全 文 ：收稿日期：2011-07-12
基金项目：辽宁省创新团队项目（2009T089）
作者简介：代红艳（1970-），女，沈阳农业大学教授，博士，从事果树种质资源与生物技术研究。
沈阳农业大学学报，2011－12，42(6)：663-667
Journal of Shenyang Agricultural University，2011－12，42(6)：663-667
农杆菌介导转化平邑甜茶子叶外植体的研究
代红艳，李文然，刘霁菡，刘月学,张志宏
（沈阳农业大学 园艺学院，沈阳 110161）
摘要：以近轴端子叶为外植体，研究了菌液浓度、菌液浸泡时间、共培养时间及推迟筛选对根癌农杆菌介导的苹果属植物平邑甜
茶转化效率的影响，建立了平邑甜茶高效的转化体系。 结果表明：较优转化体系是将成熟胚接种在胚萌发培养基上培养，7～10d
后剪取近轴端子叶， 子叶外植体在 OD600=0.5 的 EHA105 菌液中浸泡 10min 后在再生培养基上共培养 5d， 然后在附加 20mg·L-1
Kan 和 400mg·L-1 Cef 的再生培养基上选择培养，在此转化体系上平邑甜茶抗性芽再生率达 9.0%。 对 27 个 Kan 抗性株系的叶片
进行 GUS 组织化学染色分析，23 个株系呈现出 GUS 染色阳性反应。 本研究为平邑甜茶的基因工程育种奠定了重要基础。
关键词：平邑甜茶；子叶；转化；再生；农杆菌
中图分类号：S661.1 文献标识码： A 文章编号： 1000-1700（2011）06-0663-05
Agrobacterium-Mediated Transformation of Malus hupehensis var. pingyiensis
Using Cotyledon Explants
DAI Hong-yan, LI Wen-ran, LIU Ji-han, LIU Yue-xue, ZHANG Zhi-hong
(College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenayng 110161, Chinaa)
Abstract： The factors that affect transformation efficiency, including the concentration of Agrobacterium, inoculation time, co-
culture time and delayed selection were studied in Agrobacterium-mediated transformation of Malus hupehensis var. pingyiensis
using cotyledon explants. A high -efficiency transformation system for M. hupehensis var. pingyiensis was developed. In this
protocol, the mature embryos were cultured on embryo germination medium for 7-10 days and then the paraxial cotyledons were
cut from the germinated embryos, the cotyledon explants were dipped in the solution (OD600=0.5) of Agrobacterium tumefaciens
strain EHA105 for 10 min and then were co -cultured on regeneration medium for 5 days, and the resistant buds were
regenerated from explants cultured on regeneration medium supplemented with 20 mg·L-1 Kan and 400 mg·L-1 Cef. The rate of
Kan resistant buds reached 9.0%. Among 27 Kan resistant lines, 23 lines were GUS-positive in the GUS histochemical test. The
establishment of high-efficiency transformation system laid a sound foundation for improving M. hupehensis var. pingyiensis by
gene engineering.
Key words： Malus hupehensis var. pingyiensis; cotyledon; transformation; regeneration; Agrobacterium
平邑甜茶(Malus hupehensis var. pingyiensis)是蔷薇科苹果属植物，是我国重要的苹果砧木之一。 平邑甜茶
为三倍体(2n=3x=51)，具有很强的无融合生殖能力，无融合生殖率在 95％以上[1]。 平邑甜茶的种胚由珠心壁细胞
发育而成，其实生后代与母本在遗传组成上一致 [2]，是苹果实生砧木育种的宝贵材料。 20 世纪 90 年代以来，国
内的一些学者致力于以平邑甜茶为亲本通过杂交育种的方式培育苹果无融合生殖矮化砧木的研究 [3-5]。 但是近
