全 文 ：书49
菝葜提取物抑菌作用研究
帅丽乔娃，郑国栋* ，黎冬明，张清峰
(江西农业大学江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌 330045)
收稿日期:2014－06－25
作者简介:帅丽乔娃(1989－) ，女，硕士研究生，研究方向:天然产物的分离提取。
* 通讯作者:郑国栋(1969－) ，男，博士，副教授，研究方向:天然产物的分离提取、功能食品等。
基金项目:国家科技部 863 计划(2013BAD10B04);国家自然科学基金(31160320)。
摘 要:用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取经 50%乙醇超声处理后的菝葜提取液。用四种供试菌，采用滤纸
片法、最小抑菌浓度、半数抑菌浓度比较各萃取物的抑菌活性。结果:各萃取物对实验菌均有抑制作用，萃取物抑菌活
性大小为:乙酸乙酯相 ＞正丁醇相 ＞水相 ＞醇提物 ＞石油醚相 ＞氯仿相，与萃取物中的总多酚、总黄酮含量有关。其
中乙酸乙酯相的抑菌效果最好，当其浓度为 80mg /mL 时，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌抑
菌圈分别为 13.6 ± 0.12、13.2 ± 0.10、12.9 ± 0.07、(12.5 ± 0.01)mm。乙酸乙酯相对四种菌的最小抑菌浓度分别为 5、5、5、
10mg /mL，其半数抑菌浓度分别为 12.5、13.6、18.2、18.7mg /mL。结论:菝葜提取物有抑菌作用，特别是乙酸乙酯萃取物
的抑菌效果最好。
关键词:菝葜，提取物，抑菌作用
Study on antibacterial effect of extraction from Smilax China L.
SHUAI Li－qiaowa，ZHENG Guo－dong* ，LI Dong－ming，ZHANG Qing－feng
(Key Laboratory of Natural Product and Functional Food，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China)
Abstract:The 50% ethanol extraction from Smilax China L.(SCL)by ultrasonic were further exacted with petroleum
ether，chloroform，ethyl acetate，n－butanol，respectively.Antibacterial activities of extraction were tested by the filter
paper method，the minimum inhibitory concentration and half bacteriostatic concentration of four G + and G －strains.
The results showed that the extractions of SCL had antibacterial effect on the test bacteria. The antibacterial
activities of SCL’s different polar extracts were in sequence of ethyl acetate，n－butanol phase，aqueous phase，
ethanol extract，petroleum ether，chloroform phase.The results were associated with content of polyphenols and
flavonoids in extraction.The activity of ethyl acetate extraction was the strongest，and suppressed zones of the
Bacillus subtilis，Escherichia coli，Salmonella and Staphylococcus aureus were 13.6 ± 0.12，13.2 ± 0.10，12.9 ± 0.07，
(12.5 ± 0.01)mm in 80mg /mL，respectively.The minimum bacteriostatic concentrations of ethyl acetate relative to
the four strains were 5、5、5、10mg /mL，respectively，half bacteriostatic concentrations were 12.5，13.6，18.2，18.7mg /mL，
respectively.The results showed that the extraction of SCL had antibacterial effects，and the effects of ethyl acetate
extraction were the best.
