全 文 ：学术园地　Academic Field
PR ACTICA L FORES TRY TECHNOLOGY 3　
二〇〇九年第八期　林业实用技术
云南箭竹基因组 DNA的提取及 RAPD＊
反应条件的优化＊
李　华　辉朝茂
(西南林学院竹类研究所　昆明　650224)
＊基金项目:国家自然科学基金项目
(30560127 , 30872016);973计划前期研究专项
课题(2009CB126008)
通讯作者:辉朝茂(1962-), 男 , 博士 , 教
授,长期从事竹类研究。
[ 摘要] 　用改良的 SDS 法从云南箭竹硅
胶干燥的叶片中提取基因组 DNA 进行
RAPD扩增。通过正交法对 RAPD 反应
条件优化 , 6 个试验因子的最适条件为:模
板 DNA 1.5 ng/μL , 随机引物 0.8 ～ 1.0
μmol/ L , dNTPs 浓度 0.1～ 0.15 mmol/ L ,
Mg2+浓度 2.0 ～ 2.5 mmo l/ L , Taq 酶用量
0.5 ～ 1.0 U 。最佳热循环参数为:94 ℃预
变性 2 min , 之后进行 40 次循环(94 ℃变
性 30 s , 36 ℃退火 60 s , 72 ℃延伸 90 s),
最后 72 ℃总延伸7 min后在 4 ℃终止反
应。
[ 关键词] 　云南箭竹　基因组　DNA　
RAPD　反应条件　优化
云南箭竹(Fargesia yunnanen-
sis)属禾本科竹亚科箭竹属秆型较
大的一种 ,分布海拔较低 ,主要分布
于云南昆明 、丽江 、永胜 、华坪 、宁
蒗 、永仁 、宾川 、洱源 、大姚 、凤庆 、昌
宁等地。生于海拔 1 500 ～ 2 400 m
山区云南松林或阔叶林下。本种系
云南特产的优质笋用竹种 ,其笋鲜
嫩味美 ,口感较好 ,营养价值高 ,品
质优良 ,其秋季产笋和抗寒性强的
独特优势更使其开发价值倍增。它
在其自然分布中有两个区别较大的
品系:滇中至滇西分布的品系其分
枝相对较低 ,秆箨新鲜时呈灰褐色 ,
面被块状密集贴生的棕色小刺毛;
而滇西北品系其分枝相对较高 ,秆
箨新鲜时呈紫褐色 ,被面光滑无毛 ,
具有宽窄不等的明显的紫色条纹。
RAPD (Random Amplified
Po lymo rphism DNA)即随机扩增的
多态性 DNA ,它利用随机短的脱氧
核苷酸序列作为引物 ,对所研究的
基因 组 DNA 进 行 PCR 扩 增。
RAPD标记具有极大的丰富性 ,能
反应整个基因组的变化 ,且高效 、灵
活 ,技术简便 。该分子标记已广泛
运用于种质资源的鉴定 、指纹图谱
的构建 、物种亲缘关系和系统进化
方面的研究以及遗传多样性的检
测 ,但对竹亚科进行此类研究的专
题报道较少 。RAPD 的结果易受各
方面因素的影响 。因此 ,优化并统
一反应条件 ,是 RAPD成功的基础 。
通过大量试验 , 筛选出云南箭
竹基因组 DNA提取的最佳方案 ,并
通过正交试验设计优化 RAPD反应
体系 ,最终建立重复性好 、适合云南
箭竹进行 PCR反应的最佳体系 ,为
应用 RAPD对云南箭竹的遗传多样
性进行研究打下基础。
1　材料和方法
1.1　材料及其保存
因云南箭竹分布区交通不便的
地方 ,要采用大量新鲜植物材料十
分困难 。因此 , 本试验采用以丛为
单位 ,将云南箭竹的新鲜幼叶剪碎 ,
装于干燥的硅胶袋中 ,使其在 9 h内
干燥 ,带回实验室后 ,放入-76 ℃冰
箱中保存 。
1.2　基因组 DNA 的提取
对比了十六烷基三甲基溴化胺
(CTAB)和十二烷基磺酸钠(SDS)
等方法 , 并改进试剂浓度和处理方
法 ,最终通过改良的 SDS 法提取植
物的 DNA ,其产率和纯度都可满足
RAPD分析 。具体方法如下:
(1)将硅胶干燥 、冷冻保存的云
南箭竹叶片用液氮研磨成粉末状 ,