来的研究结果表明，平邑甜茶有性后代的无融合生殖能力大幅度地退化 [1]，因此，通过有性杂交来培育苹果无
融合生殖矮化砧木的途径可能走不通。 随着分子生物学理论和技术的发展，基因工程成为培育苹果无融合生
殖矮化砧木的新途径，而建立高效遗传转化体系是基因工程育种获得成功的基础。 外植体的类型影响遗传转
化的效率，叶片、茎尖、子叶、下胚轴等的离体再生能力不同，对农杆菌的敏感性也有差异。 其中子叶和下胚轴
的离体再生能力较强，而且对农杆菌也较敏感，所以选择子叶和下胚轴作为外植体往往可以获得较高的转化
率。 目前，关于子叶离体再生和转化的研究主要集中在一、二年生草本植物上，果树上有子叶离体再生的研究
报道[6-8]，而且表明子叶的离体再生能力高于叶片 [6]，但是关于以果树子叶为外植体的遗传转化研究鲜有报道。
本研究在建立平邑甜茶子叶高效再生体系的基础上 [8]，以近轴端子叶为外植体，建立高效的农杆菌介导的转化
体系，为平邑甜茶的基因工程育种奠定了重要基础。
第 42卷沈 阳 农 业 大 学 学 报
1 材料与方法
1.1 材料
2009年 10月，从沈阳农业大学果树试验基地种植的平邑甜茶植株上采集种子。将种子用 0.1%的 HgCl2进
行消毒，剥去种皮后将胚接种在成分为 SC[9]+0.5mg·L-1 BA+0.5mg·L-1GA3的胚萌发培养基中进行培养，7～10d
后剪取子叶，将其平均分成两部分，以近轴端子叶作为遗传转化外植体。
供试根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株为 EHA105（pCAMBIA2301），pCAMBIA2301 含在植物中
表达的 Kan抗性基因（nptⅡ）和 GUS报告基因。 pCAMBIA2301载体由中国农业科学院生物技术研究所吴燕民
研究员惠赠。
1.2 方法
1.2.1 农杆菌菌液制备 从固体 YEP培养基上挑取 EHA105（pCAMBIA2301）农杆菌单菌落，置于附加 Kan 50
mg·L-1及 Rif 100mg·L-1的 YEP液体培养基中，于 28℃，200r·min-1条件下振荡培养至 OD600=0.8，将菌液按照 1∶
20稀释于新鲜的 YEP液体培养基中，继续振荡培养至 OD600=0.5时备用。
1.2.2 侵染及抗性芽筛选 将剪好的外植体置于菌液中浸泡 10 min，期间不时晃动，然后用无菌滤纸吸干外
植体上多余菌液，转至再生培养基上，在黑暗条件下共培养 5d，然后将外植体转至附加 400mg·L-1头孢噻肟钠
（Cefotaxime，Cef）和 20mg·L-1 Kan的再生培养基（SC+1.0mg·L-1TDZ+0.2mg·L-1 NAA+0.5mg·L-1 GA3）中进行选择
培养，前 2周为暗培养，然后在约 2000 lx的光下进行培养。 待外植体上分化出抗性芽后，将外植体转移至附加
400mg·L-1 Cef、20mg·L-1Kan的增殖培养基(SC+2.0mg·L-1 BA+0.2 mg·L-1NAA) 中继续培养。 培养室温度为（24±
2）℃。
1.2.3 影响转化效率因素的试验设计 将农杆菌在液体 YEP 培养基中 200 r·min-1振荡培养，当菌液 OD600值
分别为 0.2，0.5，0.7 时侵染外植体，浸染时间 10 min，共培养 3 d 后进行筛选培养，考察不同农杆菌菌液浓度对
转化效率的影响。
用 OD600=0.5 的菌液浸泡外植体，分别浸泡 5，10，15，20min，共培养 3d 后进行选择培养，考察不同菌液浸
泡时间对转化效率的影响。
用 OD600=0.5 的菌液浸泡外植体 10min 后进行共培养，共培养时间分别设为 l，2，3，4，5d，考察不同共培养
时间对转化效率的影响。
外植体与农杆菌共培养后，先转入只含有抑制农杆菌生长的 Cef 培养基中分别培养 1，2d，然后再转入具
有 Kan选择压的筛选培养基中进行抗性筛选。 以不进行推迟筛选的处理为对照，考察不同推迟筛选时间对转
化效率的影响。
1.2.4 nptⅡ基因的 PCR检测 采用改良的 CTAB法[8]从平邑甜茶叶片中提取基因组 DNA，利用天根公司的质
粒小提试剂盒从大肠杆菌中提取植物表达载体 pCAMBIA2301。 设计 1 对扩增 npt Ⅱ基因片段的特异引物，正
向引物序列为 : 5′－GTTCTTTTTGTCAAGACCGACC－3′，反向引物序列为 ： 5′－CAAGCTCTTCAGCAATATCAC
G－3′。 采用常规 PCR进行扩增反应， 反应体积 20μL， 反应程序为：94℃预变性 3min，94℃变性 30s，58℃退火
30s，72℃延伸 1min，35个循环；72℃延伸 10min。 以质粒为阳性对照，未转化的植株为阴性对照。
1.2.5 GUS组织化学染色分析方法 采用组织化学染色法[10]检测 GUS基因表达，检测缓冲液成分包括 25mmol·
L-1磷酸盐缓冲液 （pH 值 7.0）、0.5mmol·L-1铁氰化钾、0.5mmol·L-1亚铁氰化钾、10mmol·L-1EDTA、0.1%Triton-
X100、0.5mg·mL-1X-gluc。 将待检测材料置于检测液中，于 37℃黑暗下保温 24h，然后经 FAA 溶液固定，70%乙
醇脱色 1d后观察染色情况。
1.2.6 数据统计及计算方法 以抗性芽再生率作为评价转化效率的标准。 外植体在附加筛选压的培养基中培
养 60d后调查抗性芽再生率，计算方法如下：抗性芽再生率（%）=抗性芽数/接种外植体数×100。
