全 文 ：华北农学报·2015，30(2) :35 -40
收稿日期:2015 － 01 － 20
基金项目:西北农林科技大学基本科研业务费项目(QN2011003) ;唐仲英育种基金项目
作者简介:侯立江(1989 －) ，男，陕西渭南人，在读硕士，主要从事作物遗传育种研究。侯立江、牛娜为同等贡献作者。
通讯作者:王军卫(1972 －) ，男，陕西佳县人，副研究员，博士，主要从事作物遗传育种研究。
双角山羊草紫色酸性磷酸酶 PAP1 基因
的克隆及生物信息学分析
侯立江，牛 娜，马守才，王 强，宋亚珍，张改生，王军卫
(西北农林科技大学，国家杨凌农业生物技术育种中心，国家小麦改良中心杨凌分中心，
小麦育种教育部工程研究中心，陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室，陕西 杨凌 712100)
摘要:通过对双角山羊草紫色酸性磷酸酶 PAP1 基因的核酸和氨基酸序列进行相关生物信息学分析，旨在进一步
利用基因工程手段将 AeBiPAP1 基因转入到小麦中，为获得耐低磷胁迫能力增强的小麦品种提供种质基因。以双角
山羊草叶片为材料，根据小麦中的 PAP1 基因和二穗短柄草的 PAP1 基因设计兼并引物，采用同源克隆的方法，获得了
双角山羊草紫色酸性磷酸酶 PAP1 基因的 cDNA序列，并将其命名为 AeBiPAP1，该双角山羊草紫色酸性磷酸酶 PAP1
基因长 1． 124 kb，共编码 335 个氨基酸，相应的氨基酸分子量为 38． 131 kDa，等电点为 5． 77。与小麦中的 PAP1 基因
相比，双角山羊草 PAP1 的 cDNA编码区发生碱基替代的地方共有 35 处，包含 13 处颠换与 22 处转换，有 15 处编码的
氨基酸残基不同，其序列一致性达 95． 52%。对 AeBiPAP1 基因编码的蛋白质进行生物信息学分析发现，该蛋白具有
一个信号肽但却没有跨膜结构，对 AeBiPAP1 编码蛋白进行三级结构预测发现，该编码蛋白包含金属离子结合中心，
预测它属于金属蛋白。因此，将其定位于质膜比分泌到胞外的概率要高，通过对同源蛋白质氨基酸序列进行系统进
化树分析，结果表明，双角山羊草紫色酸性磷酸酶 PAP1 基因与普通小麦的亲缘关系最近，与粳稻、短柄草、谷子亲缘
关系较近，与大麦、乌拉尔图小麦、水稻以及节节麦等植物的亲缘关系较远。
关键词:双角山羊草;紫色酸性磷酸酶;耐低磷基因
中图分类号:Q78;Q943． 2 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2015)02 － 0035 － 06
doi:10． 7668 /hbnxb． 2015． 02． 007
Cloning and Sequence Analysis of Purple Acid Phosphotase PAP1
Gene from Aegilop bicornis
HOU Li-jiang，NIU Na，MA Shou-cai，WANG Qiang，SONG Ya-zhen，
ZHANG Gai-sheng，WANG Jun-wei
(Northwest A ＆ F University，National Yangling Agricultural Biotechnology ＆ Breeding Center，Yangling
Branch of State Wheat Improvement Center，Wheat Breeding Engineering Ｒesearch Center，Ministry
of Education，Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province，Yangling 712100，China)
Abstract:This work would help for wheat breeding that we could get some low phosphorus tolerance germplasm
resources via the methods of the genetic transformation of AeBiPAP1 into wheat cultivals． In this study，PAP1 gene
was cloned from Aegilop bicornis with designed primers according the sequence of PAP1 genes from wheat and
