全 文 ：虎耳草 ISSR反应体系的建立及优化
贺安娜1, 2 , 3 , 　　欧立军1 , 2 ,3 , 　　王玉娇1 , 　　佘朝文1, 2 , 3
(怀化学院 1.生命科学系;　2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室;
3.湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室 , 湖南 怀化　418008)
摘　要:建立并优化虎耳草 ISSR-PCR反应体系和扩增程序 , 为探讨虎耳草种质资源遗传多样性奠定基础.采
用正交设计方法和单因子试验 , 研究 TaqDNA聚合酶 、 dNTP、 Mg2+ 、 引物 、 模板 DNA、 延伸时间及循环次数对 PCR
扩增的影响.结果表明:虎耳草 ISSR-PCR的最佳反应体系为:在 25μL 的反应体系中含模板 DNA 35ng , Mg2+1.25
mmol L、 dNTP 380μmol L、 引物 1.2μmol L、 Taq DNA 聚合酶 1.5U.反应程序为:95℃预变性 5min;94℃变性 1min ,
50℃(据不同引物的退火温度)退火 70s , 72℃延伸 1.5min , 40 个循环;72℃延伸 10min , 4℃保存.经过 11份虎耳草
种质检验 , 证明该体系稳定可靠 , 可用于虎耳草种质资源遗传多样性分析及居群鉴别的研究.
关键词:虎耳草;　ISSR-PCR;　反应体系;　优化
中图分类号:R282　　　文献标识码:A　　　文章编号:1671-9743 (2012)11-0045-05
收稿日期:2012-10-27
项目基金:民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室开放基金 (ZDSYSJJ2012-4);湖南省科技计划重点项目
(2009FJ2008;2012FJ4064).
作者简介:贺安娜 (1981-), 女 , 湖南邵阳人 , 怀化学院讲师 , 硕士 , 主要研究药用植物资源.
　　虎耳草 (Saxifraga stolonifera Curt.)为虎耳草科多
年生草本植物 , 又名石荷叶 、 金线吊芙蓉 、 老虎耳等.
生于林缘 、 岩坡石隙 , 广泛分布于我国各地[ 1] .全草
干用或鲜用 , 具有消炎 、 解毒之功效[ 2] , 是多个民族
的常用药.其主要成分有岩白菜素 (bergenin)、 槲皮
素 、原儿茶酸 、 没食子酸等[ 3] .由于虎耳草野生资源
丰富 , 目前用药主要来源于野生资源 , 为了从野生虎
耳草中筛选出性状优良的品种 , 研究野生虎耳草的遗
传多样性极有必要.但对虎耳草的研究主要集中在药
理 、药化方面[ 4-5] , 对其种质资源的遗传多样性研究 ,
特别是运用 ISSR等分子手段的研究未见报道.
ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)分子标记技术
又称为简单序列重复区间扩增 , 由加拿大蒙特利尔大
学的 Zietkiewicz等在 1994 年提出的[ 6].该项技术标记为
随机引物 , 具有操作简单 、 成本低 、 快速灵敏 、 多态
性高 、 所需 DNA量少以及无需预知研究对象的基因组
序列等优点 , 同时也具有 SSR的稳定性 , 近年来已迅
速应用于分子生药鉴定 、 遗传作图 、 种质资源遗传多
样性[ 7-8] 等领域的研究.但该项技术的稳定性受 ISSR
-PCR反应各因子的影响 , 且不同植物的 ISSR反应体
系中的各 成分 、 反应 程序和最 佳引物均存 在不
同[ 9-11] , 因此进行 SSR-PCR体系的建立和优化是进
行应用研究的前提 , 前人对药用植物[ 12] 及农作物[ 13] 的
ISSR反应体系的优化均有报道 , 每种植物的体系都不
尽相同.本研究采用正交和单因素相结合实验设计 ,
建立虎耳草 ISSR-PCR最佳反应体系 , 并筛选出扩增
反应中的退火温度 、 延伸时间以及循环次数 , 获得
ISSR-PCR反应的最佳扩增程序 , 为今后虎耳草遗传
多样性 、 亲缘关系 、 系统进化等方面奠定基础.