取 0.15 g 样品装入离心管中 ,加入
1 mL 65 ℃预热的 DNA 提取缓冲
液(100 mmo l/L T ris-HCl pH 值
8.5 、100 mmo l/L NaCl 、50 mmo l/L
EDTA pH 值 8.0 、2%SDS)及 15μL
β -巯基乙醇 ,65 ℃水浴 0.5 h ,其间
不断轻轻摇动 ,使之充分混匀 。
(2)在 4 ℃,10 000γ条件下离
心 15 min 。
(3)取上清液 ,加入 1 mLTris 饱
和酚 ,充分摇匀 ,在 4 ℃、10 000 r/min
条件下离心 10 min。取上清液 ,加入
等体积氯仿/异戊醇(24∶1),摇匀后
再离心(4 ℃,10 000 r/min ,10 min)。
(4)取上清液 ,重复步骤(3)。
(5)取上清液 ,加入 2/3体积的
冰冷的异丙醇 , -20 ℃冰箱中放置
30 ～ 50 min 。
(6)取出样品 ,在 4 ℃、10 000
r/min条件下离心 10 min。弃上清液 ,
用70%乙醇洗涤沉淀 ,室温下风干 ,溶
于200 μL 1×TE(1 mmol/L Tris -
HCl pH 值 8.5 , 0.1 mmol/ L EDTA
pH 值8.0)中。
(7)加入 2 μL RNA ase , 37 ℃
水浴 40 min。
(8)加入等体积氯仿/异戊醇
(24∶1),摇匀。然后在 4 ℃、10 000
DOI :10.13456/j.cnki.lykt.2009.08.023
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r/min条件下离心 10 min 。取上清
液 ,重复本步骤 ,直至两液相之间不
再有乳白色物质存在 。
(9)取上清液 ,加入 1/10 体积
3 mmol/LN aCl ,再加 2倍体积冰冷
的无水乙醇 ,摇匀 ,在-20 ℃条件下
沉淀 20 ～ 30 min 。
(10)取出样品 , 4 ℃、10 000
r/min条件下离心 10 min 。弃上清
液 ,用 70%乙醇洗涤沉淀 ,在室温下
风干 ,溶于 200 μL 1×TE , -20 ℃
长时间保存。
1.3　DNA 的检测
1.3.1　质量检测　(1)以 TE为空
白 ,利用紫外分光光度法对待测
DNA 进行检测 , 测定波长为 260 、
280 处的光吸收值 , 并计算 OD260/
OD 280的比值。纯的 DNA 溶液其
OD 260/OD280应为 1.8 左右 , 如果大
于 1.9 ,表明有 RNA 污染 ,小于 1.6
表明有蛋白质或酚污染[ 2] 。(2)取
5μL DNA 样品在 0.8%琼脂糖凝
胶 、120V 电压下 ,电泳 20 min ,在凝
胶成像系统下拍照检测 DNA 。完
整的大 DNA 呈现出一条清晰的条
带 ,如出现多条带或者出现明显的
拖尾现象 ,则表明 DNA 出现降解或
者断裂 ,需要重新提取。
1.3.2　浓度测定　利用紫外分光光
度法进行测定 ,对于双链 DNA ,OD260
为1.0时溶液浓度为 50μg/mL。
DNA 样 品 浓 度(μg/μL)=
OD260 ×N(样品稀释倍数)×50/1 000
(1-1)
分光光度计的紫外提前预热
30 min;取 10 μL DNA 稀释至 1%,
分光光度计上测定 OD260 ,记录。并
按照公式 1-1计算 DNA 浓度及几
个样品的平均浓度 , 根据材料的质
量(0.1 g)及 DNA 样品体积(200
μL),计算出其提取率(产率):
DNA 样品提取率(μg/g)=平
均浓度(μg/μL)×DNA 样品体积/
μL/材料质量/g (1-2)
1.4　RA PD扩增反应体系的建立
扩增体系中各个因素均可能影
响 RAPD 反应的结果 。为了确保
RAPD扩增结果的稳定性和重复
