全 文 ：[ 文章编号] 1001-3601(2009)07-0423-0016-03
云南独蒜兰原球茎诱导与增殖的研究
黄永会1 , 2 , 朱国胜1 , 2 , 毛堂芬1 ,2 , 刘作易2 , 3＊ , 杨友联2 , 4
(1.贵州省生物技术研究所 , 贵州 贵阳 550006;2.贵州省农业生物技术重点实验室 , 贵州 贵阳 550006;3.贵州省
农业科学院 , 贵州 贵阳 550006;4.六盘水师范高等专科学校 生物与地理科学系 , 贵州 水城 553004)
　　[ 摘　要] 为组织培养快速繁殖云南独蒜兰 ,对其进行了种子无菌萌发的基本培养基 、添加物与激素以及原球茎增殖激素
配比的优化筛选。结果表明:在 KC 、1/2MS 、B5这 3种基本培养基中 , B5较适于种子萌发;添加蛋白胨 5g/ L、马铃薯泥 50 g/ L或活性炭粉 1 g/ L 均有利于种子萌发形成原球茎;生长激素 NAA 、2 , 4-D 对种子无菌萌发具有促进作用 , 而细胞分裂素 6-BA
则抑制了种子萌发。在以 B5附加 AC (活性炭)1 g/ L 的基础培养基中 , 激素组合 6-BA 1.5mg/ L+ NAA 0.5 mg/ L 更有利于原球茎的增殖与生长。
[ 关键词] 兰科;组织培养;云南独蒜兰;原球茎[ 中图分类号] S682.31 [ 文献标识码] A
Study on Protocorm-like Body Induction and Multiplication of
Pleione yunnanensis
HUANG Yong-hui1 , 2 , ZHU Guo-sheng1 , 2 , MAO Tang-fen1 , 2 , LIU Zuo-yi2 , 3＊ , YANG You-lian2 , 4
(1.Guizhou Institute of Biotechnology , Gui yang , Guizhou 550006;2.The Key Laboratory for Agricultural Bio-
technolog y of Guizhou , Guiyang , Guizhou 550006;3.Guizhou Academy o f Agricultural sciences , Guiyang ,
Guizhou 550006;4.Department of Biology and Geogra phy , Liupanshui Teachers College , Shuicheng , Guizhou
553004 , China)
　　Abstract:Optimial screening o f ba sic media , additives and plant ho rmones fo r a septic seeding and combina tions for
proto co rm-like body multiplication w as studied.The aseptic seeding of Pleione yunnanensis showed that among KC , B5 and 1/
2 MS , B5was the optimum basic medium fo r ge rmination.Supplement o f pro tein peptone 5 g/ L , po ta to 50 g/ L or AC (active
ca rbon) 1 g/ L w as advantag eous to seed germination and PLB induction.NAA and 2 , 4-D showed po sitiv e effects on
germination , w hile 6-BA might play a suppressiv e ro le.On the medium o f B5 supplemented with AC , 6-BA 1.5 mg/ L+NAA
0.5 mg/ L was the be st combination for PLB multiplication and its g row th.
