全 文 ：中国中西庆结合杂志 ( 2 ) 02年 6月第 2卷基础理论研究特集
参 考 文 献
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(本文编辑 刘玉 兰 )
驱虫斑鸿菊对人黑素瘤细胞酪氨酸酶活性及其
基因表达水平的调节作用研究
邓瑞春 ` 周 勇` 章金 刚“ 徐建国3 尚 靖3 于鲁海3 王冬平 4
内容提要 目的 :探讨驱 虫斑鸡菊对人 3A 75 黑素瘤细胞株分泌酪氨酸酶活性 、 黑素合成 以及细胞 内酪
氛酸酶基因表达水平的影响 。 方法 :采用酶学方法研究驱虫斑鸡菊对酪氨酸酶活性 的影响 ;采用 475 n l 比
色法测定黑素含量 ;采用 T RI oz ! 试剂盒提取总 R N A ,再用半定量逆转录聚合酶链 反应扩增 c D N A , 检测酪氨
酸酶基因表达水平 。 结果 : 驱 虫斑鸡菊可以增强 3A 75 人黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑色素合成能力 , 还可增
强酪氨酸酶基因表达 。 结论 : 驱虫斑鸡菊可能从基因水平增强酪氨酸酶活性 ,促进黑素合成
关键词 驱 虫斑鸿菊 酪氨酸酶 基因表达 人黑素瘤细胞
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酪氨酸酶是酩氨酸转变为黑素的催化剂 , 为铜及蛋白质的
组合物 , 它在黑素细胞的粗面内质网中合成 , 后转移到高尔基空
泡中 ,在此参与合成黑素 。 人类所有细胞中 , 只有黑素细胞能合
成酪氨酸酶。 因此 , 该酶活性过低 , 会导致白瘫风等疾病 。 驱虫
斑鸿菊 ( v o r n (。n i。 a n th e ln 、 in t ie a w i lld八ZW )注射液是经多年临床
研究证明对自瘫风具有较好治疗效果的纯中药制剂 ( ’ 一 4 ) , 经初
步研究在体外可提高酪氨酸酶活性 ( 5 ) 。 本研究采用酶学方法 、
逆转录聚合酶链反应 ( R T 一 CP R )半定量分析等技术 , 探讨驱虫
斑鸿菊对酪氨酸酶的活性 、 酩氨酸酶基因表达的影响及诱导黑
素合成的分子机制
材料和方法
L
. 北京中庆药大学中西医结合研究所 (北京 10 0 0 29 ) ; 2 . 军事医学
科学院野战输血研究所 ; 3 . 新疆 自治区人民医院临床医学研究所 ; 4 . 军
事医学科学院实验动物中心
1 材料
1
.
1 药物与试剂 驱虫斑鸡菊注射液 :是从新摄特有的菊
科植物驱虫斑鸡菊的种子中提炼而成的 ,其主要成分为黄酮 , 梅
毫升溶液含黄酮 3 grn (约相当于原生药 250 r l飞g ) , 山新福 自治区
人民医院临床药学研究所提供 ; )I , 一 多巴 ( (A 、 (tI 卜 , U弘 ) ; iIY -
20 1试 剂 盒 ( ( ; 11义x ) B R I矛 ) ; 八e e , R厂 I飞 I戈’ R 、 岁 r。 rl、 试 刹 盒
( Pomr
e即 ) ; D N A aM rk e: D叹 ()00 (
’
I人 K A I之A ) t J七余有关材料及
试剂均为进口或国产分析纯 。
1
.
2 人 3A 7 5黑素瘤细胞 件l北京师范大学细胞生物学
系提供 。
2 方法
2
.
1 3A 75 人黑素瘤细胞酩氨酸酶活性测定 按 文献 “` , ’ )
方法测定 。 将 3A 75 单细胞悬液 l () Id牙L加入 96 孔细胞培养
中国中西医结合杂志 Q Z丝生旦谴丝壁建鱼鱼鱼丝鱼
045 3
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板 ,待贴壁后加入不同浓度的驱虫斑鸿菊注射液 ,分别继续培养
24
、
48
、
72 h 后 ,测定 4 90 nr 吸光度值 。 每一浓度设 4 个复孔 ,
取平均值。
2
.
2 3A 75 人黑素瘤细胞黑素含量测定 按文献 .(8 9) 方
法 ,将 3A 75 细胞培养 4 天后 , 用 0 . 25 %胰蛋白酶消化 ,将细胞
收集人离心管 , 10 0 r / m i n 离心 10 im n , 弃上清 ,用 0 . 5 时 1
m o l几 N a ( ) H 在 37 ℃作用 48 h 充分碱裂解细胞和溶解黑素颗
粒 ,用酶标仪测定 4 75 lun 光吸收值 。
2
.
