilation and transferring inorganic phosphate from root to other
tissues or organs.
Keywords: Brassica rapa; Brassica oleracea; Purple acid phosphatase; Gene family; Phosphate starvation
518 作 物 学 报 第 36卷
酸性磷酸酶(acid phosphatase, APase, EC 3.1.3.2)能在
弱酸条件下水解活化磷酸酯、磷酸酐释放出无机磷(Pi),
满足植物的生长需要。在低磷环境中 , 植物根系分泌的
APase显著增加, 对土壤中 Pi的活化、转运及植物体内的
再循环具有重要作用[1]。拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因
组中共存在 44个 APase, 其中有 29个为紫色酸性磷酸酶
(purple acid phosphatase, PAP), 表明PAP是一种十分重要的
APase[2]。
目前, PAP已经从多种动物、植物和细菌中分离得到。
哺乳动物中, 牛的脾脏和骨头、猪子宫、人的脾脏、骨头、
肺泡巨噬细胞和胎盘、小鼠的脾脏、骨头和表皮组织中均
已发现 PAP的存在, 它们可能参与铁的转运、骨的吸收和
矿化、自由基呈现以及一些氧化还原作用[3]。细菌中分离
的 PAP不多, 仅从无花果曲霉(Aspergillusficuum)、粗糙脉
孢霉(Neurospora crassa)、微球菌(Micrococcus sodenensis)
分离到了 PAP, 但是对其功能还不是很清楚[3]。自拟南芥
中的 29个 AtPAP被分离得到以后, 植物 PAP的研究也已
经受到越来越多的关注[2]。到目前为止, 又从药用牛舌草
(Anchusa officinalis)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、大豆
(Glycine max)、甘薯(Ipomoea batatas)、黄羽扇豆(Lupinus
luteus)、紫萍(Landoltia punctata)、苜蓿(Medicago trun-
catula)、烟草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)、芸
豆(Phaseolus vulgaris)、马铃薯(Solanum tuberosum)和菠菜
(Spinach convolvulaceae)中也分离出了不少 PAP基因, 并
证明了它们在植物适应低磷环境中起着重要作用[4-10]。例
如, 超量表达 MtPAP1 的拟南芥转基因植株的生物学产
量、植株无机磷含量和全磷含量明显高于野生种; 在大豆
中超量表达 AtPAP15 也同样显著提高了植株的磷利用效
率, 表明某些 PAP 基因的确具有改善植株的磷营养状况
的能力[9-10]。
甘蓝(Brassica oleracea)和白菜(Brassica rapa)是芸薹
属内重要的绿化和蔬菜作物 , 也是甘蓝型油菜的亲本物
种。由于上述 3个物种的主产区均存在有效磷缺乏和储备
态磷富集的特点, 因此 PAP 将土壤中被固定的储备态磷
活化为 Pi, 以提高土壤中磷的利用效率具有重要意义。本
研究在甘蓝型油菜 PAP17 基因家族的研究基础上, 克隆
了甘蓝和白菜的 PAP17基因, 并对其基因结构、基因家族
进化特点和不同成员组织表达特异性和磷饥饿诱导表达
模式进行了比较, 为进一步研究 PAP17 基因家族成员在
各物种中的生物学功能及在适应低磷条件中的作用奠定
了基础。
1 材料与方法
1.1 材料处理
甘蓝品系 O-172 和白菜品系 C-333 由日本东北大学
芸薹属种质资源库提供。经过初步鉴定, 上述甘蓝和白菜
品系的磷利用效率无明显差异。供式材料于 2007 年 10
月至 2008 年 5 月种植于重庆市油菜工程技术研究中心歇
马试验基地。取常规栽培条件下甘蓝和白菜的根、茎、叶、
蕾、花、荚果皮及花后 15、30和 45 d的种子保存于–80℃。
以 Hoagland营养液水培幼苗, 4周后用于磷饥饿(0.5 μmol
L–1 KH2PO4)诱导处理。对诱导 0、12、24 h和 2、4、8 d