Key words:Orchidaceae;tissue cultur e;P leione yunnanensis;pro tocorm-like body(PLB)
　　云南独蒜兰〔Pleione yunnanensis (Rolfe)
Rolfe〕,兰科独蒜兰属的一种半附生兰 ,国内主要产
于四川 、贵州和云南。云南独蒜兰生于林下或林缘
多石地上或苔藓覆盖的岩石上 ,也见于草坡稍荫蔽
的砾石地上 ,海拔分布为 1 100 ～ 3 500m[ 1] 。云南独
蒜兰是生药山慈菇的基原植物之一 ,以假鳞茎入药 ,
具有清热解毒 ,化痰散结的功能 ,用于痈肿疔毒 、瘰
疬痰核 、淋巴结结核和蛇虫咬伤[ 2] 。云南独蒜兰花
大 、艳丽 ,具有很高的观赏价值。云南独蒜兰种子细
小 ,不具有胚乳 ,由于营养不足 ,野外萌发比较困难。
近年来 ,野生资源破坏严重 ,组织培养是获得大量完
整再生植株 ,缓解资源环境压力的主要途径 。国内
外对于云南独蒜兰组织培养的报道研究极少 ,对原
球茎的增殖或组培快繁至今未见报道 。对此 ,笔者
　[收稿日期] 　2009-03-30;2009-06-22修回
　[基金项目] 　贵州省农业科学院重点项目[ 黔农科合(重点)04014] ;贵州省自然科学基金项目[ 黔科合 J(2005)2020]
　[作者简介] 　黄永会(1981-),女 ,研究实习员 ,从事植物基因工程与组织培养研究。
　＊通讯作者。 E-mai l:liuzu oyi@yahoo.com.cn
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(特约编辑:石帮志)
　贵州农业科学　2009 , 37(7):16 ～ 18　Guizhou Ag ricultural Science s
对云南独蒜兰种子无菌萌发形成原球茎与原球茎的
增殖进行了研究 ,为组培快繁获得再生植株打下基
础。
1 材料与方法
1.1 外植体
云南独蒜兰成熟未开裂蒴果采自贵州省雷山
县。
1.2 方法
1.2.1 材料消毒 云南独蒜兰蒴果采回后用 75%
酒精擦拭消毒 ,再放入 4℃冰箱中的干燥器中暂存
备用 。无菌播种前将蒴果从冰箱中取出 , 先经过
75%的酒精表面消毒处理 20 s ,再用 0.1%的升汞
(HgCl2)消毒 12min左右 ,然后用无菌水冲洗 5次 ,
最后用无菌滤纸吸干果皮表面水分 。
1.2.2 原球茎诱导 无菌条件下用灼烧消毒后的
解剖刀将消毒处理的蒴果两端切除 ,纵向剖开蒴果 ,
将种子撒播于培养基上 ,轻轻晃动培养瓶使种子均
匀散布 ,每瓶约撒播 500粒种子。
1)基本培养基筛选:KC 、1/2MS 与B 5 。2)添加
物筛选:以B 5为基本培养基 ,附加不同种类的添加物。
蛋白胨 、活性炭直接称取后加入培养基中 ,苔藓 、马铃
薯、阔叶林腐殖土称取后加水煮30min再过滤 ,将滤液
加入培养基中。3)激素筛选:以 B 5为基本培养基 ,附
加NAA 0mg/L 、0.5mg/L ,2 ,4-D 0mg/ L、2.0mg/ L和
6-BA 0mg/L 、0.25mg/ L的不同组合。
试验共 13个处理 ,每个处理 3次重复。培养基
中均添加琼脂粉 8 g/ L 、白糖 30 g/L , pH 5.8 ～ 5.9。
播种 1个月后 ,无菌条件下从培养瓶中 5个不同位
置取出小块培养基 ,切成 1 cm2的小块 ,于显微镜下
观察计数 ,求得种子萌发率 ,每个处理的萌发率即为
处理中 15块培养基萌发率的平均值。
1.2.3 原球茎增殖 种子萌发 1个月后 ,选择大小
均匀的原球茎转接于原球茎增殖培养基中 ,每瓶转接
5粒原球茎。增殖培养基以 B 5附加 AC 1 g/L 为基
础 ,添加 NAA 0mg/ L、0.2mg/L 和0.5mg/L 与 6-BA
0.5mg/ L 、1.0mg/L 和 1.5mg/L ,共 9 个处理 ,每个
处理 10次重复。培养基中均添加琼脂粉 8g/L 、白糖
30g/L ,pH 5.8 ～ 5.9。原球茎培养 1个月后 ,肉眼观
察计数 ,计算其增殖率与死亡率 。
1.2.4 培养条件 种子播种后置于散射光条件下
培养 ,萌发后置于光照强度 2 000lx 的日光灯下培
养 ,光照时间为 12 h/d , 萌发前后的培养温度均为
25℃左右。
2 结果与分析
2.1 原球茎的诱导
种子无菌条件下播于培养基后约 3 周开始萌
发 ,形成布满绒毛的黄绿色小原球茎 。原球茎逐渐