Key words:Smilax China L.;extraction;bacteriostatic effect
中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2015)07－0049－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 07． 001
目前使用的防腐剂绝大多数都是人工合成的，
虽然价格低廉，但是过量的添加对食品的口感及人
们的身体健康有不良影响，美国、英国、日本等已立
法禁止使用的防腐剂有硼砂、水杨酸、对苯二酚、五
氯酚、福尔马林，我国颁布的食品卫生标准也严格控
制山梨酸及其盐类、丙酸及其盐类、苯甲酸及其盐
类、对羟基苯甲酸及其酯类等用量。因此，开发高
效、安全、稳定且便宜的新型天然防腐剂具有重要的
意义［1］。由于天然提取物的安全优势，从植物中提取
活性物质是天然物质研究的热门课题。很多中药具
有清热解毒、抗菌等作用，能抑制病原微生物的生
长，属理想的天然抑菌防腐材料［2］。这为植物源天然
食品防腐剂、抑菌剂的研究和开发提供了宝贵资源。
菝葜是被子植物门百合科菝葜属植物菝葜的干
燥根茎，俗称金刚藤、铁菱角，味甘、涩、微苦、性平，
分布于我国长江以南及东南亚等地区。菝葜含有较
多的黄酮、多酚、鞣质、有机酸、多糖及生物碱等活性
物质［3］。研究表明菝葜对胃肠炎、疮疖、抗癌、梅毒、
腰腿痛、风湿性关节炎等疾病有明显效果［4］。刘世旺
等［5］经实验发现菝葜乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、
苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最低
抑菌浓度分别为 0.14、0.18、0.46、0.44g /12mL 培养
50
基。邓家刚等经实验发现菝葜的 6%水煎液和 3%醇
浸液对炭疽杆菌有抑菌作用［6］，前人大多都是研究菝
葜的醇提物、水提物的抑菌作用，本文除了研究醇提
物和水提物外，还研究了石油醚层、氯仿层、乙酸乙
酯层和正丁醇层的抑菌作用，提取物种类更多、更全
面。实验以菝葜 6 种极性提取物为研究对象，以大
肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌
为实验菌株，采用滤纸片扩散法考察其抑菌效果、半
数抑菌浓度和最低抑菌浓度，为研究菝葜抗菌活性
和机理奠定实验基础，也为进一步开发与利用菝葜
提供了研究数据和理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
菝葜 江西南昌市药材店(产地:南昌) ，粉碎后
过 40 目筛，得到样品，备用;乙醇、石油醚、氯仿、乙
酸乙酯、正丁醇 均为分析纯，天津市永大化学试剂
开发中心;琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨 北京奥博星生
物技术责任有限公司;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、
枯草芽孢杆菌和沙门氏菌 江西农业大学食品学院
微生物实验室冷藏保管。
LAC－5040S高压灭菌锅、YLE－200 恒温培养箱、
BYY－ 200 药品冷藏箱 上海申安医疗器械厂;
KQ－500B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限
公司。
1.2 实验方法
1.2.1 萃取物的制备 取菝葜粉末 1kg，用 50%的乙
醇按料液比 1∶15 浸泡，超声提取 2 次，每次 25min，合
并 2 次滤液，减压浓缩得到提取液。将该提取液依
次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每种溶剂
连续萃取 3 次，合并相同溶剂萃取液，分别减压浓
缩，真空干燥后，得到五种萃取物，即水相物、乙酸乙
酯萃取物、正丁醇萃取物、氯仿萃取物和石油醚萃
取物［7］。
1.2.2 总酚含量的测定 称取一定量没食子酸，配
成 0.1mg /mL的没食子酸标准溶液。吸取 0.25、0.30、
0.35、0.40、0.45mL 标准溶液到 10.0mL 容量瓶中，分
别加入 1mL福林酚试剂后，摇匀放置 5min，再分别加
入 2.00mL 7%碳酸钠溶液，混匀，定容，室温避光放
置 1h后，在 765nm波长处测定吸光度。
准确吸取待测样液 0.5mL于 10mL容量瓶，加入
福林酚试剂 1.0mL，充分混匀后，加入 2.00mL 7%碳
酸钠溶液，用蒸馏水定容，避光放置 1h，于 765nm 测
定吸光度值。根据回归方程计算样品中多酚类化合
物的含量 =(C1 × 10)/(M × V1 × 1000)式中:C1 为样
品浓度值(mg);M为样品质量(g) ;V1 为量取样品体
积，mL。