slender falsebrome based on homologous cloning method and named AeBiPAP1． The cloned AeBiPAP1 gene was 1． 124 kb
in size and encoded 335 amino acids，with molecular weight of 38． 131 kDa and isoelectric point 5． 77． Sequence
alignment of AeBiPAP1 with PAP1 of wheat showed that there were 35 single nucleotide polymorphisms，22 locus
transitions and 13 locus transversion and AeBiPAP1 had high homology to PAP1 of wheat with the identities of
95. 52% ． Amino acid sequence alignment showed that 15 deduced amino acids of AeBiPAP1 were different from
PAP1 of wheat． Bioinformatics analysis of AeBiPAP1 gene encoding protein found that the protein has a signal pep-
36 华 北 农 学 报 30 卷
tide but have not the across-membrane structure and the AeBiPAP1 coding protein with tertiary structure prediction
found that the encoded protein contains the metal ions center predicted it belongs to the metal protein． Besides，its
possibility of localization in the plasma membrane is higher than being secreted to outside of the cell，the phylogenic
tree results showed that PAP1 gene from Aegilop bicornis shared high similarities to the previously reported PAP1
genes from other plants，such as Triticum aestivum，Brachypodium distachyon，and Setaria italica，among them，AeBi-
PAP1 gene shared the highest similarities to PAP1 gene from Triticum aestivum．
Key words:Aegilop bicornis;Purple acid phosphotase;Low phosphorus tolerance gene
磷(Pi)是植物体内重要的化学元素之一，它参
与了植物细胞内核酸、ATP 等的合成和蛋白质磷酸
化和去磷酸化等生化反应，是植物正常生长发育不
可或缺的元素。目前，土壤缺磷是作物生产的限制
因素之一。据统计，全世界耕地土壤缺磷面积约占
40%，然而，磷肥施入土壤，易被固定，加之植物本身
只能吸收水溶性磷且作物当季磷肥利用率较低，仅
有 10% ～ 25%［1 － 2］，长期施用磷肥，不仅加剧了磷
资源的消耗，而且破坏了生态环境。
当植物体受到缺磷胁迫时，其自身会产生一系
列的应激反应，帮助植物适应低磷环境。这一系列
的应激反应主要包括:根构型的改变、磷信号途径的
改变、体内磷代谢的改变和紫色酸性磷酸酶(Purple
acid phosphatase，PAP)的分泌。紫色酸性磷酸酶属
于金属磷酸酯酶家族，它含有异价双核金属，主要功
能为催化磷酸酯或酸酐水解成无机磷酸根，紫色酸性
磷酸酶的分泌可以帮助植物将不能吸收的有机磷转
换为可吸收态的无机磷，从而缓解植株的缺磷状况。
随着植物基因组序列库的不断丰富，一系列的
紫色酸性磷酸酶基因已经被分离和鉴定，相信后面
还会有大量后续的研究结果被报道。Li 等［3］对拟
南芥的 7 个 PAP 在低磷胁迫下的表达特征做了研
究，发现有 2 个 PAP被诱导上调表达。肖凯等［4］在
研究拟南芥 2 号染色体时发现 7 个 PAPs，其中有 2
