全 文 ：驱虫斑鸠菊对 B-16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性及黑素生成影响
邓瑞春1 ,周　勇1 ,章金刚2 ,徐建国3 ,尚　靖1 ,于鲁海3 ,王冬平4
(1 北京中医药大学中西医结合研究所 ,北京　100029;2 新疆自治区人民医院临床药学研究所;
3 军事医学科学院野战输血研究所;4 军事医学科学院实验动物中心)
摘要:目的:探讨驱虫斑鸠菊体外对酪氨酸酶活性影响 , 以及对小鼠 B-16黑素瘤细胞株细胞增殖 、黑素合成以及细胞内
酪氨酸酶的作用。方法:利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定药物对细胞增殖的影响;采用酶学方法研究药物对酪氨酸酶
活性的影响;470nm 比色法测定黑素含量。结果 驱虫斑鸠菊体外可激活酪氨酸酶活性 , 增强 B-16 鼠黑素瘤细胞增殖 ,提高
酪氨酸酶和黑色素合成能力;对整体动物黑素细胞具有促进合成和分泌作用。结论 在白癜风的治疗中 ,驱虫斑鸠菊可增强酪
氨酸酶活性 ,进而促进黑素合成。
关键词:驱虫斑鸠菊;酪氨酸酶;白癜风;鼠黑素瘤细胞
中图分类号:R285.5　　　　文献标识码:A　　　　　　文章编号:1006-8376(2002)01-0031-04
　　驱虫斑鸠菊注射液是从新疆特有的菊科植物驱
虫斑鸠菊(Vernonia anthelmint ica)[ 1 , 2] 的种子研制
而成的浅棕色灭菌水溶液。具有燥湿祛风 , 舒筋通
络 ,活血化瘀作用;临床应用结果显示 ,其治疗白癜风
具有明显效果。本室前期工作证明驱虫斑鸠菊可明
显抑制小鼠脾脏细胞活性。已有文献报道其对蘑菇
酪氨酸酶(mushroom tyrosinase)活性有明显促进作
用。为了深入研究驱虫斑鸠菊治疗白癜风的作用机
理 ,本文以正常小鼠和体外培养的小鼠黑素瘤细胞作
模型 ,探讨驱虫斑鸠菊作用分子机理 ,为其在临床上
广泛应用提供理论依据。
1　材料和方法
1.1　试剂和材料
驱虫斑鸠菊注射液:每毫升相当于驱虫斑鸠菊黄
酮3 mg(约相当于原生药 250 mg);DMEM(Hy-
clone);DL-多巴:ACROS 公司产品(USA);酪氨酸
酶:6850u/mg BIOCHEMIKA(SW ITZERLAND)。
噻唑兰(MTT)Amersham Life sciene (USA);曲拉通
收稿日期:2001-12-15
作者简介:邓瑞春(1960—),女,博士研究生,主要从事中药免疫药理研究。
X-100(SIGMA , USA);二甲基亚砜(DMSO),北京
石鹰华工厂;小鼠黑素瘤细胞:由本室冻存 。实验动
物:健康 、雌性 ,体重(20±2)g Balb/c纯系小鼠 ,购自
军事医学科学院实验动物中心 。TGL 16g 台式高速
离心力(上海医用分析仪器厂);΢960酶联免疫测定
仪(德国)。CO2 培养箱(Heraeus 上海分公司);多用
振荡器(北京冰箱电机厂)。
1.2　方法
1.2.1　酪氨酸酶活性测定:参见文献(1 ～ 5),并稍加
修改 。分别在 0.5 ml离心管中 ,依次加入下列溶液
(表 1),溶液 37 ℃,温育 5 min ,酪氨酸酶加入后立刻
测定 475 nm 吸光度值 。
表 1　　溶液加入量
溶液 加 入 量
驱虫斑鸠菊 0 50 100 150 200 250
0.01mol/LPB 缓冲液 250 200 150 100 50 0
6mmol/ LL-DOPA 200 200 200 200 200 200
6850u/ml酪氨酸酶 20 20 20 20 20 20
1.2.2　试剂配制和实验分组:体外实验共分 8个实
验组:驱虫斑鸠菊用含 10%小牛血清的高糖 DMEM
培养基配制 ,其质量浓度分别为 3×10-1 、3×10-2 、3
×10-3 、3×10-4 、3×10-5 、3×10-6 、3×10-7 g/L ,空
白对照组仅加入培养基 。体内实验共分 4个实验组:
　　Abstract:Crystallization is one of common methods to refine ty rosine.In this process , the factors influenc-
ing the quality of production w ere so many that we had to optimize technological condit ions by the o rthogonal
test.The result showed that high guality ty rosine could be obtained under the following condi tions:solution con-
centration of 6%, ammonia w ater concentration of 5%,destination pH of 2.0 ,weight ratio of act ive carbon to ac-
tive w hite soil of 3:1 and neuralization temperature of about 60 ～ 70℃.