性 ,对反应中各因子条件的优化至
关重要。
1.4.1　扩增体系中各成分的浓度
优化　本试验参考同类工作[ 3-5] ,选
择缓冲体系 、扩增程序并对反应成
分中模板 、引物 、dNTP 、Mg2+浓度
和 T aq酶用量 5个重要因子进行正
交试验(见表 1)。
表 1　正交试验因素水平
水
平
因　　素
A B C D E
1 0.1 0.4 0.10 1.0 0.5
2 0.5 0.6 0.15 1.5 1.0
3 1.0 0.8 0.20 2.0 1.5
4 1.5 1.0 0.25 2.5 2.0
　　A.模板浓度:ng/μL;B.引物浓度:
μmol/ L; C.dNTPs 浓 度: mmol/ L;
D.M gCl2 浓度:mmo l/ L;E.Taq 酶用量/
U 。
根据因素水平表查正交表 L16
(45),确定正交试验方案(见表 2),
建立 RAPD的反应体系。
PCR反应总体积为 20 μL;模
板 DNA 0.1 ～ 1.5 ng/μL;随机引物
0.4 ～ 1.0 μmol/L;dN TPs 0.1 ～
0.25 mmol/ L;MgCl2 1.0 ～ 2.5
mmol/ L;Taq酶 0.5 ～ 2.0 U 。分别
按正交表组合的各因子浓度分装
于 PCR管中 ,每管加入 10 ×PCR
Buf fer(100 mmol/ L T ris -HCl ,
pH 值 8.3 , 500 mmo l/ L KCl)
2μL ,最后加 ddH 2 0 ～ 20 μL , 于
Biometra Tg rident96 型基因扩增
仪中扩增 。
扩增程序设为:94 ℃预变性
2 min ,之后进行 40个循环(94 ℃变
性 30 s , 36 ℃退火 60 s , 72 ℃延伸
90 s),最后 72 ℃总延伸 7 min后在
4 ℃时终止反应 。
表 2　正交试验方案
试验号 因　素　及　水　平
A B C D E
1 1 1 1 1 1
2 1 2 2 2 2
3 1 3 3 3 3
4 1 4 4 4 4
5 2 1 2 3 4
6 2 2 1 4 3
7 2 3 4 1 2
8 2 4 3 2 1
9 3 1 3 4 2
10 3 2 4 3 1
11 3 3 1 2 4
12 3 4 2 1 3
13 4 1 4 2 3
14 4 2 3 1 4
15 4 3 2 4 1
16 4 4 1 3 2
扩增产物在 1.2%琼脂糖凝胶
中电泳 , 电泳缓冲液为 0.5 ×TBE
(0.045 mol/ L Tris -硼酸 , 0.001
mo l/L EDTA),溴化乙锭染色 ,溴
酚蓝为指示剂 ,100 bp Ladder DNA
(购自上海杰瑞生物公司)为分子量
标记 ,电压为 5V/cm ,电泳 3 ～ 4 h
后在凝胶成像仪上观察结果并照
相 、记录 、分析 。
1.4.2　扩增体系退火温度的优化
　退火温度是影响扩增特异性的主
要因子之一 。在一定温度范围内 ,
退火温度越高扩增特异性越高;随
着温度的降低 ,扩增产物的特异性
也降低。由此可见 , 退火温度对
RAPD扩增结果是至关重要的 ,根
据以上所做试验结果 ,选取最佳反
应组合 ,在其它条件一致时 ,设置退
火温度梯度继续进行 RAPD反应条
件优化。退火温度梯度的变化范围
设置为 8 ℃,变化具体温度分别为:
34.0 ℃、34.7 ℃、36.0 ℃、37.3 ℃、
38.7 ℃、40.0 ℃、41.2 ℃、42.0 ℃。
1.4.3　扩增体系循环次数优化　
在一定的范围内 , 每一循环都使特
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异区段的基因拷贝增加 1 倍。理论
上 ,在反应中模板 DNA 的部分区段
以几何级数扩增 ,但这并不意味着
循环次数越多越好 , 经过一定次数