及磷饥饿处理后恢复供磷 4 d的幼苗根部和叶片分别取样,
用于总 RNA抽提。
1.2 核酸提取
利用幼嫩叶片, 采用 CTAB法进行总 DNA的提取[11]。
采用柱式小量植物总 RNA 抽提试剂盒(WATSON, Shang
hai)提取总 RNA, 并用 DNase I Digesting Set (WATSON,
Shanghai)去除总 RNA中的痕量 DNA。
1.3 BoPAP17和 BrPAP17基因家族的克隆
根据甘蓝型油菜 BnPAP17 基因家族的研究结果, 利
用上游引物 FPAP17-9 (5-TCAATCATCATCATTCACCAT
TCTCC-3) 和 FPAP17-12 (5-ATCATCATCCTTCGCAC
CTTAACC-3), 下游引物 RPAP17-9 (5-AATGCATTTGA
CTATAACATTAAGAAGATAATC-3)和 PAP17-19 (5-GA
TAGGGATGCTAAACTTATCTTAAATATATG-3), 两两组
合扩增 BoPAP17 和 BrPAP17 基因家族各成员的全长
cDNA和 DNA序列。以等量混合的不同组织器官总 RNA
(5 μg)为模板, 采用 SuperScript III反转录酶(Invitrogen)合
成 cDNA第一链。PCR程序均为 94℃变性 2 min; 94℃变
性 1 min, 56℃退火 1 min, 72℃延伸 2 min, 35个循环; 最
后 72℃延伸 10 min。将 PCR 扩增的目的片段经过 1.0%
(W/V)的琼脂糖凝胶电泳检测后, 回收并连接到 pMD18-T
载体(TaKaRa)上, 转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α
感受态细胞, 筛选阳性克隆测序。
1.4 Southern杂交
以 Dra I、EcoR I和 EcoR V (New England Biolabs,
USA) 3种限制性内切酶分别酶切 60 μg基因组 DNA。完
全酶切的 DNA 经过 0.8%(W/V)琼脂糖凝胶电泳后, 用毛
细管法转膜至带正电荷的尼龙膜(Roche)上。Southern 杂
交的探针片段和杂交温度参照 BnPAP17 基因家族的研究
方法[11]。
1.5 芸薹属 PAP17基因家族的生物信息学和进化分析
在 Vector NTI 10.3软件上进行序列比对、开放阅读
框 (open reading frame, ORF)查找和翻译。在 NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上进行核酸和蛋白质的
Blast 分析。采用 K-Estimator 6.1软件计算非同义突变率
(nonsynonymous substitution rate, Ka)、同义 突变率
(synonymous substitution rate, Ks)和Ka/Ks [12]。利用MEGA
4.0软件, 采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统发育
树[13]。
1.6 荧光定量 PCR检测 BoPAP17和 BrPAP17的表达模式
取 RNA 样品各 1 μg 为模板, 以 Oligo dT-Adaptor
Primer进行反转录(TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0), 合成
总 cDNA第一链。采用 TaKaRa公司的 SYBR Premix Ex
Taq及 Stratagene Mx3000P荧光定量 PCR仪进行 PCR产
第 3期 卢 坤等: 甘蓝和白菜紫色酸性磷酸酶 17基因家族的克隆和比较分析 519
物实时荧光检测。使用 AlleleID 7.0软件设计实时 PCR引
物。BoPAP17-1 和 BrPAP17-1 的检测引物为 FPAP17-1qS
(5-GTATATCTGCACAACCGTAGTCG-3), RPAP17-1qS
(5-CCCATCTGATAAGCGACTTTAGAC-3), 扩增片段长
150 bp; BoPAP17-2和 BrPAP17-2的检测引物为 FPAP17-
2qS (5-CGTCCCGGAACTCTTATG-3), RPAP17-2qS (5-