Key words:cry stallization;tyrosine;orthogonal test analy sis
·31·氨基酸和生物资源Amino Acids &Biotic Resources 2002 , 24(1):31～ 32
DOI :10.14188/j.a jsh.2002.01.013
将Balb/c 纯系小鼠随机分成 4 组 ,每组 10只:驱虫
斑鸠菊组 ,共设 3 个剂量组 ,分别是:低剂量(VM -
L)87.5mg/Kg/天 ,为临床用量 5 倍;中剂量(VM -
M)175mg/Kg/天 ,为临床用量 10 倍;高剂量(VM -
H)350mg/Kg/天 ,为临床用量 20 倍 ,临用前用生理
盐水配制。正常对照组注射生理盐水 。每天给药一
次 ,腹腔注射 ,每次 0.5 ml ,共给药 10天。
1.2.3　小鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性测定[ 3 ～ 5] 用
高糖 DMEM 置 CO2 孵箱 37 ℃, 5%CO2 ,饱和湿度
环境常规进行培养 ,每一次实验均取自同一传代细
胞。待细胞生长至近融合状态 ,经 0.25%胰蛋白酶
消化收集并调整细胞浓度 5000个/cm2 ,96 孔细胞培
养板加入小鼠黑素瘤细胞单细胞悬液 100μl /孔 ,待
贴壁后加入含中药的培养液 ,分别继续培养 24 、48 、
72h后弃培养液 ,用 pH7.4 的 PBS 洗涤 2次 ,每孔加
入 1%TritonX-100 溶液 50 μl ,迅速置-80 ℃冻存
30 min ,随后室温融化使细胞完全裂解 ,37 ℃预温后
加入 1%L-DOPA 溶液 10 μl , 37 ℃反应 2 h ,测定
490 nm 吸光度值 。每一浓度设 4个复孔 ,取平均值 。
1.2.4　小鼠黑素瘤细胞代谢活性测定[ 6] 同上细胞
培养方法和分组原则 ,培养 72 h ,于结束前 4 h 加入
0.5 mg/ml MT T 10 μl/孔 ,此时 MTT 经线粒体膜琥
珀酸脱氢酶转化为甲替(formazan),4 h 后弃上清夜 ,
加入 DMSO100μl/孔 ,震荡 10 min左右 ,使甲替结晶
完全溶解 。立即于酶标仪测定 570 nm 光吸收值 。
1.2.5　黑素含量测定[ 7]选择对数生长期细胞 ,将细
胞浓度调整为 3×104个/ml ,加入 24孔细胞培养板 ,
每孔 1 ml ,待细胞贴壁生长后加入含中药的培养液
每孔 1 ml ,对照不加 。同上条件培养 4天后 ,再用 0.