的循环 ,随着 dN TP 和引物的耗尽 ,
Taq DNA 聚合酶的失活等 ,扩增会
进入线性或停止阶段 ,或因为错配
几率的增加 , 导致非特异背景严
重[ 6-7] 。本试验分 3 个梯度进行了
扩增循环次数的优化:35 、40 、45次。
表 3　DNA样品的 OD值
样品 OD260 OD280 OD260/OD280 浓度(μg/μL)
1 0.100 3 0.056 6 1.772 0 0.502
2 0.098 4 0.052 9 1.860 1 0.492
3 0.102 3 0.056 1 1.823 5 0.512
4 0.101 5 0.055 1 1.842 1 0.508
表 4　正交试验结果
水
平
因　　素
A 模板浓度
(ng/μL)
B 引物浓度
(μmol/ L)
CdNTPs 浓度
(mmol/ L)
DMgCl2 浓度
(mmol/ L)
ETaq 酶用量
/ U
K1 10.00 25.00 25.00 20.00 31.00
K2 20.00 21.00 30.00 25.00 29.00
K3 35.00 26.00 28.00 32.00 15.00
K4 38.00 31.00 20.00 26.00 28.00
k1 2.50 6.25 6.25 5.00 7.75
k2 5.00 5.25 7.50 6.25 7.25
k3 8.75 6.50 7.00 8.00 3.75
k4 9.50 7.75 5.00 6.50 7.00
R 7.00 2.50 2.50 3.00 4.00
2　结果与分析
2.1　DNA 检测结果
2.1.1　质量检测结果
2.1.1.1　琼脂糖凝胶电泳结果 　
采用改良的 SDS 法提取的 DNA 纯
度和产率都较好 ,絮状 DNA在风干
后绝大部份都成白色或透明状。从
图 2中可以看出 ,每个样品基因组
DNA 均只有一条带 ,未出现降解和
断裂现象 ,质量较高 。
2.1.1.2　分光光度计检测结果 　
应用 ULT ROSPEC2000 紫外分光
光度计测定样品的 OD260/OD280比
值 ,上述 4个样品的比值在 1.77 ～
1.86之间 ,平均值为 1.824 ,该比值
在 1.8 ～ 1.9之间 ,表明 DNA 纯度
较高 ,符合 RAPD分析条件。
图 2　DNA电泳图
1～ 4 分别为样品 1 、2 、3 、4
2.1.2　浓度检测结果 　采用测定
得到的 OD260 、OD280 ,按照公式 1-
1 ,计算上述 4个样品的浓度。
根据上表 ,计算出 4个 DNA 样
品的平均浓度为 0.503 5 μg/μL ,根
据公式 1-2 ,可计算出其提取率为
671.3 ,其产率是相当高的[ 8] 。
2.2　最佳 RAPD反应体系的建立
2.2.1　正交试验结果及分析 　以
S309 作为引物(序列:GGTCTG-
G TTG), 提取的样品 1 为模板
DNA ,按上述正交试验表进行 PCR
扩增试验(见图 3)。
图 3　1 号样品 DNA扩增
产物电泳图
从左至右试验号数依次为 1 ～ 16 , 中
间一道为 100 bp Ladder DNA 分子量标
根据电泳的条带对正交试验表
中各组的结果进行统计分析 ,计算
各因素列中相同水平所对应的指标
和平均值(k)及级差(R),结果见表
4。R值的大小反映了该因素对结
果影响的大小。从表 4 中可以看
出 ,在试验范围内 , 5 个因子中以模
板浓度影响最大 , 其次依次为 Taq
酶用量 、Mg 2+浓度 , 引物浓度和
dN TPs浓度影响最小 ,但后几项因
子效应相差不大。电泳结果显示 ,
第 1-7号试验虽然能够扩增 ,但条
带较少 ,重复性较差 ,尤其以 1 、2 、3 、
4 、6 、7 效果差;9-16号效果较好 ,
条带多且清晰 , 而其中又以 15 、16