CAACTAGCTCAACAGTGTTTC-3), 扩增片段长 141 bp;
内参基因为 18S, 引物为 F18qS (5-AACCAAACATCTC
ACGACAC-3), R18qS (5-GCAAGACCGAAACTCAAA
G-3), 扩增片段长 193 bp。扩增程序为 94℃ 2 min; 94℃
30 s, 60℃ 1 min, 72℃ 30 s, 40个循环; 融解曲线测定为从
55℃到 95℃。每个试验设 3次重复, 数据由 MxPro QPCR
软件分析。
2 结果与分析
2.1 BoPAP17和BrPAP17基因家族成员的克隆和序列分析
通过上游和下游引物的两两组合 , 以引物对 FPA-
P17-9/PAP17-19 成功地从甘蓝和白菜中扩增出 BoPA-
P17-1和 BrPAP17-1, 以引物对 FPAP17-12/RPAP17-9成功
扩增出 BoPAP17-2和 BrPAP17-2。通过多重比对分析表明,
上述 4个 PAP17与 AtPAP17和 4个 BnPAP17家族成员一
样, 均包含 3个外显子和 2个内含子, 所有内含子均遵循
标准的 GT⋯⋯AG剪接方式(见附录)[14]。
根据基因结构特点, 将 BoPAP17 和 BrPAP17 基因家
族成员分为两种类型(表 1)。类型 I 包括 BoPAP17-1 和
BrPAP17-1, 它们之间具有很高的相似性, 其 3UTR 序列
完全相同, ORF(包含终止密码子 TGA)的长度均为 1 114
bp, 而 5UTR 的长度和 G+C 含量相对较大。上述两个成
员的 cDNA序列分别与 BnPAP17-1和 BnPAP17-4 (另文发
表)具有 98.5%和 99.1%的一致性, 与 AtPAP17 cDNA序列
的一致性分别为 80.8%和 80.3%, 远低于芸薹属内 PAP17
家族类型 I成员间的相似性。类型 I PAP17基因编码 337
个氨基酸残基 , 内部成员间蛋白序列的一致性和相似性
分别为 98.2%~99.1%和 98.8%~99.4%, 与AtPAP17的一致
性和相似性分别为 85.2%~86.1%和 90.2%~90.8%。类型 II
包括 BoPAP17-2和 BrPAP17-2, 它们之间同样具有极高的
相似性, 其 5UTR 和 ORF 长度完全一致, 分别为 160 bp
和 1 002 bp, G+C含量差异较小; 3UTR的长度和 G+C含
量差异很小。上述两个成员的 cDNA 序列与 BnPAP17-3
和 BnPAP17-2的一致性分别为 99.9%和 99.0%, 仅有少数
碱基差异。而它们与 AtPAP17 cDNA序列的一致性分别仅
为 76.2%和 76.6%, 低于类型 I成员与 AtPAP17的相似性。
类型 II PAP17基因编码 333个氨基酸残基, 内部成员间蛋
白序列一致性和相似性分别为 98.8%~100.0%和 99.4%~
100.0%, 与 AtPAP17 的一致性和相似性分别为 82.8%~
83.4%和 88.2%~88.8%, 与核酸序列的相似性趋势一致。
2.2 Southern杂交检测分析
甘蓝和白菜的基因组经 Dra I酶切后的杂交条均为 2
条, 经过 EcoR I酶切后的杂交条带均为 1条, 而 EcoR V
酶切后杂交条带甘蓝为 2 条, 白菜仅有 1 条(图 1)。因为
在 BoPAP17和 BrPAP17基因的探针区没有 Dra I、EcoR I
和 EcoR V的酶切位点, 而目前也分别从甘蓝和白菜中克
隆得到 2 个 PAP17 基因, 与 Southern 杂交的条带数吻合,
因此推断甘蓝和白菜的 Southern 杂交条带很可能就分别
代表从甘蓝和白菜中各自克隆到的 2个 PAP17成员。
2.3 芸薹属 PAP17基因家族的进化分析
根据计算, 芸薹属 PAP17 基因家族 Ks 为 0~0.5005,
Ka为 0.0012~0.0778, Ka/Ks为 0.027~0.180, 均小于 1, 表
明该基因家族的进化经历了纯化选择过程。采用 MEGA
4.0软件对芸薹属 PAP17蛋白与来自植物、动物和细菌的
同源 PAP 蛋白以 NJ 法构建了系统发育树(图 2)。从图中
可以看出, 芸薹属 PAP17蛋白分为两个类型。BoPAP17-1
和 BnPAP17-4, BrPAP17-1和 BnPAP17-1分别先聚类, 然