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
采自湖南 、 广西 、 四川等省不同区域 11 份材料 ,
经鉴定均为虎耳草.其中用于体系优化和引物筛选试
验源自湖南怀化 , 其他材料均用作体系验证 .DNA 扩
增采用的是MJ Research 公司的PTC-100TM PCR仪.图
像分析采用成都梦虎科技有限公司生产的 Tanon 4100
数码凝胶图像处理系统.ISSR引物购自上海生兴生物
工程公司 , dNTP 、 Taq 酶和 DNA Marker 购自 TIANGEN
科技生化 (北京)有限公司.
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA提取
以虎耳草嫩叶为材料 , 采用 CTAB法提取基因组
DNA , 用 1.0%琼脂糖电泳和核酸检测仪检测DNA质量
浓度 , 并稀释至 30 ng μL.
1.2.2　ISSR-PCR反应体系正交试验设计
采用 L16 (45)正交试验设计 , 对Mg2+ 、 dNTP 、 引
物 、 Taq酶和模板 DNA 进行 5 因素 4 水平筛选 , 如表
1.此外 , 还包括 2.5μL 10 ×PCR Buffer , 引物选用
(AC)8T , 总反应体系为 25μL.PCR扩增程序:95℃预变
性 10 min , 94℃变性 1 min , 50℃退火 70 S , 72℃延伸
1.5 min , 39 个循环 , 最后 72℃延伸 10 min.扩增结束
第 31卷第 11 期　　 　 　　　　　　怀化学院学报　　 　 　　　　　　Vol.31.No.11
2 0 1 2年 1 1月　 　 　 　 　JOURNAL OF HUAIHUA UNIVERSITY　 　 　 　 　 　Nov., 201 2
DOI :10.16074/j.cnki.cn43-1394/z.2012.11.009
后 , 产物在 2.0%琼脂糖凝胶上电泳 , 凝胶中含 0.05%
的溴化乙锭 , 电极缓冲液为 1 ×TAE , 电压 5 V cm.电
泳结束后在凝胶成像分析仪上观测分析并照相.
表 1　正交实验设计 L16 (45)
组合
因素 Factor
Taq 酶
(U)
dNTP
(μmol.L-1)
Mg2+
(mmol.L-1)
引物
(μmol.L-1)
DNA
(ng)
1 0.5 200 1.00 1.4 25
2 1.0 200 1.25 1.2 30
3 1.5 200 1.50 1.0 35
4 2.0 200 1.75 0.8 40
5 2.0 260 1.00 0.8 40
6 1.5 260 1.25 1.0 35
7 0.5 260 1.50 1.2 30
8 1.0 260 1.75 1.4 25
9 2.0 320 1.00 1.2 35
10 1.5 320 1.75 1.4 25
11 0.5 320 1.25 0.8 40
12 1.0 320 1.50 1.0 30
13 0.5 380 1.00 0.8 40
14 1.0 380 1.25 1.0 35
15 1.5 380 1.50 1.2 25
16 2.0 380 1.75 1.4 30
1.2.3　ISSR-PCR反应体系单因子试验
依据正交试验结果 , 选择扩增效果较好的反应体
系 , 在此基础上进行单因素实验 , 进一步优化影响扩
增效果的因素 .其中 Taq 酶用量设置 0.5 、 1.0 、 1.5 、
2.0、 2.5U 5 个梯度 , dNTP 浓度设置 140 、 200 、 260 、
320、 380 、 440 μmol L 6 个梯度 , Mg2+浓度设置 1.00 、
1.25 、 1.50 、 1.75 、 2.00、 2.25 mmol L 6 个梯度 , 引物
浓度设置 0.60、 0.80 、 1.00、 1.20 、 1.40、 1.60 μmol L
6 个梯度 , DNA 模板设置 20 、 25 、 30 、 35 、 40 、 45 、
50 、 55共 8个梯度.每一个最佳条件确定后作为后续
研究的一个条件.
1.2.4　ISSR-PCR反应程序优化
在确定最佳反应体系基础上 , 对延伸时间和循环
次数进行优化筛选 .延伸时间设 4 个处理 , 分别为
0.5、 1 、 1.5 、 2 min;延伸温度为 72℃.循环次数设 5
个处理 , 分别为 25 、 30 、 35 、 40和 45次.