个为低磷诱导表达的。卢坤等［5］从甘蓝和白菜中
分别克隆到 2 个 PAPs，并且发现这 2 个 PAPs 在白
菜和甘蓝根部诱导表达量上调，预测其可能参与了
根际周围磷的分解和吸收以及转运等过程。Ma
等［6］、Wang等［7］将不同的 PAP1 转入不同植物后发
现，转 PAP1 基因植株的生物产量较野生型有所提
高，植株利用有机态磷的能力得到明显改善。
本研究从小麦(Triticum aestivum)的近属植物
双角山羊草中克隆出一个 PAP1 基因，并对该 PAP1
基因序列及氨基酸序列进行了相关的分子生物学分
析，目的在于为进一步利用基因工程的手段将该
PAP1 基因转入到普通小麦中，获得耐低磷胁迫能力
增强的小麦品种，同时，也为研究 PAPs 家族进化提
供宝贵的基因资源。
1 材料和方法
1． 1 材料与试剂
双角山羊草 9062 由西北农林科技大学，陕西省
作物杂种优势研究与利用重点实验室提供。所需感
受态细胞大肠杆菌(E． coli)菌株 DH5α 及其他试剂
(Tap酶、T4 连接酶和载体 PMD-19 vector)均购于
TaKaＲa公司。引物合成及测序由 Invitrongen 公司
完成，TＲIzol 提取液及反转录试剂盒也均购于 In-
vitrongen公司。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 ＲNA提取与 cDNA 合成 将新鲜的双角山
羊草 9062 叶片置于研钵中加液氮研磨，参照 TＲIzol
试剂盒及反转录试剂盒说明书，提取总 ＲNA并进行
反转录过程，cDNA 第一链合成过程使用的反转录
酶为 M-MLV酶(购于 Invitrongen公司)。
1． 2． 2 双角山羊草紫色磷酸酶基因 PAP1 的克隆
依据小麦 PAP1 基因(基因登录号:AB51886． 1)
和二穗短柄草 PAP1 基因(基因登录号:XM _
003558353． 1)的 cDNA序列，合成兼并引物，其正向
引物为 5-CGGCCAGCAGCCATGGCGAG-3，反向引
物为 5-CCTCATTYTKCAGTGACATA-3。以双角山
羊草反转录得到的 cDNA 为模板进行 PCＲ 扩增。
总 PCＲ体系为 25 μL:10 × PCＲ Buffer 2． 5 μL，正向
和反向引物(10 mmol /L)各 1． 5 μL，dNTPs(2 mmol /L)
0． 5 μL，cDNA 模板 2 μL，Taq DNA 聚合酶(5
U /μL)0． 2 μL，补加 ddH2O 16． 8 μL。PCＲ 反应程
序为:95 ℃预变性 3 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，
72 ℃ 1 min，35 个循环;72 ℃延伸 10 min，4 ℃保
存。PCＲ产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的
条带并连接至 pMD19-T 载体，转化感受态细胞
DH5α，筛选阳性单克隆进行序列测定。
1． 2． 3 双角山羊草 cDNA 序列和氨基酸序列特征
分析 经测序正确的 PAP1 序列，应用 DNAMAN 软
件对其进行序列比对及氨基酸组成、等电点等理化
性质及疏水性分析;信号肽分析利用 http:/ /www．
2 期 侯立江等:双角山羊草紫色酸性磷酸酶 PAP1 基因的克隆及生物信息学分析 37
cbs． dtu． dk /services /Signal P-4． 1 /在线软件进行;跨
膜结构预测则通过 http:/ /www． cbs． dtu． dk /serv-
ices /TMH MM软件进行。
1． 2． 4 同源蛋白的系统进化分析 将双角山羊草
cDNA核苷酸序列在 NCBI 网站(http:/ /www． ncbi．
nlm． nih． gov /)进行 Blast，比对到与其同源的其他植
物种属的 PAP1 氨基酸序列，并对这一系列 PAP1 氨
基酸序列进行同源性分析;同时，应用 MAGA 5 软件
构建相关系统进化树。
2 结果与分析
2． 1 双角山羊草 PAP1 基因的克隆
以双角山羊草 9062 的 cDNA 作为模板，利用
TaKaＲa公司生产的 PCＲ 仪进行 PCＲ 扩增，PCＲ 产
物经琼脂糖凝胶电泳后，发现一条 1． 124 kb 的特异
性条带(图 1)。将该特异性片段连接到 pMD19-T
载体上并转化感受态细胞-大肠杆菌 DH5α，以蓝白
斑筛选为基础，随机挑选 5 个白色单克隆进行 PCＲ
检测，其中，有 2 个克隆扩增到该目的条带，将其进
行摇菌，并送菌液测序。测序后发现，该基因 cDNA
