全 文 ：黑面神提取物对酪氨酸酶的抑制动力学
卢武林 , 罗红军 , 李慧 , 罗文鸿
(汕头大学医学院分析测试实验室 , 广东　汕头　515041)
[ 摘要] 目的:研究黑面神提取物对酪氨酸酶活性的影响 , 为色素增加性皮肤的治疗提供实验依据。方法:采用酪氨酸酶催
化氧化左旋多巴速率法体外测定酪氨酸酶活力。以 Lineweaver-Burk 曲线推导出黑面神提取物对酪氨酸酶的抑制效应及动力
学。结果:导致酪氨酸酶活力下降 50%的黑面神提取物正丁醇部分浓度约为 0.8 mg/mL , 对游离酶和酶-底物复合物的抑制
常数分别为(0.7±0.0), (1.4±0.1)mg/mL。结论:黑面神提取物正丁醇部分对酪氨酸酶抑制机制为可逆的混合型抑制。
[ 关键词] 黑面神;酪氨酸酶;抑制作用;动力学
[ 中图分类号] R285.5　　　 [ 文献标识码] A　　　 [ 文章编号] 1007-4716(2011)04-0204-04
　　 　　收稿日期:2011-12-20
基金项目:广东省自然科学基金团队资助项目(9351507102000-
001)
作者简介:卢武林 (1986-), 男 , 广东省揭阳市人 , 汕头大
学医学院在读硕士生。
通信作者:罗文鸿E-mail:whluo@stu.edu.cn
Inhibitory Kinetics of Extracts from Breynia Fruticosa on Mushroom Tyrosinase
LU Wu-lin , LUO Hong-jun , LI Hui , LUO Wen-hong
(Bioanalytical Laboratory , Shantou University Medical College , Shantou　515041 , China)
[ Abstract] Objective:To study the effect of breynia fruticosa on the activity of mushroom tyrosinase , and to provide
experimental evidence for the treatment of hyperpigmentation disorders.Methods:Tyrosinase activity was estimated by
oxidation rate of L-dopa.The inhibitory effect of the extracts from breynia fruticosa on the activity of mushroom tyrosinase
and inhibition kinetics were deduced from the Lineweaver-Burk plots.Results:The inhibitory concentration of the n-bu-
tanol fraction of the ethanol extracts from breynia fruticosa leading to 50% enzyme activity lost was estimated to be 0.8
mg/mL.The inhibition constants for the n-butanol fraction binding free enzyme and substrate-enzyme were(0.7±0.0)
and(1.4±0.1)mg/mL respectively.Conclusion:The n-butanol fraction from breynia fruticosa is a reversible mixed-
type inhibitor for the oxidation of L-dopa.
[ Key Words] breynia fruticosa , mushroom tyrosinase , inhibition , kinetics
