全 文 ：量数据进行了方差分析。结果见表 2。
表 1　益母草不同精制方法的比较( x±s)
方法 /水平 得膏率(%)
总生物碱含量
(%)
生物碱转移率
(%)
水沉法　　　　　1倍　　　 10.52 2.56 79.89
　　　　　　　　2倍　　　 10.65 2.68 84.72
　　　　　　　　3倍　　　 10.72 2.75 87.45
大孔树脂法　　　60%　　　 0.29 5.38 4.63
　　　　　　　　70%　　　 0.27 6.50 5.21
　　　　　　　　80%　　　 0.28 6.91 5.74
离子交换树脂法　氨水 -乙醇 0.90 18.74 50.03
　　　　　　　　NaOH-水 0.77 18.66 42.62
　　n=3
表 2　方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 方差 F 显著性
组间 970.3 2 485.2 2695.56 P<0.005
组内 3.83 21 0.18
　　F1-0.005(2, 21)=6.89
分析结果表明 ,各精制方法之间有显著性差异。为进一步表
明各方法两两间有无差异 , 继续对 3种方法进行了多重比较(S
法)。分析结果见表 3。
表 3　两两间多重比较
均值差 χ2 χ3 x1 3.60＊ 16.04＊ x2 12.44＊
　　＊表示二者间有显著性差异
综合以上分析 ,上述 3种方法对益母草酸醇提取液的精制效
果 , 以所得物中总生物碱含量为指标 ,离子交换树脂法精制后总
生物碱含量最高 ,与其它各法均有显著差异。因此可采用离子交
换法对益母草酸醇提取液进行纯化。
3　讨论
由本次实验结果可知 ,离子交换树脂法对益母草酸醇提取液
的纯化效果较好 ,能除去大部分的杂质 , 精制后所得物中总生物
碱含量是常规水沉法的 7倍左右。这可能是由于益母草经酸性
乙醇提取后其中的生物碱类成分以生物碱盐的正离子状态存在 ,
与树脂之间的交换属优惠平衡 ,从而与非离子型的杂质分离。但
结合直观分析 ,益母草酸醇提取液经离子交换树脂法精制后总生
物碱转移率仅为 40% ～ 50%, 因此采用离子交换法对益母草酸
醇提取液进行纯化尚需对离子交换的条件进行优化。为提高总
生物碱的转移率可对离子树脂的类型 、洗脱剂的种类 、浓度等因
素进行考察 [ 4] 。
大孔树脂法精制出膏率最低 ,有利于进行一些载药量低的新
型制剂的开发。本试验采用弱极性的 AB-8型大孔树脂精制益
母草酸醇提取液 ,结果总生物碱转移率最低。这主要是由于大孔
树脂的极性差异较大 ,对具体成分只有选用对应极性合适的大孔
树脂 ,选择适宜的洗脱溶媒和洗脱顺序 , 才能获得良好的精制效
果 [ 5] 。益母草类生物碱多为极性较大的水溶性生物碱 , 在今后
的工作中可考虑用极性更大的大孔树脂来对其进行分离。
参考文献:
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开发 , 2003, 15(2):162.
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离中的应用 [ J] .河北医科大学学报 , 2002, 23(2):121.
收稿日期:2007-02-26;　修订日期:2007-05-09
作者简介:勾建刚(1968-),男(汉族),山东淄博人,现任山东省淄博市中医医院
副主任药师,副教授,学士学位,主要从事药事管理、制剂质量标准研究工作.