1.2.5　引物筛选与优化体系应用
根据 ISSR-PCR的最佳反应体系和扩增条件进行
引物筛选 , 并随机选取引物 (AC)8T , 对 12 份虎耳草
种质材料进行 DNA 扩增 , 检测其稳定性.
1.2.6　数据分析
以上实验各重复 3次 , 取 3 次扩增效果相同的进
行统计分析.
2　结果与分析
2.1　PCR正交设计直观分析
根据 L16 (45)正交试验 PCR 产物电泳结果发现
(图 1), 所有组合均能扩增出谱带 , 但不同组合条带的
数目和清晰度不一致.以特异谱带多态性高 、 背景干
扰低 、 主带清晰 、 副带明显为原则 , 同时考虑实验成
本 , 确定第 6组合为虎耳草 ISSR-PCR的最佳反应体
系.
图 1　虎耳草 ISSR-PCR正交试验
注:1-16处理编号同表 1
2.2　单因子试验结果分析
2.2.1　Taq酶用量对 ISSR-PCR的影响
如图 2所示 , 在一定范围内 , 扩增谱带的清晰度
随着 Taq 酶用量的增加而逐渐增加 .当 Taq 酶用量为
1.5U时 , 扩增谱带的清晰度已达最大 , 结合条带的清
晰度和实验成本 , 确定 1.5 U为虎耳草 ISSR反应中 Taq
酶的最佳用量.
图 2　Taq酶用量对 ISSR-PCR扩增的影响
2.2.2　dNTP浓度对 ISSR-PCR的影响
由图 3 可知 , 当 dNTP浓度低于 380μmol L时 , 扩
增条带数目较低 , 浓度为 380μmol L时 , 条带达到最高
·46· 怀化学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　2012 年 11月
清晰度 , 以后浓度再增加 , 条带的数目与清晰度基本
不变化 .综合考虑条带清晰度与试验成本 , 确定
380μmol L为虎耳草 ISSR-PCR反应体系的最佳 dNTP
浓度.
440mmol L 380mmol L 320mmol L 260mmol L 200mmol L 140mmol L　M
图 3　dNTP浓度对 ISSR-PCR扩增的影响
2.2.3　Mg2+浓度对 ISSR-PCR的影响
Mg
2+浓度对 PCR 反应中的 Taq DNA 聚合酶的活
性 、 PCR扩增条带的特异性都有一定的影响 .在本实
验中 , 扩增条带随Mg2+浓度的升高 , 清晰度增加的情
况均不是很明显 (图 4), 因此 , 综合考虑条带清晰度
与试验成本 , 确定 1.25 mmol L为虎耳草 ISSR-PCR反
应体系的最佳Mg2+浓度.
　225mmol L 200mmol L 175mmol L 150mmol L 125mmol L 100mmol L　M
图 4　Mg2+浓度对 ISSR-PCR扩增的影响
2.2.4　引物浓度对 ISSR-PCR的影响
不用浓度的引物都能经 PCR扩增出条带 , 随浓度
的升高 , 清晰度也逐渐增加 (图 5).当浓度为 1.2
μmol L时 , 条带达到最高清晰度 , 以后的浓度增加 ,
条带的数目与清晰度便不再增加.因此 , 综合考虑条
带清晰度与试验成本 , 确定 1.2 μmol L 为虎耳草 ISSR
-PCR反应体系的最佳引物浓度.
　 1.4mmol L 1.2mmol L 1.0mmol L 0.8mmol L 0.6mmol L　M
图 5　引物浓度对 ISSR-PCR扩增的影响
2.2.5　模板 DNA浓度对 ISSR-PCR的影响
DNA模板量过低时 , 产物少且不稳定.DNA 模板
量过高时 , 会导致扩增条带模糊并且出现非特异性产
物.图 6显示 , DNA模板量在 20 ～ 40 ng均能扩增出有
效条带 , 当 DNA 用量为 35 ng 时 , 条带达到最高清晰
度 , 以后 DNA 用量增加 , 条带的数目与清晰度不再增
加.综合考虑条带清晰度与试验成本 , 确定 35 ng为虎
耳草 ISSR-PCR反应体系的最佳 DNA 用量.