25%胰蛋白酶消化 6 ～ 8 min ,将细胞收集入离心管
500 g 离心 10 min倾去上清 ,再用 PBS 洗 2次后 ,用
1N NaOH 0.5 ml在37 ℃作用 48 h充分碱裂解细胞
和溶解黑素颗粒。100 μl/孔加入 96孔板中 ,用酶标
仪测定 475 nm 或 405 nm 光吸收值 。每一浓度设 4
个复孔 ,取平均值。
1.2.6　对小鼠血清中酪氨酸酶活性影响 将健康 、雌
性 ,体重(20±2)g Balb/c纯系小鼠 ,随机分成 4 组 ,
每组 10只:驱虫斑鸠菊组 ,共设 3个剂量组 ,分别是:
低剂量 、中剂量 、高剂量。正常对照组用注射生理盐
水替代。每天给药一次 ,腹腔注射 ,每次 0.5 ml ,共
给药 10天 ,第 11天眼动脉放血处死 ,收集血清。按
上述方法测定血清酪氨酸酶活性。
1.2.7　数据处理 所测实验数据采用配对计量资料 t
检验 。
2　结果
2.1　驱虫斑鸠菊体外对酪氨酸酶活性影响
体外将酪氨酸酶 、驱虫斑鸠菊注射液以及左旋多
巴溶液(底物)混合 ,室温下测定驱虫斑鸠菊对酪氨酸
酶活性的影响 ,结果见图 1。
图 1可见 ,当驱虫斑鸠菊浓度(主要成分黄酮的
质量浓度在 0.3 ～ 1.5 g/L 范围)逐渐增加时 ,体外可
以激活酪氨酸酶活性 ,并且随浓度增高激活作用逐渐
增强 。
2.2　驱虫斑鸠菊对 B-16 小鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶
活性的影响
图 2为驱虫斑鸠菊体外对小鼠黑素瘤细胞酪氨
酸酶活性的影响。结果表明 ,首先驱虫斑鸠菊在作用
24 h后酪氨酸酶活性未见明显增加 ,作用 48 h后酪
氨酸酶活性明显增加 ,但是 72 h后酪氨酸酶活性又
下降到 24 h的活性水平。其次 ,当驱虫斑鸠菊浓度
在 3×10-7 ～ 3×10-4 g/L 范围时 ,随浓度增加酪氨
酸活性逐渐增强 ,浓度再增加 ,则酪氨酸酶活性反而
下降 。其可能的原因是高浓度的驱虫斑鸠菊在体外
可能对小鼠黑素瘤细胞有毒性作用 ,从而抑制了酪氨
酸酶的分泌。
药物质量浓度(g/ L)
图 1　驱虫斑鸠菊体外对酪氨酸酶活性的影响
药物质量浓度(g/ L)
图 2　驱虫斑鸠菊对小鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响
3　驱虫斑鸠菊对小鼠黑素瘤细胞代谢活性的影响
用 MTT 比色法测定不同浓度驱虫斑鸠菊对体
·32· 邓瑞春 ,周勇 ,章金刚 ,等.驱虫斑鸠菊对 B-16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性及黑素生成影响
外培养 72h的小鼠黑素瘤增殖的影响 ,结果见图 3 。
药物剂量(g/ L)
图 3　驱虫斑鸠菊对 B-16 细胞生长活性影响
从图 3可见 ,驱虫斑鸠菊的质量浓度在 3×10-7 ～ 3
×10-2范围内可促进小鼠黑素瘤细胞增殖 ,表现为
随药物浓度增加 , 570 nm 光密度吸收值增加。当超
过该浓度范围时药物对细胞生长产生毒性作用 ,形态
上可见大部分细胞死亡 , 570 nm 光密度吸收值下降 。
2.4　驱虫斑鸠菊对小鼠黑素瘤细胞黑素含量的影响
驱虫斑鸠菊对小鼠黑素瘤细胞作用 4天后测定
黑素含量 。从图 4可见 ,在所测定驱虫斑鸠菊的浓度
范围(0.6×10-7 , 0.6×10-1)内 ,随药物浓度增高 ,
黑素含量不断增加 ,当浓度继续增加 ,则出现下降趋
势。说明驱虫斑鸠菊在高浓度时对黑素合成也有抑
制作用。
药物剂量(g/ L)
图 4　驱虫斑鸠菊对 B—16 细胞黑素合成的影响
2.5　对小鼠血清中酪氨酸酶活性影响
以正常 Balb/c小鼠为实验动物 ,将不同浓度药
物从腹腔注射给药 , 10 天后从眼动脉放血 ,收集血
清 ,测定各组动物血清中酪氨酸酶活性 。从图 5结果
可见 ,与对照组相比 ,驱虫斑鸠菊注射液高(VM -
H)、中(VM -M)、低(VM-L)三个剂量组的酪氨酸
酶活性均明显增高(P<0.01)。
图 5　驱虫斑鸠菊对小鼠血清酪氨酸酶活性影响
3　讨论
本研究采用正常小鼠和小鼠 B-16 黑素瘤细胞
作为模型 ,研究该药在体内 、体外对酪氨酸酶活性 ,以
及对黑素瘤细胞生长 、合成黑素的影响 。结果显示 ,
驱虫斑鸠菊在体外可直接激活酪氨酸酶活性;对小鼠