白茅根多糖超声提取的优化
勾建刚 , 刘春红
(山东省淄博市中医医院　255300)
摘要:目的 确定白茅根多糖最佳超声提取条件 ,提取白茅根多糖 ,为白茅根的研究 、开发利用提供理论依据。方法 以
白茅根多糖含量为考察指标 ,用苯酚 -硫酸法进行含量测定 , 利用正交实验法确定白茅根多糖的最佳超声提取条件。结
果 提取次数和料液比对白茅根多糖提取率的影响起主要作用。超声提取的最佳工艺为:提取温度 80℃, 用 20倍量的
水 , 超声提取 3 h, 提取 3次 ,白茅根多糖得率为 6.33%。结论 确定了白茅根多糖的最佳超声提取工艺。
关键词:白茅根;　白茅根多糖;　正交实验;　超声提取;　苯酚 -硫酸法
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2007)11-2749-02
　　白茅根始载于《神农本草经》 ,原名茅根 , 为禾本科植物白茅
Imperatacylindrical(L.)P.Beauvvar.majorC.E.Hubb.的根茎 [ 1] ,
味甘 , 性寒 ,具有凉血止血 、清热利尿之功。用于治疗吐血 、淋病 、
小便不利 、水肿和黄疸等。研究表明 ,有效成分三萜类化合物和
糖类占其总化学成分的 18.8%[ 2] 。 Eglinton和 Natory小组对其
成分做了大量研究 ,先后分离出了芦竹素 、白茅素 、羊齿烯醇以及
其他三萜类化合物。白茅根水溶液粗提取物利用凝胶过滤及负
离子交换色谱法分离出一系列高分子量的多糖物质 ,其分子量大
于 15×104Da。利用化学分析法确定这些多糖中存在 6种单糖
苷 , 分别为葡萄糖苷 、半乳糖苷 、树胶醛糖苷 、甘露糖苷 、木糖苷 、
鼠李糖苷。为充分发挥药用功效 ,本研究以白茅根多糖含量为检
测指标 ,用苯酚 -硫酸法进行含量测定 , 考察料液比(g/ml)、提
取温度(℃)、超声时间(h)、提取次数等因素 ,探讨确定超声提取
条件下提取多糖的最佳工艺条件。
1　仪器与试剂
Spectrum54型紫外 -可见分光光度计(上海棱光技术有限公
司);KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公
司);葡萄糖标准品(上海市国药集团化学试剂有限公司), 白茅
根(济宁邦尔中药饮片有限公司)经鉴定为禾本科植物白茅 Im-
peratacylindrical(L.)P.Beauvvar.majorC.E.Hubb.的根茎。
2　方法与结果
2.1　白茅根多糖的优化提取
2.1.1　标准葡萄糖溶液的配制 精密称取干燥恒重的葡萄糖标
准品 25.2mg,加适量水溶解 , 转移到 250ml容量瓶中 , 加水至刻
度 ,配成浓度为 100.8μg/ml标准葡萄糖溶液备用。
2.1.2　5%苯酚试剂的配制 取苯酚 100 g, 加铝片 0.1 g和碳酸
氢钠 0.05g,蒸馏。收集 182℃蒸份 ,称取 7.5g,加水 150 ml溶
解 ,置棕色瓶内放冰箱备用。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2007VOL.18NO.11 时珍国医国药 2007年第 18卷第 11期
2.1.3　标准曲线的绘制 精密量取葡萄糖标准溶液 0.1, 0.2,
0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 ml置于干燥试管中 , 分别加水使成 1.0
ml。再分别加入 5%苯酚溶液 1.6 ml, 摇匀 , 然后加浓硫酸 7.0
ml, 充分摇匀 ,室温放置 25min,在 490 nm处测定其最大吸收度 ,
同时做一空白。以吸收度(A)为纵坐标 , 溶液的浓度(μg/ml)为
横坐标 , 得回归方程为:A=0.007 7C-0.045 2, 相关系数 r=
0.999 75, 可见葡萄糖的浓度在 10.08 ～ 70.56(μg/ml)范围内 ,
溶液的吸收度(A)与浓度(μg/ml)呈良好的线性关系。
2.1.4　正交实验设计 白茅根主要有效成分一系列高分子量的
多糖物质易溶于水 , 难溶于有机溶剂。因此 , 参照超声提取多糖
的相关文献资料 ,白茅根多糖提取工艺可采用不同水量反复提
取 , 选择主要影响提取效率的料液比(g/ml)(A)、提取温度(℃)
(B)、超声时间(h)(C)、提取次数(D)作为考察因素 , 因素水平
安排见表 1。运用 L9(34)正交实验设计 ,见表 2。
表 1　因素水平
水平 A B C D
1 1∶10 70 1 1
2 1∶20 60 2 2
3 1∶30 80 3 3
2.1.5　白茅根多糖样品的制备
白茅根样品的处理:称取白茅根小段块 300 g(0.2 ～ 0.5
cm), 经石油醚(60 ～ 90℃)500 ml回流脱脂两次 , 1 h/次。再用
80%乙醇回流提取两次 , 2 h/次 , 以除去单糖和低聚糖 , 将药渣
(a)烘干备用。
称量:称量已处理好的白茅根 27份 , 每份 5.00 g。
超声提取:按表 3设定的提取温度 、超声时间 、提取次数和料
液比 , 加蒸馏水进行操作 , 按条件超声提取 ,每个实验号做 3次平
行实验。
浓缩:合并每次实验的提取液 , 减压浓缩至 150 ml,加少量活
性炭脱色 ,过滤。
醇沉:滤液加 5倍量 95%乙醇 , 放置过滤 , 离心 , 去除上清
液 , 离心下面的絮状物 , 在 4 000r/min下 , 离心 15 min。
