全 文 ：上海交通大学学报(医学版)，2016，36(5) http:/ /www． xuebao． shsmu． edu． cn
上海交通大学学报(医学版)
JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE) Vol． 36 No． 5 May 2016
［基金项目］上海市卫生局科研计划课题资助项目(20124y007);国家自然科学基金(81573401)(Shanghai Municipal Health Bureau Foundation，
20124y007;National Natural Science Foundation of China，81573401)。
［作者简介］张 瑞(1981—)，女，实验师，博士;电子信箱:rzhang0621@ 163． com。
［通信作者］胡雅儿，电子信箱: yaerhu@ shsmu． edu． cn;张永芳，电子信箱: zhangyongfang1@ yahoo． com。
论 著

基础研究
ERK /CREB信号通路在异菝葜皂苷元促进 Aβ损伤
SH-SY5Y细胞 BDNF表达中的作用
张 瑞1，2， 夏志明1， 孙小余1， 李加梅1， 张永芳1，2， 胡雅儿1，2
上海交通大学 医学院 1．细胞调控研究室，2．转化医学协同创新中心，上海 200025
［摘要］ 目的 探讨细胞外信号调节激酶 /cAMP 反应元件结合蛋白(ERK/CREB)信号通路在异菝葜皂苷元
(SMI)促进 β-淀粉样肽(Aβ)损伤 SH-SY5Y 细胞脑源性神经营养因子(BDNF)表达中的作用及其机制。
方法 建立 Aβ损伤 SH-SY5Y细胞模型，采用 RT-PCR法检测 BDNF mRNA的表达，用Western blotting的方法
检测 pCREB和 pERK的变化，最后通过阻断实验确认 ERK/CREB信号通路在 SMI促进 BDNF mRNA表达中
的作用。结果 SMI 能促进 Aβ 损伤 SH-SY5Y 细胞 BDNF mRNA 的表达(P = 0. 000)，并能上调信号分子
CREB和 ERK1 /2 的磷酸化水平(P = 0. 001，P = 0. 000)。用 RNA干扰的方法阻断 CREB的表达后，SMI促进
BDNF mRNA表达的作用完全消失;用 U0126 阻断 ERK1 /2 磷酸化后，SMI促进 pCREB水平升高的作用完全
消失。结论 SMI通过 ERK/CREB通路促进 Aβ损伤 SH-SY5Y细胞 BDNF mRNA的表达。
［关键词］异菝葜皂苷元;阿尔茨海默症;脑源性神经营养因子;cAMP 反应元件结合蛋白;细胞外信号调节
激酶 1 /2
［DOI］ 10． 3969 / j． issn． 1674-8115． 2016． 05． 006 ［中图分类号］ R285． 5;R966 ［文献标志码］ A
Role of ERK /CREB signal pathway in promotion of BDNF expression in Aβ
intoxicated SH-SY5Y cells by smilagenin
ZHANG Rui1， 2， XIA Zhi-ming1， SUN Xiao-yu1， Li Jia-mei1， ZHANG Yong-fang1， 2， HU Ya-er1， 2
1． Research Laboratory of Cell Regulation， 2． Collaborative Innovation Center for Translational Medicine， Shanghai Jiao Tong University
School of Medicine， Shanghai 200025， China
［Abstract］ Objective T o investigate the role of extracellular signal regulated kinase /cAMP response element
binding protein ( ERK /CREB) signaling pathway in promotion of brain derived neurotrophic factor ( BDNF)
expression in β-amyloid ( Aβ) intoxicated SH-SY5Y cells by smilagenin ( SM I ) and relevant mechanisms．
Methods T he Aβ intoxicated cell model was built and RT -PCR assay was employed to detect the BDNF mRNA
expression． W estern blotting was used to detect changes in pCREB and pERK expressions． Finally， the role of
ERK /CREB signaling pathway in the promotion of BDNF mRNA expression by SM I was confirmed by the use
of blocking assay． Results SM I promoted the BDNF mRNA expression in Aβ intoxicated SH-SY5Y cells
( P = 0. 000) and up-regulated the phosphorylation level of signal molecules CREB and ERK1 /2 ( P = 0. 001，