号的效果最好 ,重复性也较好。从
反应体系来看 ,第 1 、2 、3 、4 、6 、7 号
试验的主要因素水平较低 , 尤其是
模板浓度 、引物浓度和 Mg2+浓度的
水平都在 1或 2 。
模板 DNA 的含量是制约扩增
产物得率及特异性的重要因子。模
板含量过高 ,会增加非特异性产物
的扩增 ,造成弥散型电泳结果;模板
含量过低 ,分子碰撞的几率就低 ,偶
然性大 , 无法得到扩增产物或使结
果不稳定[ 9] , 1-4号的效果差主要
就是受模板浓度的影响 。由电泳结
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果可以看出 ,云南箭竹 RAPD 反应
体系中模板 DNA 的最佳浓度为
1.5 ng/μL。
　　图 4　退火温度对 RAPD　　　　图 5　扩增循环次数对扩增的影响
　　　　　扩增的影响
　　1 ～ 8的退火温度依次为 34.0 ℃, 34.7 ℃, 36.0 ℃, 37.3 ℃, 38.7 ℃,
　　　40.0 ℃, 41.2 ℃, 42.0 ℃
在 RAPD反应中 ,使用高浓度
的 Taq酶不仅浪费 ,而且容易产生
非特异扩增。 Taq酶含量过低会使
新链的合成效率下降 ,导致扩增产
物减少或消失。 Taq酶用量还与模
板的质量及酶的活性有关[ 9] 。考虑
到经济因素 ,选择 0.5 ～ 1 U 作为云
南箭竹 RAPD反应的 Taq酶用量。
反应混合物中的离子强度 , 尤
其是 Mg 2+的浓度 ,对 RAPD反应的
特异性扩增效率均有影响 , Mg2+是
Taq DNA 聚合酶的激活剂 , Mg2+
不足时 , Taq DNA 聚合酶的作用效
率会使扩增产物减少 ,浓度过高会
使非特异扩增产物增加或导致扩增
失败[ 10] 。对于云南箭竹来说 RAPD
体系最适宜的 Mg 2+浓度为 2.0 ～
2.5 mmol/ L。
RAPD -PCR 中 , 引物浓度过
低 ,引物与模板结合机率下降 ,扩增
反应会过早结束 ,造成引物条带过
浅甚至没有条带;引物浓度太高会
导致非特异性产物的出现。云南箭
竹 RAPD反应体系中引物的最适浓
度为 0.8 ～ 1.0 μmol/L。
dN TPs是合成 DNA 的原料和
能量 ,当 dN TPs不足时扩增产物减
少 ,但浓度过高时 ,会增加碱基的错
配率 ,并且 dN TPs 同 Taq DNA 聚
合酶竞争 Mg 2+ ,也影响 Taq DNA
聚合酶的活性 , dN TPs 总量也会影
响到 Mg2+的总量 。 RA PD -PCR
反应开始时 ,首先双链 DNA解链为
单链并与引物相结合 ,在 Taq DNA
聚合酶的催化作用下以引物为复制
起点进行 DNA 链的延伸 ,因此引物
浓度的变化会对 RAPD带的数量和
强弱产生影响[ 10] 。从电泳结果来
看 , dN TPs 在低浓度的情况下就可
满足需 要 , 因 此可 选择 0.1 ～
0.15 mmol/L的 dN TPs 浓度对云
南箭竹进行 RAPD-PCR扩增 。
2.2.2　退火温度对扩增的影响 　
在上述试验因子的最适条件下 ,同
样以样品 1作为模板 DNA , S309作
为引物 ,以退火温度作单因子试验 ,
在设置温度梯度范围内结果如图 4。
退火温度是影响 RAPD反应最
重要的条件之一 ,同时它也具有相
对的灵活性 ,是优化 RAPD 反应的
重要控制措施。从图 4 中可以看
出 ,当退火温度在 35 ℃以下时 ,扩
增效果较差 ,条带较少且不够清晰;
当退火温度高于 38 ℃时 ,扩增带开
始逐渐减少 、变弱 ,扩增效率降低。
36 ℃、37 ℃时扩增的条带较多且清
晰度较高 ,重复性较好 。为了保证
扩增效率 , 同时又达到增强特异性
的目的 ,以 36 ～ 37 ℃较为适宜 ,它
能保证引物与模板的稳定配对 ,同