长大 ,颜色转绿 ,绒毛增多 ,极少数在播种 40 d后开
始分化出牙尖 ,其余原球茎随着时间推移不断分化 ,
2个月后几乎所有原球茎都能长出第 1片叶 ,少数
能长出第 2片叶。云南独蒜兰无菌播种 1个月后统
计各培养基中种子萌发率 ,以黄绿色小原球茎出现
为准。在 KC 、1/2M S 和 B 5基本培养基筛选试验
中 ,只有 B5培养基中种子萌发率较高 ,萌发率比前
二者高 30%,KC 与 1/2M S 培养基中萌发率分别为
12.3%和 9.5%。对几种不同培养基添加物而言 ,
蛋白胨 5 g/ L 和马铃薯汁(原薯 50g/L)的添加均可
使种子萌发率得到较大提高 ,达到 60%以上 ,活性
炭 1 g/L 的添加同样能起到促进萌发的作用 ,萌发
率提高 10%左右(表 1)。次年将新鲜采集的种子播
于 B5 +1 g/LAC 培养基上 , 1个月萌发率达到 80%
以上 ,45d后萌发率可达到 98%(图 1)。添加苔藓
100g/L 或阔叶林腐殖土 100 g/L 的培养基中种子
萌发率极低 ,都在 10%以下。
表 1 基本培养基与添加物对种子萌发率的影响
Tab le 1 Effect of dif f erent m edia o r addi tives on germinat ion rate of Pleione y unnanensis
培养基 Media 基本培养基 Basic Media
KC B5 1/2 MS
培养基添加物/(g/ L)Additive s
蛋白胨5 苔藓 100 活性炭 1 马铃薯 50 阔叶林腐殖土 100
萌发率/ %Germination rat e 12.3 45.2 9.5 67.7 8.6 54.4 70.7 6.7
图 1 种子在 B5 +AC 1 g/ L 培养基中萌发
Fig.1 Seed germination in B5+AC 1g/ L medium
　　不同植物生长激素配比对种子的萌发也有影响 ,
以 B5为基本培养基 ,单独添加激素 2 ,4-D 2.0mg/ L
有利于云南独蒜兰种子的萌发 ,萌发率高于其他任
意激素配比(表 2)和对照(表 1中 B5处理)。其次是
单独添加 NAA 0.5mg/ L 处理 , 萌发率达到
56.0%,明显高于对照。单独添加 6-BA 0.25mg/L
时 ,萌发率低于对照 。NAA 0.5mg/ L +6-BA
0.25mg/ L和2 , 4-D2.0mg/ L +6-BA0.25mg/ L处
表 2 不同激素配比对种子萌发率的影响
　　T able 2 Effect of dif f erent plant-grow th h orm ones on
germin at ion rate
激素组合/(mg/ L)Plant-growt h ho rmones
N AA 6-BA 2 ,4-D
萌发率/ %
Germination rat e
0.5 0 0 56.0
0.5 0.25 0 20.8
0 0 2.0 71.1
0 0.25 2.0 51.6
0 0.25 0 32.0
·17·　第 7 期 黄永会 等　云南独蒜兰原球茎诱导与增殖的研究
表 3 植物生长激素对原球茎发生与增殖的影响
　　Table 3 Effect of diff eren t plant-grow th h ormones on P LB
mult iplication
编号 激素组合
NAA 6-BA
原球茎增殖率/ %
PLB multiplication rate
死亡率/%
Death rate
增殖情况 PLB
Multiplication station
1 0 0.5 67.6 18.1 ++
2 0 1.0 43.0 32.0 ++
3 0 1.5 64.8 19.0 +++
4 0.2 0.5 51.0 9.0 +++
5 0.2 1.0 37.1 19.0 ++
6 0.2 1.5 42.0 4.0 ++
7 0.5 0.5 43.0 13.0 ++
8 0.5 1.0 37.3 26.7 +
9 0.5 1.5 58.1 5.7 +++
　　注:+增殖情况差 , + +增殖情况一般 , + + +增殖情况好。
Note:+ Multiplicating bad , + + Multiplicating moderately , + + + M ultiplicating
w ell.
理的萌发率为 20.8%和 51.6%,分别低于 NAA 0.