酪氨酸酶是一种含有铜的多酚氧化酶 , 广泛分
布于微生物 、动植物及人体内 , 是合成黑色素的关
键酶[ 1] , 但主要存在于皮肤表皮细胞的黑色素细胞
中 , 与一些常见的皮肤疾病和老年斑等色素障碍性
疾病发生具有重要关系[ 2] 。大多数能使皮肤脱色的
物质均通过抑制酪氨酸酶活性来阻止皮肤黑色素生
成 , 利用抑制皮肤酪氨酸酶活性试验 , 可筛选治疗
皮肤色素沉着症的药物 , 并将一些酪氨酸酶抑制剂
应用到增白美容化妆品中[ 3] 。因此 , 寻找有效且对
人体无不良反应的天然酪氨酸酶抑制剂具有一定的
实际意义 。黑面神为大戟科黑面神属植物 , 对支气
管炎 、跌打损伤以及湿疹 、皮肤和外阴瘙痒等均有
良好的疗效[ 4] 。迄今为止 , 尚无有关黑面神对酪氨
酸酶抑制活性的报道 。本实验以黑面神提取物对酪
氨酸酶的活性抑制作用进行初步研究 , 并探讨其抑
制动力学 。
1　材料与方法
1.1　材料
黑面神购于广西玉林药材市场 。比活力 1 881
u/mg的蘑菇酪氨酸酶(Sigma 公司 , 美国), 3 , 4-
二羟基苯丙氨酸(L-dopa)(阿拉丁公司 , 中国), 乙
酸乙酯 , 正丁醇 , 磷酸二氢钠和磷酸氢二钠均为分
析纯。Multiskan spectrum 酶标仪(Thermo Labsytems
公司 , 芬兰), Sartorius BT125D分析电子天平(北京
sartorius天平有限公司 , 中国)。
1.2　方法
1.2.1　样品制备　黑面神粉碎 , 取 1 kg 粉末 , 加
90%(体积分数)的乙醇溶液加热搅拌回流 4次 , 每
次 3 h , 趁热过滤 , 合并滤液 , 在 55 ℃下减压浓
缩 , 所得浸膏依次用石油醚 、乙酸乙酯 、 正丁醇梯
度萃取 , 所得液体减压浓缩 , 得不同极性浸膏 , 称
取之 , 用 0.067mol/L的磷酸盐缓冲液(pH =6.8)超
·204·
第 24卷　第 4期
2011
汕头大学医学院学报
Journal of Shantou University Medical College
Vol.24　No.4
2011
声溶解 , 离心 , 取上清液 , 得不同浓度的样品溶
液。
1.2.2　酪氨酸酶活性测定 　酪氨酸酶催化 L-dopa
生成的多巴色素在 475 nm 处有最大吸收(消光系数
ε=3 700 L·mol-1·cm-1)。酪氨酸酶活力单位(u/
min):以每分钟多巴色素在 475 nm 波长处的吸光
度增加 0.001 为一个酶活力单位[ 5] 。参照 JONES
等[ 6]的方法测定酶活性 , 以测定体系中 1 mmol/L
的 L-dopa为底物 , 加入不同浓度提取物 , 再加入
酪氨酸酶液 , 测定不同时间的 OD475 。在96孔平板
中 , 加入 40 μL 5 mmol/L 的 L-dopa , 再加入 40μL
不同浓度黑面神提取物溶液和 80μL pH =6.8 的磷
酸盐缓冲液 , 最后加入 40μL 50mg/L 的酪氨酸酶
溶液 , 反应测定体系总体积 200μL , 每组分加入前
均在 30 ℃水浴锅中孵育 10 min。混匀 , 立即用酶
标仪测定在475 nm处的吸光度值。每隔 1分钟测 1
次 , 连续测定 10 min;作出酶催化反应体系的
OD475随时间的增长曲线 , 由曲线斜率即可求酶活
力。
1.2.3　黑面神提取物对酪氨酸酶的抑制机制　在
黑面神提取物正丁醇部分浓度不同的测定体系中 ,
固定 L-dopa终浓度为 1mmol/L , 加入不同量的酪氨
酸酶溶液 , 测定不同质量浓度的抑制剂(CI)对酶活
力的影响 , 通过作图法判断黑面神提取物作为抑制
剂的作用机制。
1.2.4　黑面神提取物对酪氨酸酶作用的抑制类型
和常数(KI , KIS)的测定　在黑面神提取物正丁醇
部分浓度不同的测定体系中 , 加入不同量的底物 ,
固定酶的终浓度为 10 mg/L , 测定不同质量浓度对