3 3A 75 黑素瘤细胞总 R N A 纯化 参考文献 ( ’ 0) 方法进
行 。
2
.
4 RN A 纯度测定 参考文献川 )进行 。 从所提取的 4
组 RN A样品中各吸取 1闪,稀释至 10 闪后 ,利用 DU 6 40 分光
光度计分别测定其 260 nr 和 280 nl 波长处的吸光度 ( () 1卫60 、
。 D 280 ) ,通过下列公式计算 NR A 含量 : NR A (咫钊 ) 二 ( ) m 60
X 40 只 10 / l 0() 0
。
2
.
5 寡聚核昔酸引物合成 人类酪氨酸酶基因引物由赛
百盛生物技术公司合成。
3A 75 细胞酪氨酸酶基因引物序列 :
上游引物 : 5 ’ 一 (X 3A GAA GG A A I , G 〔汗( ; T 〔r A CC G -
0
.
2 5
0
、
2
0
.
15
0
.
1
0
.
0 5
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药物剂量 (魄八ld )
驱虫斑鸡菊对 3A 75 细胞分泌酪氨酸酶活性影响
C t r l 0
.
0 0 0 0 3 0
.
0 0 0 3 0
.
0 0 3 0
.
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.
3
药物浓度 (m创m l)
驱虫斑鸡菊对3A 75 细胞合成黑素活力的影响
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①②③④
下游引物 : 5 ’ 一 C几T T T C T G C AT C 以义二( I 二A G T C C 一
3
’ ;
针对引物对扩增区域 : 595 一 12 31 ,预期扩增长度 637 饰 。
内标记基因引物序列 :
上游引物 : 5 ’ 一 以 r A T T C I℃ A CC (石A T T C AG T C G T
C 一 3 ’ ;
下游引物 : 5 ’ 一 A GC 以X二CG T 0 1 二G TC AAG TC A G -
▲下5s▲|.冻个巩
针对引物对扩增区域 : 6 74 一 9% ,预期扩增长度 3 23 boP
2
.
6 逆转录聚合酶链反应 ( R T ~ PC R ) 参照 cA~ RT
-
PC R s” t二 试剂盒提供的实验步骤进行。
2
.
7 琼脂糖凝胶电泳鉴定 C D N A 按文献 ( ’ 0) 的方法 , 取
PC R扩增产物 8 川行质量分数为 2%琼脂搪凝胶电泳 , 电泳完
毕 ,在紫外灯下观察结果 ,并进行拍照保留。
结 果
l 驱虫斑鸿菊对 3A 75 黑家瘤细胞酪氨酸酶活性的影响
见图 1。 驭虫斑鸿菊在作用 24 h 后酪氨酸酶活性未见明显增
加 ;作用 48 h 后酷氨酸酶活性明显增加 。 其次 ,当驱虫斑鸿菊
浓度在 ( 3 x 10 ’ 7 一 3 x OI 一 4 ) m g / m l范围时 ,随浓度增加酪氨酸
酶活性逐渐增强 ,浓度再增加 ,则酪氨酸酶活性反而下降 。
2 驱虫斑鸡菊对 3A 75 黑素瘤细胞合成黑素活性的影响
见图 2 。在所测定驱虫斑鸿菊的浓度范围 ( 3 x 10 一 5 一 3 x 10 一 ’ )
fng l/
旧 1内 , 3A 7 5 黑素瘤细胞作用 4 天后 ,测定黑素含量 , 结果 :
随药物浓度增高 ,黑素含量不断增加 ,与驭虫斑鸿菊对 3A 75 黑
素瘤细胞酪氨酸酶的活性 、 细胞增殖活性的影响不同 ,对黑素含
量的影响未出现高浓度的抑制现象 。
3 3A 75 细胞总 R N A 提取和鉴定 见图 3。 采用紫外分
光光度法测定 RN A含量和纯度 ,结 果 : 4组 R N A 的含量在 1一 2
圈 3 R N A琼脂糖凝胶电泳图谱
注 : ①高剂量 ; ②中剂量 ; ③低剂量 ; ④对照组
ngt / ml 之间 , 2 60 nm 忍 80 unT 在 1
.