1.2.3 总黄酮含量的测定 称取一定量芦丁，用
30%乙醇溶液配成 0.124mg /mL 的芦丁标准溶液。
分别精密吸取标准溶液 1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、
3.50mL放入 10mL 的容量瓶中，加 5% NaNO2 溶液
1.0mL，摇匀放置 8min，再加 10% Al(NO3)3 溶液
1.0mL，摇匀，再放置 6min，加 4% NaOH 溶液 4.0mL，
摇匀，定容，放置 10min，以 30%乙醇溶液作参比，在
510nm波长处分别测定吸光度 A。
样品的测定方法:取待测液 0.5mL，用 30%乙醇
溶液稀释定容至 25mL，准确移取 V2mL，按上述方法
显色，在 510nm测定其吸光度，根据回归方程计算总
黄酮量。样品黄酮含量 = C2 × 25 /(M2 × V2 × 1000)。
C2 为样品溶液中黄酮含量，mg;V2 为量取样品体积，
mL;M2 为样品的质量(g)。
1.2.4 细菌培养基的制备 牛肉膏 5g，蛋白胨 10g，
氯化钠 5g，水 1000mL，pH7.2(配制固体培养基需加
入 20g琼脂)，在 0.1MPa下高压灭菌 20min，备用。
1.2.5 供试菌株活化及菌悬液制备 将供试菌种接
入试管斜面培养基上，于 37℃，120r /min 摇床中培养
24h，培养完成后，置于 4℃冰箱中冷藏备用。将配制
好的液体培养基于 121℃灭菌 20min，室温冷却，用接
种环从斜面培养基上挑取一环置于 50mL 灭菌液体
培养基中，于 37℃摇床中培养 24h 作为种子液，然后
用无菌生理盐水洗脱配制成含菌数约为 108 个 /mL
的菌悬液备用［8］。
1.2.6 菝葜不同极性提取物抑菌活性测定 将所得
萃取物各取 800mg，分别用 10mL 无菌水溶解得
80mg /mL 的药液，再以无菌水为溶剂对上述
80mg /mL每种溶液分别进行两次稀释，每种萃取物
得到 80、40、20mg /mL 三个浓度梯度的供试药液，用
无菌水作对照，考虑到供试药液有限，本实验采用滤
纸片法。选用优质滤纸直径为 6mm圆形纸片，121℃
高压灭菌 30min，再经 80℃烘干，置于干燥器中备用。
取菌悬液 0.2mL 转移至之前倒好的平板培养基表
面，均匀涂布，制成含菌平板。在制备好的纸片上滴
加 0.02mL不同浓度的供试液，待其干燥后贴入含菌
平板中，每个平皿放三片，重复三次实验。在 37℃的
条件下培养 24h 后，用游标卡尺采用十字交叉法量
取抑菌圈直径(mm)。通过测定抑菌圈直径大小评
价不同组分对不同受试菌抑制作用［9］。
1.2.7 最小抑菌浓度 将不同菝葜提取物配制成
80、40、20、10、5、2.5mg /mL的提取液。吸取 0.1mL各
菌悬液于培养基中，涂布均匀后，再用无菌镊子夹取
分别浸有不同浓度菝葜提取液和无菌水对照液的滤
纸片(6mm)分别贴于涂布后的含菌平皿上。完成
后，置于 37℃下培养 24h。观察抑菌现象，以不长菌
(抑菌圈 ＞ 6mm)的最低浓度为最小抑菌浓度。
1.2.8 半数抑菌浓度 不同浓度的菝葜提取液加入
到已灭菌的培养基中，混匀，加入到培养皿内，吸取
200μL细菌菌悬液于其表面，用无菌涂布器将菌液
涂布均匀。细菌在 37℃下培养 24h，并进行平板菌落
计数，计算抑菌率。以无菌水作为对照。每个浓度
作 3 个平行样，运用 Excel 2003 处理数据，以样品浓
度和抑制率作图，求出线性回归方程，抑制率为 50%
时的浓度即为半数抑菌浓度［10］。抑菌率(%)=(对
照实验菌落数－相应浓度的菌落数)/对照实验的菌
落数 × 100。
1.2.9 数据分析 采用 DPS7.5 版分析软件中的
Duncan 新复极差法对总酚、总黄酮含量、抑菌作用、
最小抑菌浓度中的数据进行差异显著性分析。
51
表 1 不同极性提取物总酚和总黄酮含量(珋x ± s，n = 3)
Table 1 Different phase extraction of total phenolic and flavonoids(珋x ± s，n = 3)
样品 石油醚相 氯仿相 乙酸乙酯相 正丁醇相 水相物 醇提物
总酚(mg /g) 26.7 ± 0.1aA 24.1 ± 0.2aA 451.3 ± 3.7bB 326.9 ± 2.2cC 184.5 ± 1.3dD 149.8 ± 3.2eE
总黄酮(mg /g) 22.3 ± 0.2aA 19.6 ± 0.3aA 404.1 ± 1.5bB 289.4 ± 0.6cC 172.2 ± 2.8dD 137.9 ± 3.6eE
注:不同小写字母代表同行差异显著(p ＜ 0.05) ，不同大写字母代表同行差异极显著(p ＜ 0.01)。
表 2 不同极性提取物对细菌的抑制作用(以抑菌圈直径表示，mm，珋x ± s，n = 3)