洗涤:沉淀用水 100ml溶解重复用乙醇沉淀 1次 , 沉淀用乙
醇 、丙酮多次洗涤。
干燥:在 4 000 r/min下 ,离心 15 min后 ,取沉淀物放在电热
恒温干燥箱内 60℃下烘干 ,即得白茅根多糖。
2.1.6　样品液的配制与测定 将白茅根多糖于研钵中研成粉末
后 , 分别置于 500ml的容量瓶中 ,再从中精密吸取 10.0 ml,放入
100 ml的容量瓶中作为多糖储备液。精确量取多糖储备液 1.0
ml, 按测定标准曲线同样的方法测其吸收度 , 代入回归方程 ,结果
见表 2。
由表 3正交实验的结果显示 ,影响白茅根多糖提取率的因素
主次顺序为:提取次数(D)>料液比(A)>超声时间(C)>超声
温度 (B)。 因此 , 白茅根多糖超声提取的最佳工艺组合
为:A2B3C3D3。
由正交实验的方差分析(见表 3)结果显示:提取次数和料液
比的差异显著对白茅根多糖提取率的影响起最主要作用 , 超声时
间和超声温度在此实验范围内没有显著差异 ,对测定结果的影响
较小 ,与直观分析结果(见表 2)相吻合。
2.1.7　验证实验 取白茅根(a)50g,加水 1 000 ml浸泡过夜后 ,
在 80℃下超声提取 3次 , 3 h/次。合并 3次提取液 , 加少量的活
性炭脱色 ,减压浓缩至 150ml, 加入 95%乙醇使溶液含乙醇量达
80%, 放置过夜 ,过虑 , 沉淀用 95%乙醇 、丙酮反复抽洗 , 得到多
糖纯品(I), 60℃烘干 ,称得质量为 3.165 g。将其于研钵中研成
粉末后精确称量 31.65 mg, 放入 500 ml容量瓶中定容后 , 取 1.0
ml, 按标准曲线同样的方法测定其吸收度 , 计算超声提取白茅根
中多糖的提取率即百分含量为 6.33%。
多糖的提取率 =VCD/m×100
其中 , V:样品溶液的体积(ml);C:多糖的浓度(μg/ml);m:
称取白茅根的质量(g);D:样品液的稀释倍数。
表 2　正交实验结果 L9(34)
实验
号 A B C D
多糖的浓度
/μg· ml-1
1 1 1 3 2 47.69
2 1 2 1 1 35.48
3 1 3 2 3 53.40
4 2 1 2 1 36.26
5 2 2 3 3 52.23
6 2 3 1 2 52.75
7 3 1 1 3 48.86
8 3 2 2 2 44.18
9 3 3 3 1 44.44K1 136.57 132.81 137.09 116.18K2 141.24 131.89 133.84 144.62K3 137.48 150.59 144.36 154.49κ
1 45.523 44.270 45.696 38.727κ2 47.080 43.963 44.613 48.207κ3 45.827 50.197 48.120 51.497R 1.557 6.234 3.501 12.770
表 3　方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 74.074 2 18.129 9.000 较显著
B 4.086 2 1.000 9.000C 19.343 2 4.734 9.000
D 263.767 2 64.554 9.000 显著
误差 4.09 2
4　讨论
在超声提取白茅根多糖过程中 ,超声提取次数和料液比是影
响其提取率的显著性因素 , 白茅根多糖提取的最佳工艺条件为:
超声温度 80℃,加入 20倍量的水 ,提取 3次 ,提取 3 h/次。
超声波提取法在中草药化学成分提取中的应用已经显示出
明显的优势 , 具有省时 、节能 、提出率高等优点 [ 3] 。超声的作用
原理为利用超声波的空化现象 ,空化产生的极大压力造成被破碎
物细胞壁及整个生物体破裂 , 而且整个破裂过程在瞬间完成;同
时超声波产生的振动作用加强了细胞内物质的释放 、扩散及溶
解 ,加速植物中的有效成分进入溶剂 , 使其进一步增大了有效成
分的溶出。除空化和振动作用外 , 超声波的许多次级效应 ,如乳
化 、扩散 、化学效应等也有利于使植物中的有效成分的转移 , 并充
分和溶剂混合 ,促进提取的进行 [ 4] 。
苯酚 -硫酸法简单 、快速 、灵敏 、重现性好 ,且生成的颜色持
久。用苯酚 -硫酸法测定多糖含量时需注意苯酚浓度不宜太
高 [ 5, 6] ,这样反应的稳定性不好且易产生操作误差。 本实验采用
5%浓度的苯酚与很多文献报道相符 , 测定结果较为理想。同时
保持较高的硫酸浓度对多糖含量测定非常重要 ,因此该呈色反应
是以对多糖的水解和糠醛反应为基础的 ,硫酸浓度降低会影响两
种反应的进行。此外 ,硫酸的质量非常关键。
苯酚 -硫酸法显色原理为糠醛衍生物与 2-萘酚缩合生成
有色物质 ,在 490 nm波长处有特征吸收 ,测定多糖含量。多糖在
硫酸存在下先水解成果糖 ,再衍生成具有呋喃环结构的化合物 -
-糠醛 ,甲基五碳糖生成的是 5-甲基五碳糠醛 , 六碳糖生成的
是 5-羧甲基糠醛。测定吸光度时所用葡萄糖标准溶液与白茅
根多糖都需现配现用才能保证结果的稳定性及准确性 , 每组需平
行测定 3次。
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时珍国医国药 2007年第 18卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2007VOL.18NO.11