5mg/ L 与 2 ,4-D 2.0mg/L 单独处理。
2.2 原球茎增殖
原球茎转接培养 1个月后统计原球茎增殖率与
死亡率 ,3个月后观察记录原球茎的增殖生长情况。
　　从表 3看出 ,各处理中原球茎增殖率(以下简称
增殖率)1号和 3号处理最高 , 2号 、5号和 8号处理
诱导的原球茎较少 ,增殖率低。说明 ,单独附加 6-
BA 0.5mg/L 或 6-BA 1.5mg/L 有利于原球茎增
殖 ,在 0.5 ～ 1.5mg/ L 范围内 , 6-BA 浓度并不是越
高越好 ,这个结果类似王国梅等[ 3] 对金钗石斛原球
茎增殖倍数的研究。9号与 4号处理增殖率仅次于
1号与 3号 ,说明 6-BA 与 NAA 的浓度比为 2.5 ～
3.0有利于原球茎增殖 。4号 、6号和 9 号培养基中
原球茎的死亡率较低 ,2 号和 8号培养基中原球茎
的死亡率较高。经过 2 个月的生长后 ,原球茎不断
增殖形成团状 ,由黄绿色转变为深绿色 ,逐渐露出芽
嘴(图 2)。3个月后观察原球茎增殖生长情况 ,发现
在 3号 、4号和 9号培养基中原球茎增殖最多 ,有的
开始分化形成丛生芽 ,芽苗健壮 ,颜色鲜绿。1号 、2
号 、5号和 7号培养基中有少数原球茎增殖 ,同样有
的分化形成丛生芽 ,但原球茎褐化较严重。8 号培
养基中也有少数原球茎增殖与丛生芽形成 ,但多数
原球茎褐变死亡 ,只有少数存活增殖 ,生长较差 ,团
块小。综合原球茎增殖率 、死亡率与增殖情况 3 个
因素考虑 , 9 号激素配比 6-BA 1.5mg/ L +NAA
0.5mg/L最适合云南独蒜兰原球茎增殖诱导 ,增殖
率高 ,死亡率低而且增殖后丛生苗长势好。
图 2 原球茎增殖
Fig.2 Mul tip lication of PLB
3 小结与讨论
1)组织培养中常用的有机添加物如椰子汁 、香
蕉和马铃薯等是一类含有氨基酸 、激素和酶等有机
成分较为复杂的天然复合物[ 4] 。本试验中添加蛋白
胨与马铃薯都能提高种子的萌发率也是因为其能为
外植体提供丰富的营养 ,但试验还发现 ,活性炭同样
能起到提高种子萌发率的作用 ,这可能是因为活性
炭能为种子的萌发提供暗环境 ,从而为光敏性生长
素的积累提供合适的条件[ 5] ,或者是与活性炭能吸
附植物生长过程中的一些有害次生代谢物质有关。
从工厂化生产组培苗的角度而言 ,用活性炭取代天
然有机添加物 ,能够减少成本 ,并且使用方便。阔叶
林腐殖土与苔藓是兰科植物生长的有益基质 ,添加
于组织培养基中的研究还未见报道 。本试验发现 ,
这 2种基质不能为云南独蒜兰的萌发生长提供额外
营养。
2)兰科植物种子无菌萌发时 ,常辅以 NAA 、2 ,
4-D等生长素 。本试验中 ,单独添加 NAA或 2 , 4-D
处理 ,种子萌发率均较高 , 尤其是 2 , 4-D 2.0mg/L
能使萌发率提高 20%以上。6-BA 0.25mg/ L 不论
是单独添加还是与其他激素组合均能抑制种子的萌
发 ,单独添加时种子萌发率很低 ,与其他激素组合
时 ,则削弱了其他激素的促进萌发作用。因此 ,即使
是低浓度的 6-BA 也会抑制云南独蒜兰种子的萌
发 。
3)6-BA 0.5 ～ 2.0mg/ L 常单独或配合低浓度
的 NAA 用于兰科植物原球茎的增殖培养[ 6-8] 。6-
BA是增殖培养中常用的细胞分裂素 ,它可以增加
愈伤组织的致密度和分生细胞的数目 ,且有利于愈
伤组织的诱导和再生能力的保持 。黄成林等[ 9] 对独
蒜兰的组织培养研究发现 , 6-BA 2mg/L 最适合外
植体为种子萌发的芽的增殖 ,当 6-BA浓度为 4mg/
L 时 ,则抑制了外植体的芽的增殖与生长。本试验
研究发现 ,6-BA 与 NAA 的浓度比为 2.5 ～ 3.0时
有利于云南独蒜兰原球茎的增殖 ,能够取得较好的
增殖生长效果 ,对云南独蒜兰组培苗工厂化繁殖生
产积累了技术经验 。
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(责任编辑:杨　林)
·18· 　　　　　　　　　　　　 　　　　　贵 州 农 业 科 学 2009 , 37 卷