2 结果与分析
平邑甜茶近轴端子叶外植体在农杆菌 EHA105（pCAMBIA2301）侵染 8d后开始出现愈伤组织，之后愈伤组
织不断膨大并形成芽状突起（图版Ⅰ-A），20d 开始显现出白黄色的抗性芽（图版Ⅰ-B）；经过暗培养之后将培
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第 6期
表 1 外植体在菌液中浸泡时间对平邑甜茶转化效率的影响
Table 1 Effect of time of explants dipping in
Agrobacterium solution on transformation efficiency in
Malus hupehensis var. pingyiensis
浸泡时间/min
Dipping time
5
10
15
20
外植体数/个
No. of explants
141
182
112
101
抗性芽数/个
No. of resistant buds
1
4
0
0
抗性芽再生率/%
Rate of resistant bud
regeneration
0.7
2.2
0
0
注:农杆菌菌液浓度为 OD600=0.5，共培养时间 3d。
Note: The solution of Agrobacterium was OD600=0.5. Co-culture period
was 3 days.
代红艳等：农杆菌介导转化平邑甜茶子叶外植体的研究
养皿移至光下，白黄色的抗性芽逐渐转绿（图版Ⅰ-C）。 外植体上也形成一些逃逸芽，在暗培养期间逃逸芽为白
色，转到光下培养后继续保持白色或转变成红色（图版Ⅰ-D）。
图版 Ⅰ 平邑甜茶卡那霉素抗性转化植株的获得
A.侵染后的子叶产生愈伤组织; B.抗性芽再生; C.抗性芽转绿; D.逃逸芽; E.抗性芽抽生新梢; F.抗性植株
PlateⅠ Regeneration of plants with kanamycin resistance in Malus hupehensis var. pingyiensis
A. Callus forming on cotyledon after infection; B. Regeneration of resistant adventitious buds; C. Resistant adventitious buds turning green; D. Escape
buds; E. Resistant buds developed into shoot; F. Resistant plants
2.1 菌液浓度对转化效率的影响
不同的菌液浓度对转化效率有较大的影响。 菌液 OD600值为 0.2 时，抗性芽再生率为 1.2%；当 OD600值为
0.5 时，抗性芽再生率为 2.2%；当 OD600值为 0.7 时，外植体切口部位褐化现象严重，由于后期筛选时农杆菌过
量繁殖，导致外植体大量死亡，未能获得抗性芽。
2.2 外植体在菌液中浸泡时间对转化效率的影响
由表 1 可知，当平邑甜茶近轴端子叶在农杆菌菌液中的浸泡时间为 5min 时，抗性芽再生率为 0.7%；当浸
泡时间为 10min 时，抗性芽再生率明显提高，达 2.2%；浸泡时间为 15min 或 20min 时，外植体损伤较重，抗性芽
再生率为 0。
2.3 共培养时间对转化效率的影响
延长共培养时间明显提高平邑甜茶子叶转化效
率。当共培养时间为 1d时，没有获得抗性芽（表 2）；当
共培养时间为 4～5d 时，抗性芽再生率较高，其中共培
养 5d处理的抗性芽再生率达 9.0%。 但是当共培养 5d
后，外植体周围可见明显的农杆菌菌落，在后期的选
择培养过程中，农杆菌较难抑制。
2.4 推迟筛选对转化效率的影响
进行推迟筛选，子叶再生不定芽数量增加，但是
多数是逃逸芽，因此转化效率并未提高（表 3）。逃逸芽
的形成增加了后期筛选的工作量，因此，对于平邑甜
茶近轴端子叶的遗传转化， 以共培养 3d 后不进行推
迟筛选为宜。
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图 2 平邑甜茶转化植株叶片 GUS染色
A.非转化植株叶片; B.转化植株叶片
Figure 2 Analysis of leaf of Malus hupehensis var.
pingyiensis by GUS histochemical
A. Leaf of non-transgenic plant; B. Leaf of transformed plant
表 2 共培养时间对平邑甜茶转化效率的影响
Table 2 Effect of co-culture time on transformation
efficiency in Malus hupehensis var. pingyiensis
共培养时间/day
Co-culture time
1
2
3
4
5
外植体数/个
No. of explants
161
155
152
178
166
抗性芽数/个
No. of resistant buds
0
2
4
7
15
抗性芽再生率/%
Rate of resistant bud
regeneration
0.0
1.2
2.6
3.9
9.0
注:农杆菌浓度为 OD600=0.5，浸泡时间为 10 min。
Note:The solution of Agrobacterium was OD600=0.5. Dipping time was 10min.