B—16黑素瘤细胞作用 24 h后 ,未见细胞酪氨酸酶
活性有明显影响 ,作用 48 h后 ,可见酪氨酸酶活性明
显升高 ,而且随着剂量增加 ,酪氨酸酶活性有所增加 ,
呈现一定剂量效应关系 ,但当浓度升高到 0.3 g/L
时 ,则出现细胞毒性作用 ,表现为细胞萎缩甚至死亡。
作用 72 h后可见酪氨酸酶活性反而出现下降 。说明
酪氨酸酶活性有时间进程的变化;驱虫斑鸠菊对整体
动物的酪氨酸酶活性也有明显促进合成作用 ,且呈现
一定剂量效应关系。国内学者报道一种常用于治疗
白癜风的药物 ———光敏素 8-MOP 可在体外诱导黑
素合成 ,在体外培养的细胞水平呈剂量依赖方式提高
B-16鼠黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性和黑素含量 ,直
接诱导黑素细胞的黑素合成。此结果与本文报道结
果一致。徐建国等研究发现驱虫斑鸠菊可在体外激
活酪氨酸酶活性[ 1] ,龙子江等发现消白灵片可使白
癜风动物模型血液中酪氨酸酶含量增高 。此外还发
现很多中药对白癜风有很好治疗效果 ,同时也发现其
中某些中药在体外可直接激活酪氨酸酶的活性 ,以及
对体外培养的细胞具有促进其酪氨酸酶活性作用。
上述结果与本文报道的结果非常相似 ,显示驱虫斑鸠
菊治疗白癜风除影响到机体免疫系统以外 ,还能影响
到酪氨酸酶的活性 ,进而促进黑色素的合成 。
黑素是吲哚和醌与蛋白质结合的高分子聚合物。
黑素的合成必须有三种基本物质:①酪氨酸为制造黑
素的主要原料 ,是蛋白质代谢的产物 ,为一种稳定的
氨基酸。 ②酪氨酸酶是酪氨酸转变为黑素的催化剂 ,
·33·氨基酸和生物资源
为铜及蛋白质的复合物 ,是在黑素细胞的粗面内质网
中合成 ,后转移到高尔基空泡中 ,在此参与合成黑素。
人类所有细胞中只有黑素细胞能合成酪氨酸酶。 ③
酪氨酸在酪氨酸酶的作用下产生黑素 ,此种作用为一
氧化过程 ,必须与氧结合才能转变为黑素。很显然 ,
酪氨酸酶在黑素合成过程中起到非常关键的限速酶
作用。那么 ,驱虫斑鸠菊是促进了酪氨酸酶的合成 ,
还是激活已有酪氨酸酶活性呢? 抑或是影响到黑素
合成的其他关键步骤呢? 其促进黑素合成与免疫抑
制之间有何联系 ?其详细机制还有待进一步研究 。
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and Melanogenesis of B-16 Murine Melanoma Cell
DENG Rui-chun , ZHOU Yong , ZHANG Jin-gang
XU Jian-guo ,SHANG Jing , YU Lu-hai ,Wang Dong-ping
(Institute of Combination of Chinese Traditional and Western Medicine ,
Beijing clniversity of Traditional Chinese Medicine , Beijing 100029)
Abstract:To study ef fect of Vernonia anthelmint ica on ty rosinase activi ty and melanogenesis of B -16
murine melanoma cell , zymological method w as used to measure ty rosinase activity , MT T was used to study pro-
liferation of the cell , and melanin was detected by its absorpt ion at 470 nm.Vernonia anthelm intica can signif i-
cantly enhance the activity of tyrosinase in vit ro and proliferation of B-16 murine melanoma cell.
Key words:Vernonia anthelm intica;ty rosinase;murine melanoma cell
·34· 邓瑞春 ,周勇 ,章金刚 ,等.驱虫斑鸠菊对 B-16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性及黑素生成影响