序列信息与 NCBI 中已有的小麦紫色酸性磷酸酶
PAP1 基因(登录号:AB51886． 1)匹配度最高，表现
为高度同源，二者碱基的同一性为 87． 81%。因此，
该 cDNA序列应为双角山羊草紫色酸性磷酸酶基
因，将该 cDNA序列命名为 AeBiPAP1。
图 1 紫色酸性磷酸酶 AeBiPAP1 基因克隆电泳检测
Fig． 1 The electrophoresis detection of
AeBiPAP1 gene cloning
2． 2 全长 cDNA序列分析
从双角山羊草 9062 中扩增得到的紫色酸性磷
酸酶 PAP1 基因，长度为 1． 124 kb，起始密码子和终
止密码子分别为 ATG、TGA(图 2)。与小麦紫色酸
性磷酸酶 PAP1 基因序列相比，该 cDNA 编码区的
碱基替代数共有 35 处，其中包含了 13 处颠换
(Transversion)和 22 处转换(Transition) (表 1)。该
cDNA编码的氨基酸数为 335 个，与小麦氨基酸序
列相比有 15 处编码的氨基酸残基不同，二者氨基酸
序列一致性高达 95． 52%。通过 DNAMAN 软件分
析后得知，该蛋白质的等电点为 5． 77，蛋白质分子
量为 38． 131 kDa。通过对二者蛋白质氨基酸序列
的保守结构域进行分析，证实这 2 个蛋白是一致的。
同时，通过亲水性和疏水性分析，表明二者只发生了
微小的变化。
图 2 双角山羊草紫色酸性磷酸酶 PAP1 基因与小麦 PAP1 基因的序列比对
Fig． 2 Sequence alignment of AeBiPAP1 with PAP1 gene of wheat
2． 3 AeBiPAP1 编码蛋白的生物信息学分析
2． 3． 1 AeBiPAP1 编码蛋白的理化性质及结构分析
根据 AeBiPAP1 编码蛋白的一级结构进行疏水作
图发现，负峰值个数比正峰值个数多，说明 AeBiPAP1
是一种亲水性蛋白，属于可溶性蛋白(图 3-A) ;对 Ae-
BiPAP1编码蛋白进行二级结构预测发现:α 螺旋占
14. 3%，延伸链占 27． 2%，无规则卷曲占 58． 5%;对
AeBiPAP1 编码蛋白进行三级结构预测(图 3-B)发
现，该编码蛋白包含金属离子结合中心，因此，预测
它属于金属蛋白。这与已有的研究结果一致。
38 华 北 农 学 报 30 卷
表 1 双角山羊草紫色酸性磷酸酶 PAP1 基因与小麦 PAP1 基因的比较分析
Tab． 1 Sequence alaysis of AeBiPAP1 and PAP1 gene of wheat
位点
Locus
碱基
Base
氨基酸
Amino acid
PAP1 AeBiPAP1 PAP1 AeBiPAP1
位点
Locus
碱基
Base
氨基酸
Amino acid
PAP1 AeBiPAP1 PAP1 AeBiPAP1
10 G A G S 555 G A K K
23 C T A V 645 G C M I
70 G A A T 657 T C S S
120 C G S S 660 C T D D
133 G A V I 696 T C L L
206 G A Ｒ K 714 T C N N
246 T C F F 753 C G L L
255 T C N N 777 T C S S
264 C G T T 850 A C I L
285 T C F F 895 A T N Y
288 A G E E 951 G A E E
316 C A Q K 953 T G F W
364 C A Ｒ Ｒ 954 T G F W
369 C T G G 956 C G T S
390 C T D D 962 A G H Ｒ
415 A C Ｒ Ｒ 968 C T T I
438 T C F F 973 C T H Y
439 C G L V
A．疏水性分析;B．三维结构预测。
A． Hydrophobic analysis;B． 3D structure prediction．
图 3 AeBiPAP1 编码蛋白的结构分析
Fig． 3 Construction analysis of AeBiPAP1
2． 3． 2 AeBiPAP1 编码蛋白的跨膜与信号肽分析
蛋白跨膜区域和信号肽序列分析结果显示，AeBi-
PAP1 没有跨膜结构域(图 4-A) ，但在 1 ～ 30 氨基酸
含有一个信号肽(图 4-B) ，说明 AeBiPAP1 基因编码
的蛋白质不属于膜蛋白，可能为分泌蛋白，经亚细胞
定位发现其作用于细胞外(包含细胞壁)的概率最
高，预示植株根系表达的 AeBiPAP1 可以通过分泌到