　　 40ng　 35ng　 30ng　 25ng　 20ng　 M
图 6　模板 DNA浓度对 ISSR-PCR扩增的影响
2.3　ISSR-PCR反应程序优化
2.3.1　循环次数对 ISSR-PCR的影响
循环次数对 PCR扩增产物量有直接的影响 .循环
次数少了 , 产物量低 , 循环次数多了会扩增出非特异
性条带.从图 7 可知 , 本实验循环次数在 25 ～ 30 之间
时 , 条带的数目比较少.以后随着循环次数的增加 ,
条带逐渐增多.40 个循环以后 , 得到的条带与清晰度
最为合适.45个循环与 40个循环的条带差异不大.为
节省时间 , 确定虎耳草 ISSR-PCR反应的最佳循环次
数为 40个循环.
　45cycle　40cycle　35cycle　30cycle　25cycle　　M
图 7　循环次数对 ISSR-PCR扩增的影响
2.3.2　延伸时间对 ISSR-PCR的影响
当延伸时间为 0.5 min时 , 延伸时间过短 , 无法完
成一些较大片段的扩增 .当达到 1.5 min 的延伸时间
时 , 扩增的条带数目最多 , 条带清晰可见 , 再继续增
加延伸时间 , 其条带表现与 1.5 min 的条带差异不大
(图 8).因此 , 确虎耳草 ISSR-PCR反应的时间为 1.5
min.
　 2.0min　　1.5min　　1.0min　　0.5min　 　M
图 8　延伸时间对 ISSR-PCR扩增的影响
2.4　ISSR-PCR正交反应体系应用
应用确定的虎耳草 ISSR-PCR的最佳体系 , 从 50
个 ISSR引物中筛选出 15 个扩增稳定 、 多态性高的引
物 , 见表 2.如图 8 所示 , 以 (AC)8T 为引物运用最优
组合对 11份虎耳草种质材料进行扩增 , 扩增出的特异
性条带的数最少为 4 条 , 最多 8 条 , 并且条带清晰 、
重复性好 , 能区分 11 份虎耳草种质 , 这表明确定的
ISSR-PCR反应体系稳定可靠 , 可应用于虎耳草的分
子标记研究中.
·47·第 31 卷第 11 期　　　　　　贺安娜 , 欧立军 , 王玉娇:虎耳草 ISSR反应体系的建立及优化
表 2　筛选的虎耳草 ISSR引物和最佳退火温度 (Tm)
引物 序列 退火温度 (℃) 引物 序列 退火温度 (℃)
ISSR-807 (AG)8T 48℃ ISSR-829 (TG)8C 50℃
ISSR-811 (GA)8C 50℃ ISSR-843 (CT)8RA 48℃
ISSR-813 (CT)8T 48℃ ISSR-845 (CT)8RG 50℃
ISSR-817 (CA)8A 48℃ ISSR-847 (CA)8RC 50℃
ISSR-819 (GT)8A 48℃ ISSR-849 (GT)8YA 48℃
ISSR-821 (GT)8T 48℃ ISSR-851 (GT)8YG 50℃
ISSR-823 (TC)8C 50℃ ISSR-855 (AC)8YT 48℃
ISSR-825 (AC)8T 48℃
图 9　优化的 ISSR-PCR反应体系对 11份虎耳草种质 DNA 扩增结果
注:1-11编号为不同虎耳草种质 , M为 Marker
3　讨论
ISSR是基于 PCR反应的分子标记技术 , 因此合适
的PCR参数是保证 ISSR-PCR扩增效果的基本条件 .
本研究在预试验中用天门冬的反应条件[ 12] 进行虎耳草
ISSR-PCR扩增 , 扩增出的条带极不清晰 , 未获得良
好的扩增效果.可见 , ISSR最佳扩增条件在不同物种
中各有不同 , 针对物种进行反应体系的优化很有必要.