时允许适当的错配 ,以扩大引物在
基因组 DNA 中配对的随机性。
2.2.3　PCR扩增循环次数对扩增
的影响　在其他因素处于最适条件
时 , PCR的循环次数决定着扩增产
量的多少 , 循环次数太少得不到足
够量得扩增产物 ,次数过多错配几
率增加 ,非特异性背景严重[ 7] 。本
试验的 3个梯度扩增循环数的优化
结果见图 5 。由图 5中可以看出 ,35
次循环扩增时 ,扩增出条带的数量
相对较少 ,亮度低;循环 40次时 ,扩
增结果最佳 ,产生条带的数量最多 ,
最清晰;循环扩增 45 次时 , 产生条
带的清晰度降低 , 非特异性带的干
扰较大。
3　小结及讨论
准确性和稳定性是利用 RAPD
进行遗传分析的前提条件。不同的
材料 、不同的DNA提取方法 、不同的
仪器 、不同公司的药品以及不同的反
应体系 ,对 RAPD反应结果都有较大
的影响 。因此 ,系统地探讨其反应最
佳条件 ,优化反应体系是提高 RAPD
反应可靠性和重复性的关键。
(1)高质量的模板 DNA是保证
RAPD反应具有较高稳定性和重复
性的重要因素之一 。在 DNA 提取和
反应操作中应尽量避免过猛地震荡
致使 DNA 产生机械损伤 ,以便获得
大分子量模板 DNA 。本试验采用改
良 SDS 法所提取的 DNA 样品纯度
较高 ,抑制 Taq 酶活性的杂质较少 ,
完全能满足 RAPD分析的需要。
(2)RAPD 反应的结果受到诸
多因素的影响 ,本试验在充分考虑
缓冲体系 、扩增程序等因子的基础
学术园地　Academic Field
PR ACTICA L FORES TRY TECHNOLOGY 7　
二〇〇九年第八期　林业实用技术
蒙古扁桃组织培养中愈伤组织褐化机理初探＊
樊　荣2 　滕　鹤1 　白淑兰1 　王玉霞1 　慈忠玲1
(1.内蒙古农业大学林学院　呼和浩特　010019;2.呼和浩特市赛罕区实验苗圃)
＊基金项目:国家自然基金项目(30860225)
资助 ,内蒙古农业大学博士基金项目(BJ06-11)。
作者简介:樊　荣(1968-),男 , 高级工程
师,主要从事林木育苗及生物技术研究。
上 ,选取了反应成分中模板浓度 、引
物浓度 、dN TPs 浓度 、Mg2+浓度及
Taq酶用量 5个重要因子 ,通过正
交试验所设计的 16组试验号在 Bi-
ometra Tg rident96型基因扩增仪上
一次完成扩增反应 , 并在筛选出的
最适条件下进行退火温度的梯度试
验以及循环次数的优化。结果表
明 ,在 20μL 的 RAPD -PCR 反应
体系中 ,各项因子的最适条件:模板
DNA 1.5 ng/μL ,随机引物 0.8 ～
1.0 μmol/ L , dN TPs 0.1 ～ 0.15
mmo l/L ,Mg2+ 2.0 ～ 2.5 mmol/ L ,
Taq酶用量 0.5 ～ 1 U , 10 ×PCR
Buffer 2 μL , 加 ddH 2O 至 20 μL。
其热循环参数为:94 ℃预变性
2 min ,之后进行 40个循环(94 ℃变
性30 s ,36 ℃退火 60 s , 72 ℃延伸
90 s),最后 72 ℃总延伸7 m in后在
4 ℃终止反应 。该体系重复性好 ,可
靠性高 ,与普小兰等[ 5] 所研究的巨
龙竹 RAPD 优化体系结果相吻合 ,
由此可见 , 该体系不但可以有效应
用于云南箭竹的遗传多样性研究
中 ,甚至可以试用于竹亚科中其它
竹种的遗传多样性研究 。
参考文献:
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应用于遗传多样性和系统学研究中
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(理工版), 2003 , 28(1):127-131.