后再聚集形成类型 I 的分支。BoPAP17-2 和 BnPAP17-3,
BrPAP17-2和 BnPAP17-2分别先聚类, 然后再一起形成类
型 II 的分支。类型 I 和类型 II 聚集在一起形成芸薹属
PAP17 家族蛋白分支, 它们与 AtPAP17 聚类在一起形成
了十字花科 PAP17 蛋白分支。其他的植物低分子量(low
molecular weight, LMW) PAPs, 如 IbPAP (AAF60315)、
AtPAP8 (NP_973397)和 StPAP1 (AAT37529)等与十字花科
PAP17蛋白形成了植物 LMW PAPs类群。
2.4 BoPAP17和 BrPAP17基因家族成员的表达特性比较
荧光定量 PCR检测发现 BoPAP17和 BrPAP17在所检
表 1 BoPAP17和 BrPAP17基因核酸序列的基本特性
Table 1 Primary properties of nucleotide sequences of BoPAP17 and BrPAP17 genes
基因组
DNA
内含子
Intron
信使 RNA
mRNA
开放阅读框
ORF
5非翻译区
5UTR
3非翻译区
3UTR 基因
Gene 长度
Length
(bp)
位置及长度
Position and length
(bp)
GC含量
(G+C)%
长度
Length
(bp)
位置
Position
(bp)
GC含量
(G+C)%
长度
Length
(bp)
GC含量
(G+C)%
长度
Length
(bp)
GC含量
(G+C)%
BoPAP17-1 1451 I 374–480 (107) II 638–721 (84)
25.23
27.38 1260 173–1186 46.45 172 31.98 74 28.38
BoPAP17-2 1600 I 350–509 (160) II 667–757 (91)
21.25
35.16 1349 161–1162 46.41 160 33.75 187 27.81
BrPAP17-1 1429 I 361–469 (109) II 627–699 (73)
29.36
31.51 1247 160–1173 46.25 159 34.59 74 28.38
BrPAP17-2 1602 I 350–516 (167) II 674–752 (79)
20.96
31.65 1356 161–1162 46.71 160 34.38 194 28.35
I和 II分别表示内含子 1和内含子 2。 I and II represent intron 1 and intron 2, respectively.
520 作 物 学 报 第 36卷
图 1 Southern杂交检测白菜和甘蓝 PAP17基因家族成员数
Fig. 1 Detection of number of PAP17 genes in B. rapa and B.
oleracea by Southern blot
测的 9个组织器官中均有表达, 且表达模式在物种内部具
有更高的相似性 (图 3-A)。在白菜中 , BrPAP17-1 和
BrPAP17-2 均在花中的表达量最高, 然后是蕾, 而在茎、
叶和荚果皮中的表达量很低; 随着种子的成熟, 表达量也
呈下降趋势。在甘蓝中, BoPAP17-1和 BoPAP17-2在茎、
叶和荚果皮中的表达量也比较低, 与白菜的两个 PAP17
相似。不同的是, BoPAP17-1和 BoPAP17-2在蕾中的表达
量最高, 然后才是花, 且它们的表达量随着种子的成熟,
呈上升趋势。
白菜的两个 PAP17 成员在根中均受磷饥饿诱导, 但
表达量在诱导 12~24 h后先下降, 然后迅速上升, 并在诱
导 4 d后达到峰值, 继续诱导至 8 d, 表达量有小幅下降;
恢复供磷 4 d 后, 表达量迅速降低, 并降至基础表达水平
的 1/4 左右(图 3-B)。BrPAP17-1 在幼苗叶片和根中的表
达模式相似 , 但其诱导表达在 8 d 时才达到峰值。
图 2 BoPAP17和 BrPAP17蛋白与其他 PAP蛋白的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic relationship of deduced BoPAP17, BrPAP17 and related PAPs