酶活力的影响 , 通过 Lineweaver-Burk 双倒数作图
法 , 比较酶催化反应动力学常数 , 包括米氏常数
(Km)和最大反应速率(υm)的变化来判断抑制类型 。
KI和 KIS分别通过 Dixon和 Cornish-Bowden作图法求
得。
2　结果
2.1　黑面神提取物对酪氨酸酶活力的影响
实验结果显示 , 提取物中乙酸乙酯部分几乎无
抑制作用 , 而正丁醇部分的抑制率很明显(图 1),
黑面神提取物正丁醇部分在浓度为 0.8mg/mL 时有
50%的抑制率 , 且随着抑制剂浓度的增加 , 抑制率
呈缓慢上升趋势 。
2.2　黑面神提取物对酪氨酸酶的抑制作用机制
固定底物浓度为 1.0mmol/L , 改变酪氨酸酶的
图 1　黑面神提取物正丁醇部分对酪氨酸酶的抑制作用
Fig.1　Inhibitory effect of the n-butanol fraction from breynia fruti-
cosa on mushroom tyrosinase
加入量 , 测定酪氨酸酶经黑面神提取物正丁醇部分
作用后的剩余酶活力与加入的酶量间的关系(图
2), 得到一组通过原点的直线 , 且随着提取物正丁
醇部分的浓度(CI)增大 , 直线斜率下降 , 说明黑面
神提取物正丁醇部分对酪氨酸酶催化 L-dopa 氧化
反应的抑制作用属于可逆过程。增加抑制剂浓度会
导致剩余酶活力不同幅度下降 , 是由于黑面神提取
物正丁醇部分是通过抑制酶活力使得酪氨酸酶催化
效率降低 , 而不是像不可逆抑制剂那样通过减少有
效酶量而引起体系剩余酶活力的下降 。因为不可逆
抑制反应将产生一组平行线 , 且横轴截距随体系中
不可逆抑制剂浓度的加大而增大 。
图 2　黑面神提取物正丁醇部分对酪氨酸酶的抑制机制(1
0.0 mg/ mL　2 0.3 mg/mL　3 0.5 mg/ mL　4 1.0 mg/
mL)
Fig.2　Inhibitory mechanism of the n-butanol fraction from breynia
fruticosa on mushroom tyrosinase
2.3　黑面神提取物对酪氨酸酶的抑制类型的判定
在测定体系中 , 固定酶的浓度 , 改变 L-dopa
浓度(CS), 测定不同浓度抑制剂对酶活力的影响 ,
·205·
第 4期　卢武林等.黑面神提取物对酪氨酸酶的抑制动力学
以Lineweaver-Burk双倒数法作图判断抑制剂的抑制
类型(图 3)。由图 3 可知 , 直线均交于第二象限 ,
随着黑面神提取物正丁醇部分浓度的增大 , Κm 随
浓度的增大而增大 , υmax值随浓度的增大而减小 ,
因此 , 黑面神提取物正丁醇部分对酪氨酸酶的抑制
属于混合型抑制作用 , 表明黑面神提取物正丁醇部
分不仅能与游离酶(E)结合 , 而且能与酶-底物复合
物(ES)结合 。以1/υ和Cs/υ对抑制剂浓度(CI)作图
得Dixon和 Cornish-Bowden曲线图(图 4 、 5)。
抑制常数为直线交点横坐标的负数 , 根据
Dixon和 Cornish-Bowden图可得拟合方程和抑制常数
(表 1 、 2), 黑面神提取物正丁醇部分对 E的 KI 为
(0.7±0.0)mg/mL , 对 ES 的 K IS为(1.4±0.1)mg/
mL。
图 3　黑面神提取物正丁醇部分对酪氨酸酶抑制类型的测
定(1 0.0 mg/mL　2 0.3 mg/mL　3 0.5 mg/mL　4 1.0
mg/mL)
Fig.3　Determination of the inhibitory type of the n-butanol fraction
from breynia fruticosa on mushroom tyrosinase
图4　Dixon 曲线图(1 0.5 mmol/ L　2 1.0 mmol/L　3 2.0
mmol/ L)
Fig.4　Dixon plots
图 5　Cornish-Bowden 曲线图(1 0.5 mmol/L　2 1.0 mmol/ L　