(6 ～ 16 本刊略)★
[ 摘要] 　选取不同培养时间及不同培养
条件下的 15 个样品 , 通过分光光度法测
量其总酚含量 、多酚氧化酶(PPO)活性 、
超氧化物歧化酶(SOD)活性 、过氧化物酶
(POD)活性 ,发现除总酚含量与愈伤组织
褐化情况相关外 , 较高的 SOD 酶活性与
较低的 POD酶活性也是导致愈伤组织褐
化的重要因素。
[ 关键词] 　蒙古扁桃　组织培养　褐化
　酶活性
蒙古扁桃(Prunus mongolica
Ma xim.)属于蔷薇科(Rosaceae)李
属(Prunus)的多年生灌木 ,又称为
山樱桃 、土豆子[ 1] 。分布于内蒙古 、
甘肃 、宁夏的荒漠区和荒漠草原区
的低山丘陵坡麓 、石质坡地及干涸
河床 , 多 分 布于 海拔 1 000 ～
2 400 m 。蒙古国也有分布[ 2] 。蒙
古扁桃是亚洲中部戈壁荒漠特有
种 ,是荒漠区和荒漠草原的景观植
物和水土保持植物 。由于不堪承受
强烈人为活动影响及自然环境进一
步恶化 ,蒙古扁桃的种群数量锐减 ,
分布范围日益缩小 ,分别被中国植
物红皮书和蒙古国植物红皮书收录
为濒危植物[ 3] 。在国家环境保护局
首次公布的“中国珍稀濒危保护植
物名录”中被列为三级保护植物[ 4] 。
蒙古扁桃种质资源保护日趋引起人
们的关注 。但蒙古扁桃在生产上无
法使用分蔸繁殖 、扦插繁殖等无性
方法进行繁殖。繁殖方式主要为种
子繁殖。但由于其种子外具有坚硬
的果核 ,直播 、破壳 、酸蚀的萌发率
都低 ,经越冬处理后萌发率仍不足
30%[ 5-6] 。因此 ,对蒙古扁桃进行组
织培养 ,在实验过程中发现 ,愈伤组
织经过一段时间的培养 ,逐渐出现
褐化现象 ,褐化的程度及速度因培
养条件不同而有所差异 。为了控制
褐化 ,本研究以不同条件下蒙古扁
桃愈伤组织为材料 ,测定并分析不
同生长时期与褐化相关的因子 ,从
而探讨蒙古扁桃组织培养过程中褐
化的生理生化机制 。
1　材料与方法
1.1　材料
本实 验供 试激 素:6-BA 和
NAA , 6-BA 选 择 1 种 浓 度:
0.7 mg/ L , NAA 选择 3 种浓度:
0.2 mg/ L 、0.4 mg/ L 、0.6 mg/ L ,培
养基选择了 MS 培养基 。外植体为
蒙古扁桃 30 d的幼龄实生苗茎段通