ISSR-PCR反应体系的优化方法多采用正交或单
因素设计 , 正交设计可以更快更有效地分析不同因素
的互相作用 , 但处理水平的设置相对有限 , 单因素设
计可以较系统和精细地研究各主要因子的影响 , 但无
法探讨因素间互作效应.本实验首先采用正交设计筛
选出可扩增出条带的 PCR反应体系 , 然后结合单因子
设计进一步优化体系 , 弥补上述实验不足 , 可以简单
快速地建立虎耳草 ISSR-PCR反应体系 , 得到稳定且
多态性丰富的扩增谱带.
组成反应的体系和程序中的每一个因子几乎都可
以影响到扩增的效果 .dNTPs作为聚合链的原料 , Taq
酶作为聚合酶 , 在 PCR反应中起着非常重要的作用 .
一般说来 , PCR体系中的 Taq酶和 dNTPs需要达到临界
浓度 , 避免条带的模糊和数目的减少.从本文试验结
果来看 , 当Taq酶和dNTPs达到一定量时 , 扩增的效果
达到最佳 , 以后即使增加量 , 扩增效果只是和临界位
点一致.为达到最佳扩增效果和节约成本 , 应该在每
个 PCR反应大规模进行前摸索出临界浓度.Mg2+浓度
过高可降低 PCR扩增的特异性 , 过低则影响 PCR扩增
产量甚至使扩增失败而不出扩增条带 .从本文的结果
来看 , 反应体系中Mg2+浓度在 1.50 mmol L时能扩增
出较好的谱带.因此 , 最终建立虎耳草 ISSR-PCR的
最佳反应体系为:在 25 μL的反应体系中含 35 ng的模
板 DNA 、 1.5 UTaq 酶 、 1.2 μmol L 引物 、 0.38 mmol L
dNTPs 、 1.25 mmol LMg2+.
在 ISSR-PCR反应程序中 , 退火温度 、 延伸时间
和循环次数对其有显著影响 , 其中退火温度影响最大 ,
温度过低将导致适当的错配 , 从而扩大引物在基因组
上配对的随机性 , 而温度过高虽可以提高引物与模板
结合的专一性 , 却会降低引物与模板的结合程度[ 13] .
本研究显示 , 虎耳草 ISSR特异性引物退火温度在 50℃
左右.通过单因素实验 , 确定 ISSR-PCR扩增程序为:
95℃预变性 10 min;94℃变性 1 min , 退火 70 s , 72℃延
伸 1.5 min , 40个循环;72℃延伸 10 min , 4℃保存.
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Establishment and Optimization of ISSR Reaction System
for Saxifraga Stolonifera Curt.
HE An-na1, 2 , 3 , 　　OU Li-jun1 , 2 ,3 , 　　WANG Yu-jiao1 , 　　SHE Chao-wen1, 2 , 3
(1.Department of Life Science , Huaihua University;　2.Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of
Hunan Province;Key Laboratory of Xiangxi Medicinal Plant and Ethnobotany of Hunan Higher Education , Huaihua , Hunan 418008)
Abstract:To establish and optimize ISSR-PCR reaction system for Saxifraga stolonifera Curt.and lay foundation for its
genetic diversity research.The single-factor and orthogonal design were applied for optimizing seven factors in the ISSR-PCR
reaction system including Mg2+ , dNTP , primers , Taq DNA polymerase , the template DNA , extension time and cycles.The
results showed that the suitable PCR reaction system contained 35 ng template DNA , 1.25 mmol LMg2+ , 380μmol L dNTP , 1.2
μmol L primer and 1.5U Taq DNA polymerase in total 25μL reaction solution.The suitable PCR procedure was:preliminary
denaturizing at 95℃ for 5 min;denaturized at 94℃ for 1min , annealing at 50℃ for 30s , extended at 72℃ for 1.5min , 40
cycles and a final extension at 72℃ for 10 min , then kept the temperature at 4℃.It is proved to be stable and credible for the
result of 11 Saxifraga stolonifera Curt.populations.That s mean it is suitable for the study on genetic diversity of germplasm
resource and identification of Saxifraga stolonifera Curt.population.
Key words:Saxifraga stolonifera Curt.;　ISSR-PCR;　reaction system;　optimization
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