3 2.0 mmol/ L)
Fig.5　Cornish-Bowden plots
表 1　黑面神提取物对 E的 KI
Table 1　KI of extracts from breynia fruticosa on E
C s/mmol/L 拟合方程 KI/mg/mL
0.5 1/υ=0.0620　CI +0.0555
1.0 1/υ=0.0417　CI +0.0418 0.7±0.0
2.0 1/υ=0.0289　CI +0.0329
表 2　黑面神提取物对 ES 的 KIS
Table 2　KI of extracts from breynia fruticosa on ES
C s/mmol/L 拟合方程 KIS/mg/mL
0.5 Cs/υ=30.994　CI +27.74
1.0 Cs/υ=41.749　CI +41.76 1.4±0.1
2.0 Cs/υ=57.783　CI +65.72
3　讨论
黑面神成分复杂 , 生物活性广泛 , 目前国 、内
外关于其化学成分的研究报道较少。有作者分离得
到三萜类 、 糖苷类等成分 , 其中熊果苷为可逆竞争
性抑制剂[ 7～ 10] , 香草醛为可逆混合性抑制剂[ 11] ,
还有很多成分的药理活性的抑制作用尚未明确 , 本
实验中 , 黑面神提取物乙酸乙酯部分抑制作用效果
不明显 , 而正丁醇部分抑制效果明显 , 且数据表明
不同浓度黑面神提取物正丁醇部分对酪氨酸酶具有
不同程度的抑制作用 , IC50约为 0.8 mg/mL , 表现
为可逆混合性抑制作用 , 且 KIS >KI , 可知抑制剂
对 E的亲和力比对 ES的强 , 依此 , 黑面神对酪氨
酸酶的抑制成分应该主要存在于极性较大的提取物
的正丁醇部分。然而本文仅对酪氨酸酶进行体外实
验 , 尚有待进一步对黑面神细分并进行体内实验 ,
为黑面神的研究开发提供科学依据。
参考文献:
[ 1] FENOLL L G , PENALVER M J , RODRIGUEZ L J N , et al.
(下转第 210页)
·206·
第 4期　卢武林等.黑面神提取物对酪氨酸酶的抑制动力学
郁症者中也发现了海马 、 前皮质的形态学改变[ 7-8] 。
CaMKIV与突触可塑性 、 突触稳态有关 , 可刺激神
经营养机制逆转此改变[ 9-10] 。本实验大鼠海马
CaMKIV 灰度值相对比的结果显示抑郁型大鼠海马
中CaMKIV表达水平显著降低(P <0.05), REMSD
可使其增高(P<0.05)。在 72 h REMSD过程中 , 给
予大鼠腺苷 A1受体拮抗剂 , 海马 CaMKIV 表达水
平升高(P<0.01), 且在行为学上大鼠抑郁样行为
得到改善;当给予大鼠腺苷A2a受体拮抗剂时 , 行
为学上表现为抗抑郁效应 , 但海马区 CaMKIV与抑
郁模型组比无统计学意义。我们猜测在 REMSD 所
致的强制觉醒状态下可使腺苷持续升高 , 使腺苷
A1受体不断激活最终导致自身快速脱敏 , 此时高
浓度腺苷可使 A2a受体被大量激活 , 引起谷氨酸 、
5-HT 释放增加 , 从而达到快速的抗抑郁效应 。
CaMKIV可降低一个或多个磷酸酶[ 11](使磷酸化环
磷酸腺苷效应元件结合蛋白(CREB)脱去 ser133 的
磷酸基团 , 从而终止转录因子 CREB活化 , 终止基
因转录的调节信号)活性 , 使 CREB持续激活 , 进
一步调节下游的基因转录 , 从而介导 REMSD的抗
抑郁机制。目前对于 REMSD快速抗抑郁机制中腺
苷及其受体所起的作用尚无统一定论 , 本实验中行
为学的检测与 CaMKIV 的表达水平并不完全一致 。
故推测:①腺苷在抑郁症中所起的作用并不是单一
的 , 根据不同的脑区或其受体的密度所发挥的作用
有所不同;②在 REMSD过程中 , 细胞信号转导的
其他通路也参与其中 , 仍需要进一步探究。
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