8 一 2 . 0 之间 , 说明所提取
R N A 纯度较高 , 无蛋白质和 D N A 等杂质的污染。 通过琼脂糖
凝胶电泳测定显示 , 4 组 R N A 均可见明显三条带 ,分别为 28 5 、
18 5
、
5 5
,进一步说明我们提取的 R N A 纯度高 ,未发生明显降
解 ,符合 R T 一代 R模板条件 。
4 驱虫斑鸿菊对 3A 75 人黑素瘤细胞酪氨酸酶 n 1R N A 表
达水平的调节 见图 4 。 图中 63 7 bp 基因片段为 3A 75 人黑素
瘤细胞酪氨酸酶 c D N A 片段 , 323 bp 基因片段为试剂盒提供作
为内标记的基因片段 。 可见 ,在 6 37 bp 基因片段位置 , 3 个驱虫
斑鸿菊处理组 (低剂量 、中剂量 、高剂量 )比对照组 e l )N A 条带亮
度增加 ,且随药物浓度增加亮度增加 , 显示出一定剂量依赖关
系。 而 323 饰基因片段 ,对照组与实验组之间未见荧光强度差
别 。 说明驱虫斑鸿菊可促进 3A 75 人黑素瘤细胞酪氨酸酶基因
中国中西医结合杂志 0 20 2年6 月第 2卷基础理论研究特集
表达 , 而对内标记的基因则无作用。
(
一
)
标准分子量 2《X城) , 1(以 ) , 750 , 5《刃 , 2 50
( + )
1X() b P
① } 一争
雷铁池等( ’ 4 )研究显示 , 8 一 甲氧补骨脂素可使小鼠 1B 6 黑
素瘤细胞酷氨酸酶基因表达水平增强 。 看来 , 8 一 甲氧补骨脂家
与驱虫斑鸡菊对白瘫风的治疗可能具有相似的作用机理 。 补骨
脂素类药物属于光敏性化合物 ,用药后能加强紫外线的作用 ,能
将还原黑素氧化为黑素 ,并通过破坏皮肤中的硫氢基化合物 ,使
酪氨酸酶活性增加 ,刺激尚未完全破坏或正常黑素细胞功能 , 从
而增加黑素合成(l5 ) 。 那么 , 驱虫斑鸡菊主要成分是否也属于光
敏性物质呢? 其作用机理与补骨脂素类药物有何异同呢? 有关
研究将在我们以后的工作中进一步深人进行 。
参 考 文 献净②③④⑤
b J /b l〕 j乙j t〕P
圈 4 驱虫斑鸿菊对人 3A 75 细胞酪氨酸酶基因表达的影响
注 : ①分子量标准分别是 : 2以X) , l仪洲) , 75 0 ,绷 , 250 , l田 bp ;
②对照组 ; ③低剂量 ; ④中剂量 ; ⑤高剂量
讨 论
已有很多实验证明一些中药可以促进酪氨酸酶合成和黑素
生成的作用 (l2 · ’ 3) 。 徐建国等 (5) 也已经研究证明驱虫斑鸡菊可
在体外促进酪氨酸酶活性 。 为了深入研究驱虫斑鸡菊对培养细
胞诱导黑素合成的分子机制 ,本研究用 3A 75 人黑素瘤细胞作
为模型 ,研究该药对 3A 75 细胞酪氨酸酶活性 、黑素合成和酪氨
酸酶 m R N A 的表达的影响。 结果显示 , 驱虫斑鸿菊作用 3A 75
人黑素瘤细胞 24 h 后 , 未见对酪氨酸酶活性有明显影响 ,从
4 8 h到 72 h 后测定时 , 可见酪氨酸酶活性 比 24 h 明显升高 , 而
且随着药物剂量增加 , 酪氨酸酶活性有所增加 。 但当浓度到达
一定时 ,则出现细胞毒性作用 。 在显微镜下观察可见细胞萎缩
变形 ,甚至死亡 ` , 说明驱虫斑鸡菊不仅在体外直接激活酪氨酸
酶活性 ,对培养的黑素瘤细胞也具有促酪氨酸酶活性作用 。 驱
虫斑鸡菊对 3A 75 细胞分泌黑素活性结果与对酪氨酸酶作用相
似 ,在作用 4 天后 ,黑素含量随药物剂量增加而增加 , 出现明显
促进作用 。 可见 , 驱虫斑鸿菊注射液治疗白瘫风可能是通过刺
激未完全失活或正常黑素细胞分泌酪氨酸酶 ,进而促进黑家合
成有关 。
上述结果还显示 , 驱虫斑鸿菊能在转录水平以剂量依赖性
诱发酪氨酸酶 m R N A 的表达 ,促进酶蛋白的合成 。 说明驱虫斑
鸿菊治疗白镶风 , 可能是通过调节酪氨酸酶基因表达而发挥作
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(本文编辑 刘玉兰 )