Table 2 Antibiotic function of extracts in different polarity(Diameters of inhibition zone，mm，珋x ± s，n = 3)
供试样 浓度(mg /mL)
抑菌圈
金黄色芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 沙门氏菌
石油醚相
80 7.4 ± 0.02aA 6.9 ± 0.01aA 6.9 ± 0.06aA 6.3 ± 0.06aA
40 － － － －
20 － － － －
氯仿相
80 6.9 ± 0.04aA 7.1 ± 0.13aA 6.4 ± 0.03aA 6.2 ± 0.15aA
40 － － － －
20 － － － －
乙酸乙酯相
80 13.6 ± 0.12bB 13.2 ± 0.10bB 12.9 ± 0.07bB 12.5 ± 0.01bB
40 13.1 ± 0.02aA 12.6 ± 0.08aA 12.3 ± 0.02aA 11.9 ± 0.11aA
20 10.4 ± 0.03aA 9.6 ± 0.05aA 9.3 ± 0.14aA 8.9 ± 0.04aA
正丁醇相
80 13.5 ± 0.02bB 12.8 ± 0.21bB 12.4 ± 0.02bB 12.1 ± 0.23bB
40 12.4 ± 0.02bB 12.1 ± 0.04bB 11.5 ± 0.18bB 11.0 ± 0.28bB
20 9.1 ± 0.10bB 8.8 ± 0.19aA 8.9 ± 0.21aA 8.7 ± 0.09aA
水相
80 10.2 ± 0.23cC 9.9 ± 0.13cC 9.6 ± 0.07cC 9.2 ± 0.17cC
40 8.8 ± 0.17cC 8.3 ± 0.09cC 8.0 ± 0.12cC 7.9 ± 0.04cC
20 7.7 ± 0.01cC 7.4 ± 0.03bB 7.1 ± 0.25bB 7.0 ± 0.01bB
醇提物
80 9.5 ± 0.16cC 10.1 ± 0.24cC 9.2 ± 0.28cC 8.9 ± 0.01cC
40 8.6 ± 0.26cC 8.1 ± 0.01cC 8.1 ± 0.29cC 7.4 ± 0.12cC
20 7.2 ± 0.11dD 6.7 ± 0.03bB 6.5 ± 0.02bB 6.3 ± 0.05bB
空白 － － － －
注:“－”表示未观察到明显的抑菌圈，抑菌圈直径以平均值和标准误差表示，抑菌圈直径包含原孔洞初始直径 6mm。
2 结果与分析
2.1 总酚和总黄酮的回归方程
以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得
回归方程为 y = 10.243x + 0.0021，r = 0.9991。以芦丁
浓度作横坐标，吸光度作纵坐标，得回归方程为 y =
1.9373x + 0.0103，r = 0.9992。
2.2 菝葜不同萃取相总酚和总黄酮含量的比较
由表 1 可看出，菝葜不同提取物的总酚、总黄酮
含量差异较大，乙酸乙酯相和正丁醇相中总酚、总黄
酮含量高于其他萃取相，各萃取相中总多酚、总黄酮
含量依次为:乙酸乙酯相 ＞正丁醇相 ＞水相 ＞醇提
物 ＞石油醚相 ＞氯仿相。
2.3 菝葜不同极性提取物抑菌活性
由表 2 可知，6 种极性提取物对四种供试菌均有
一定的抑制效果，随着各极性提取物浓度上升，抑菌
效果也加强，呈现剂量－效应关系。6 种极性提取物
对革兰氏阳性菌，如金黄色芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌
的抑菌效果强于革兰氏阴性菌，如大肠杆菌和沙门
氏菌，说明菝葜提取物对革兰氏阳性菌的抑制效果
更好。其中，乙酸乙酯相的抑菌效果最好，对实验用
菌都有很好的抑菌效果，浓度为 80mg /mL 对金色葡
萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈达 13.6、13.2mm。
不同萃取物的抑菌效果强弱依次为:乙酸乙酯相 ＞
正丁醇相 ＞ 水相 ＞ 醇提物 ＞ 石油醚相 ＞ 氯仿相。
Smullen等［11］通过对多种植物多酚提取物的研究，发
现多酚类化合物有明显抑菌作用。Pachaikani 等［12］
发现黄酮有抗菌，抗真菌功能。表 1 中不同萃取相
的总酚、总黄酮含量与抑菌作用有明显相关性，说明
其抑菌成分可能主要是黄酮与多酚类。
2.4 最小抑菌浓度
石油醚相，氯仿相的抑菌效果不明显，以下不进
行最小抑菌浓度和半数抑菌浓度的研究。由表 3 可
以看出，各萃取相对不同菌种的最小抑菌浓度都在
4.83～20.11mg /mL。相对而言，乙酸乙酯萃取物最小
抑菌浓度较低。
2.5 半数抑菌浓度
从图 1～图 4 可以看出，随细菌种类的不同和极
性提取物不同，对同种和不同种类的细菌的半数抑
菌浓度也不相同。乙酸乙酯相、正丁醇相、水相和醇
提物对金黄色芽孢杆菌的半数抑菌浓度分别 12.5、