图 1 平邑甜茶抗性植株中 npt Ⅱ基因的 PCR检测
M. 分子量标记 DL2000; 1. 非转化植株; 2. 质粒 pCAMBIA2301; 3~
10. Kan 抗性植株
Figure 1 Amplification of the npt Ⅱ gene fragment
in the resistant plants of Malus hupehensis var.
pingyiensis by PCR
M. DL2000 Marker; 1. Non-transgenic plant; 2. pCAMBIA2301; 3-10.
Kan-resistant transformed plants
表 3 推迟筛选时间对平邑甜茶转化效率的影响
Table 3 Effect of delayed selection time on transformation efficiency in Malus hupehensis var. pingyiensis
推迟筛选/d
Time of delayed selection
0
1
2
外植体数/个
No. of rexplants
152
175
182
再生芽数/个
No. of regenerated buds
4
5
10
逃逸芽数/个
No. of escape buds
0
1
6
抗性芽数/个
No. of resistant buds
4
4
4
抗性芽再生率/%
Rate of resistant bud regeneration
2.6
2.3
2.2
注:农杆菌浓度为 OD600=0.5，浸泡时间为 10 min，共培养 3d。
Note:Agrobacterium solution was originally OD600=0.5. Dipping time was 10 min. Co-culture time was 3 days.
2.5 转化植株的获得和鉴定
将在附加 20mg·L-1Kan 的再生培养基上筛选出
的抗性芽转入附加 20mg·L-1Kan 新梢抽生培养基继
续培养，抗性芽发育成嫩梢（图版Ⅰ-E），并分化成植
株（图版Ⅰ-F）。 本研究共获得了 27 个具有 Kan 抗
性的独立的转化株系。
利用 PCR 技术对 Kan 抗性植株进行检测，结果
表明 27个转化植株和 pCAMBIA2301 质粒均能扩增
出 nptⅡ基因 562bp 的特异谱带，而非转化植株未能
扩增出谱带（图 1）。
从在含 Kan培养基上筛选 60d 的抗性植株上剪取叶片，进行 GUS 组织化学染色分析。 结果表明，27 个具
有 Kan抗性的转化株系中有 23 个叶片表现出的蓝色反应（GUS 染色阳性反应），叶脉处有明显的染色变化，蓝
色较深（图 2）。 GUS组织化学染色结果表明外源 GUS基因已经整合到平邑甜茶染色体上，并得到稳定表达。
3 结论与讨论
农杆菌介导的苹果叶片遗传转化效率很低，一般在 1%以下。 师校欣等[11]研究表明，嘎拉、王林、乔纳金、富
士等 4个苹果品种的转化率为 0.06%~0.76%，转化效率与叶片离体再生能力一致；张志宏等[12]转化苹果品种新
乔纳金时，抗性芽诱导率为 0.62%。 外植体的离体再生能力是影响遗传转化效率的重要因素，子叶的离体再生
能力较强，因此，以子叶作为外植体往往可以获得到较高的转化率。 平邑甜茶子叶再生不定芽的能力远高于叶
片[8,13-14]，本研究结果表明，以子叶作为平邑甜茶遗传转化的外植体，抗性芽再生率达 9.0%，远远高于苹果叶片
作为外植体时的转化效率。 由于平邑甜茶具有高度的无融合生殖特性，虽然子叶源自种子，但是在遗传上与叶
片相同，因此，子叶是平邑甜茶适宜的转化试材。
A B
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共培养时间是影响外源基因从农杆菌向植物细胞转化的重要因素，因为农杆菌附着后并不能立刻转化，只
有在创伤部位生存 16h 以上后才有转化功能，但若共培养时间太长，农杆菌过度生长易导致植物细胞受伤害，
而且后期农杆菌难以被抗生素抑制。 许多学者致力于共培养时间的研究，表明多数植物材料的适宜共培养时
间为 2~4d[15-17]。 本研究结果表明，共培养时间对于平邑甜茶子叶遗传转化的影响明显，在共培养 4~5d 时，抗性
芽再生率可达 3.9%和 9.0%，分别比共培养 3d提高了 50.0%和 2倍以上。
本研究建立了农杆菌介导的以子叶为外植体的平邑甜茶遗传转化体系，抗性芽再生率达 9.0%，为平邑甜
茶的基因工程育种奠定了重要基础。
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[责任编辑 马迎杰]
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