拟南芥: AtPAP8 (NP_973397)、AtPAP12 (NP_180287)、AtPAP15(NP_187369)和 AtPAP17(NP_566587); 马铃薯: StPAP1(AAT37529); 芸豆:
PvPAP(AAF60317); 苜蓿: MtPAP1(AAX20028); 甘薯: IbPAP(AAF60315)和 IbPAP2(AAF19822); 水稻: OsPAP(AAM00197); 斑马鱼: LOC436725
(NP_001002452)和 DrACP5(NP_999938); 人: ACP5(P13686); 猪: Pig TRAP(P09889); 家鼠: Mouse AP5A(Q05117); 隐藏嗜酸菌: JF-5(ZP_01144272);
柄杆菌属: K31(ZP_01419115)。进化树由 NJ法构建。每个分支上的数值为自展检验值(1 000次重复), 只对大于 50%的值进行了标注。刻度标尺
表示每个氨基酸位点的估计替换数。
Arabidopsis thaliana: AtPAP8 (NP_973397), AtPAP12 (NP_180287), AtPAP15 (NP_187369), and AtPAP17 (NP_566587); S. tuberosum: StPAP1 (AAT37529);
P. vulgaris: PvPAP (AAF60317); M. truncatula: MtPAP1 (AAX20028); I. batatas: IbPAP (AAF60315) and IbPAP2 (AAF19822); O. sativa: OsPAP
(AAM00197); Danio rerio: LOC436725 (NP_001002452) and DrACP5 (NP_999938); Homo sapiens: ACP5 (P13686); Sus scrofa: TRAP (P09889); Mus mus-
culus: AP5A (Q05117); Acidiphilium cryptum: JF-5 (ZP_01144272); Caulobacter sp.: K31 (ZP_01419115). This tree is constructed by Neighbor-Joining
method. The number for each interior branch is the percent bootstraps value (1 000 replicates), and only values greater than 50% are shown. The scale bar indi-
cates the estimated number of amino acid substitutions per site.
第 3期 卢 坤等: 甘蓝和白菜紫色酸性磷酸酶 17基因家族的克隆和比较分析 521
图 3 荧光定量 PCR检测白菜和甘蓝 PAP17基因的表达模式
Fig. 3 Expression patterns of BrPAP17 and BoPAP17 genes by fluorescent quantitative PCR
A: 组织特异性表达; B: 白菜 PAP17基因的磷饥饿诱导表达; C: 甘蓝 PAP17基因的磷饥饿诱导表达; Ro: 根; St: 茎; Le: 叶; Bu: 蕾; Fl: 花; SP:
荚果皮; 10 d: 花后 10 d种子; 25 d: 花后 20 d种子; 40 d: 花后 40 d种子; R4 d: 恢复供磷后 4 d。
A: tissue specificities in various organs tested; B: Pi-starvation induced expression of BrPAP17; C: BoPAP17 genes; Ro: root; St: stem; Le: leaf; Bu:
bud; Fl: flower; SP: silique pericarp; 10 d, 25 d and 40 d: seed of 10, 25 and 45 d after flowering; R4 d: 4 days of Pi-resupply.