16.4、56.1、61.4mg /mL;对枯草芽孢杆菌的半数抑菌
浓度分别 13.6、18.3、62.6、65.8mg /mL;对大肠杆菌的
52
表 3 不同极性提取物的最小抑菌浓度(珋x ± s，n = 3)
Table 3 The minimum inhibitory concentration of extracts in different polarity(珋x ± s，n = 3)
供试样
最小抑菌浓度(mg /mL)
金黄色葡萄杆菌 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 沙门氏菌
乙酸乙酯相 4.83 ± 0.17aA 5.00 ± 0.02aA 4.96 ± 0.05aA 9.98 ± 0.04aA
正丁醇相 5.02 ± 0.04aA 4.95 ± 0.06aA 10.22 ± 0.31bB 10.13 ± 0.24aA
水相 9.83 ± 0.25bB 10.04 ± 0.03bB 20.11 ± 0.17cC 19.92 ± 0.18bB
醇提物 10.06 ± 0.13bB 19.98 ± 0.08cC 19.96 ± 0.07cC 20.09 ± 0.11bB
注:以不长菌(抑菌圈 ＞ 6mm)的最低浓度为最小抑菌浓度。
半数抑菌浓度分别 18.2、22.3、76.3、92.4mg /mL;对沙
门氏菌的半数抑菌浓度分别 18.7、21.0、71.8、
73.1mg /mL。
图 1 不同极性提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌率(n = 3)
Fig.1 The antibacterial rate of different polar extracts
on Staphylococcus aureus(n = 3)
图 2 不同极性提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌率(n = 3)
Fig.2 The antibacterial rate of different polar extracts
on Bacillus subtilis(n = 3)
图 3 不同极性提取物对大肠杆菌的抑菌率(n = 3)
Fig.3 The antibacterial rate of
different polar extracts on Escherichia.coli(n = 3)
3 结论
3.1 菝葜不同极性提取物的抑菌活性实验表明，各
图 4 不同极性提取物对沙门氏菌的抑菌率(n = 3)
Fig.4 The antibacterial rate of
different polar extracts on Salmonella.Sp(n = 3)
极性提取物对 4 种致病菌均有一定的抑制作用，且
呈剂量－效应关系。对革兰氏阳性菌的抑菌作用强
于革兰氏阴性菌。抑菌活性大小为:乙酸乙酯相 ＞
正丁醇相 ＞水相 ＞醇提物 ＞石油醚相 ＞氯仿相，抑
菌作用与总酚和总黄酮的含量呈正相关性。其中乙
酸乙酯相的抑菌效果最好，当其浓度为 80mg /mL时，
对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌和大肠
杆菌抑菌圈分别为 13.6 ± 0.12、13.2 ± 0.10、12.9 ±
0.07、(12.5 ± 0.01)mm。
3.2 半数抑菌浓度实验和最小抑菌浓度实验表明，
对同一供试菌，乙酸乙酯相比其它相的半数抑菌浓
度和最小抑菌浓度都低，对金黄色葡萄球菌、枯草芽
孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度为 5、
5、5、10mg /mL，半数抑菌浓度为 12.5、13.6、18.2、
18.7mg /mL。
3.3 本实验结果表明菝葜提取物有较好抑菌效果，
其中乙酸乙酯萃取物抑菌效果最好。但其抑菌成分
还不清楚，今后需要进一步研究。
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(下转第 59 页)
59
环境因子条件范围和实际产品中的污染严重程度提
供一定的参考依据，对于有潜在单增李斯特菌污染
的产品来说，这为加强产品的栅栏因子，优化工艺条
件以提高其安全度也提供了重要的参考。但是由于
实验中采用的基质是 TSB－YE 液体培养基，相对于
实际产品来说，条件较为苛刻，而实际产品更利于微
生物的生长，同时由于各企业的标准不一样，因此划
定生长 /非生长的界线标准也与本文中不一样，这样
也会导致生长 /非生长界面模型的差异。因此需要
进一步以实际产品为基质，研究单增李斯特菌的生
长情况并建立特定产品的生长 /非生长界面模型。
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