植物根际周围来参与根际土壤中有机态磷的吸收利
用过程，这与上述跨膜区、信号肽的预测结果一致，但
是 AeBiPAP1蛋白的具体功能，还有待进一步探究。
2． 4 不同植物紫色酸性磷酸酶 PAP1 基因系统进
化分析
将获得的双角山羊草紫色酸性磷酸酶 PAP1 基
因氨基酸序列与 GenBank 蛋白质数据库进行氨基
酸序列同源性(BlastP)比对，发现与双角山羊草紫
色酸性磷酸酶 PAP1 基因有较高同源性的植物包
括:小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、
短柄草(Brachypodium distachyon)、水稻(Oryza sati-
va)、谷子(Setaria italica)、双角山羊草属的节节麦
(Aegilops tauschii)等，这些基因的一致性都在 80%
以上。利用这些氨基酸序列进行系统进化树构建，
结果表明(图 5) ，双角山羊草紫色酸性磷酸酶 PAP1
基因与普通小麦的亲缘关系最近，与粳稻、短柄草、
谷子亲缘关系较近，与大麦、乌拉尔图小麦、水稻以
及节节麦等植物的亲缘关系较远。
2 期 侯立江等:双角山羊草紫色酸性磷酸酶 PAP1 基因的克隆及生物信息学分析 39
A．跨膜结构域分析;B．信号肽分析。
A． Analysis of membrane structure domain;B． Analysis of signal peptides．
图 4 AeBiPAP1 的功能预测
Fig． 4 Function predicted of AeBiPAP1
图 5 AeBiPAP1 基因的系统进化分析
Fig． 5 Evolutionary tree analysis of AeBiPAP1 gene
3 讨论
紫色酸性磷酸酶(Purple acid phosphotase，PAP)
是一种含铁的糖蛋白，其氨基酸序列包含 7 个保守
区域，能够有效地催化部分有机态磷化合物的分
解［8 － 15］;PAP作为植物体对低磷应答反应及其信号
转导途径的重要调控因子，参与了植物对土壤中有
机磷的利用和植株体内磷的重新分配过程［16 － 19］。
例如，Zhang 等［20］对拟南芥紫色酸性磷酸酶 At-
PAP15 基因进行分析时发现，该基因有一定的植酸
酶活性，具有催化植酸水解形成肌醇和无机磷的功
能。肖凯等［4］在研究拟南芥 MtPAP1 表达模式时发
现，在高磷条件下，MtPAP1 在叶片中表达的水平较
高，在根系中很低;在低磷条件下，该基因在根系中
的表达增强，表现诱导的特征。本研究根据小麦
PAP1 基因(基因登录号:AB51886． 1)和二穗短柄草
的 PAP1 基因(基因登录号:XM_003558353． 1)设计
简并引物，采用同源克隆的方法获得了双角山羊草
9062 紫色酸性磷酸酶 PAP1 基因的 cDNA序列。
将双角山羊草 AeBiPAP1 的编码蛋白与小麦、大
麦、谷子等其他植物的编码蛋白进行同源性分析，发
现 AeBiPAP1 与小麦 PAP1 的亲缘关系最近，但是，
双角山羊草 PAP1 与小麦 PAP1 的 cDNA 编码区有
一定差异，这种差异主要表现为存在多处单核苷酸
多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP) ，从而
造成相应密码子编码的氨基酸，部分发生了非同义
突变。因此推测，这二者耐低磷能力的不同很可能
是由这些 SNP差异造成的。
分泌蛋白指的是 N 端一般含有一小段信号肽
的特殊蛋白质，它能够被分泌到细胞膜外;另外，分
泌蛋白依靠信号肽引导自身穿出细胞或凭借信号肽
的指引在细胞内不同区域或细胞器上进行正确定
位［21］。例如，孔佑宾等［22］在其研究中发现，Gm-
PAP14 编码的蛋白序列含有信号肽和跨膜结构域，
预测其为一种分泌蛋白。本研究中 AeBiPAP1 编码
的蛋白序列，通过相应的在线软件分析后发现，该蛋
白序列含有一个信号肽，但是却没有跨膜结构域，这
与前人研究有些不同，通过亚细胞定位分析发现，其
作用在细胞膜外的可能性最高，因此预测，该 AeBi-
PAP1 编码的蛋白很可能属于分泌蛋白，这与已知的
紫色酸性磷酸酶存在较高的一致性。
AeBiPAP1 基因的具体功能及作用模式有待进
一步探究。这将为通过转基因的手段将该 AeBi-
PAP1 基因转入到普通小麦中，并获得耐低磷胁迫能
力增强的小麦品种提供基因资源，同时，也为研究
PAP家族进化奠定一定的基础。
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