522 作 物 学 报 第 36卷
BrPAP17-2在幼苗叶片中诱导表达量均比基础表达低, 恢
复供磷后其表达量有一定上调 , 但仍然低于基础表达水
平。甘蓝中, BoPAP17-1和 BoPAP17-2在幼苗根部和叶片
中均受磷饥饿诱导, 且其表达模式均为先降后升, 在 8 d
达到诱导表达峰值(图 3-C)。不同的是, BoPAP17-1在幼苗
根部和叶片中的诱导表达水平均高于 BoPAP17-2, 且
BoPAP17-2在幼苗叶片的诱导表达水平明显高于根部。
3 讨论
比较基因组学研究表明芸薹属与拟南芥基因组呈岛
屿状的线性关系 [15], 它们的亲缘关系很近 , 起源于同一
原始祖先, 在大约 1700~1800万年前, 芸薹族植物发生了
基因组规模的三倍化[16-17]。根据三倍化假说, 二倍体基本
种白菜与甘蓝中各应有 3条与 AtPAP17对应的 PAP17, 而
本研究克隆和 Southern 杂交结果均表明白菜与甘蓝中均
只存在 2个 PAP17。可以推断, 芸薹属祖先中 PAP17位点
可能并未经历三倍化的过程, 或者三倍化后不久(甘蓝和
白菜分离之前, 约 400万年前)便丢失 1个 PAP17成员, 导
致现在甘蓝和白菜中均只有 2个 PAP17。
甘蓝型油菜是由二倍体物种白菜和甘蓝通过天然种
间杂交后再加倍而形成 , 其某一位点通常由成对的部分
同源基因构成, 一个来自白菜 AA 基因组, 另一个来自甘
蓝 CC基因组[18]。从系统发育树可以看出, 甘蓝型油菜与
其亲本物种白菜和甘蓝的 PAP17 基因间具有很好的对应
关系(BrPAP17-1与 BnPAP17-1, BrPAP17-2与 BnPAP17-2,
BoPAP17-1 与 BnPAP17-4, BoPAP17-2 与 BnPAP17-4), 这
些基因间的垂直同源性关系也进一步证明了甘蓝和白菜
的确为甘蓝型油菜遗传物质的供体 , 为揭示甘蓝型油菜
与其亲本物种间的进化关系提供了直观而具体的分子证据。
拟南芥中, AtPAP在营养器官中的表达模式差异较大,
但它们均在花中表达, 表明 PAP 在花和种子发育中具有
重要作用[19]。GUS染色表明, AtPAP15在种子发育早期和
花粉萌发中强烈表达, 而在根毛和表皮细胞中不表达, 暗
示其很可能与植物体内贮存磷的活化有关 , 与植物体外
磷的活化吸收无关[6]。AtPAP17在衰老叶片中表达量最高,
然后是花, 而在荚果、根和茎中表达很弱[5]。本研究中, 白
菜和甘蓝 PAP17 主要在花和蕾中表达 , 与甘蓝型油菜
BnPAP17的结果一致[8], 与 AtPAP15的表达模式也较为相
似 , 推测它们也很可能在花和蕾中参与植物体内储备态
磷的动用。此外, 白菜和甘蓝 PAP17基因的磷饥饿诱导表
达水平随着诱导时间先降后升(BrPAP17-2除外), 并在 4 d
或 8 d达到峰值, 恢复供磷后表达水平迅速下降到基础表
达水平以下, 与 AtPAP17 和 BnPAP17 基因的磷饥饿诱导
表达趋势基本一致。与幼苗叶片相比, 幼苗根部的白菜和
甘蓝 PAP17 基因磷饥饿诱导表达似乎更为强烈 , 表明
PAP17 基因在根部可能参与了植物根外磷的活化与吸收
及无机磷由根部向其他组织器官(如叶片)的转运, 对提高
植物的磷利用效率和对低磷环境的适应能力具有重要的
意义。
根据基因结构, 笔者将 PAP17 基因分为两种类型(类
型 I和类型 II), 从表达模式上来看, 各类型内部成员之间
的表达模式存在差异 , 而各物种内部成员之间的表达模
式却更为相似。这可能与白菜和甘蓝进化过程中的分离有
关。在白菜和甘蓝的祖先种中, PAP17基因家族成员可能
具有相似的表达模式; 白菜和甘蓝分离以后, 为了适应不
同环境的需要, PAP17基因的表达模式产生了物种间的分
化, 同时保持了物种内部的相似性。这种现象为研究进化
过程中近缘物种间基因家族水平的基因结构和基因功能
之间的关系提供了重要线索。
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附录: 白菜和甘蓝 PAP17基因核苷酸序列多重比对
Appendix: Multi-alignment of nucleotide sequences of PAP17 genes in B. rapa and B. oleracea
524 作 物 学 报 第 36卷
第 3期 卢 坤等: 甘蓝和白菜紫色酸性磷酸酶 17基因家族的克隆和比较分析 525