P = 0. 000) ． After blocking the CREB expression by RNA interference， the effect of SM I on promoting the
BDNF mRNA expression completely vanished． After blocking the ERK1 /2 phosphorylation with U0126， the
effect of SM I on promoting the increase in pCREB level completely vanished． Conclusion SM I promotes the
BDNF mRNA expression in Aβ intoxicated SH-SY5Y cells through the ERK /CREB pathway．
［Key words］ smilagenin; Alzheimers disease; brain-derived neurotrophic factor; cAMP response element bind-
ing protein; extracellular signal-regulated kinase
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张 瑞，等． ERK /CREB信号通路在异菝葜皂苷元促进 Aβ损伤 SH-SY5Y细胞 BDNF表达中的作用
阿尔茨海默症(Alzheimers disease，AD)是一种
以记忆减退以及认知功能障碍为主要临床特征的神
经退行性疾病。AD 患者脑部主要的病理学特征是
β-淀粉样肽(β-amyloid，Aβ)沉积形成的老年斑，Tau
蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结以及海马、
皮层等区域大量神经元的退变和丢失［1 － 2］。脑源
性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，
BDNF)是神经营养因子家族的一员，在神经元的生
长、分化中发挥重要功能，BDNF 合成的减少可能导
致了细胞稳态的破坏，与 AD 的发生密切相关［3 － 4］。
因此，促进 BDNF 的表达有助于维持胆碱能神经元
功能，促进受损神经细胞恢复，对 AD 的治疗有重要
意义。
异菝葜皂苷元(smilagenin，SMI)是滋阴中药知
母中的活性成分，以往的研究表明知母中的皂苷元
能改善拟 AD 动物模型的学习记忆能力［5 － 6］。进一
步机制研究发现，SMI能上调 Aβ 损伤胆碱能神经元
的 BDNF表达，且通过 BDNF 发挥神经保护功能;在
分化的 SH-SY5Y 细胞上，SMI 能升高因 Aβ 损伤而
降低的 BDNF 蛋白和 mRNA的表达，显著上调 BDNF
基因的转录速率［7］，但其具体作用机制还不甚明确。
cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element
binding protein，CREB)是一种在大脑中广泛表达的核
转录因子，在 BDNF 转录调节中发挥重要功能［8］。
CREB蛋白的生物学活性受其磷酸化状态的调控，只
有磷酸化的 CREB 才能激活下游基因的表达［9］。胞
外信号通过第二信使的介导激活多种蛋白激酶，这
些蛋白激酶催化 CREB第 133 位丝氨酸的磷酸化，磷
酸化后的 CREB 活性增强，进而与 BDNF 启动子结
合，促进转录。有文献报道，蛋白激酶 ERK 激活使
CREB发生迟发而长久的磷酸化，这种持久的 CREB
磷酸化能够有效地提高基因转录［10］。本实验通过对
ERK /CREB的活化状况检测及机制分析，旨在探讨
ERK /CREB信号通路在 SMI促进 BDNF表达中的作用
及其可能的机制，为 SMI的新药开发奠定理论基础。
1 材料与方法
1．1 材料
SMI(Phytopharm公司，英国)，Aβ25 － 35、多聚赖氨
酸、全反式维甲酸和 U0126(Sigma 公司，美国)，
DMEM/F12 培养基、胎牛血清和 B27(Gibco 公司，美
国)，Lipofactamine 2000 和 TRIzol试剂(Invitrogen 公
司，美国)，SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒
(Roche公司，瑞士)，RNA 反转录试剂盒(Thermo 公
司，美国)，引物合成(由上海生工生物工程公司)，小
干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)合成(上海
吉玛制药技术有限公司)，SDS 裂解液(上海碧云天
生物技术有限公司)，磷酸化 CREB(pCREB)抗体
(Chemicon公司，美国)，磷酸化 ERK1 /2(pERK1 /2)
和 ERK1 /2 抗体(Cell signaling公司，美国)，CREB和
β-actin抗体(Santa Cruz公司，美国)。
1．2 方法
1．2．1 细胞培养 SH-SY5Y 细胞用含 10%胎牛血
清和 1 × 105 U /L 青霉素和 100 mg /L 链霉素的
DMEM/F12 培养基在 37 ℃和 5% CO2条件下培养。
将细胞接种于多聚赖氨酸溶液包被的 6 孔板或 24 孔
板，24 h 后换为含 0. 5% B27、1 × 105 U /L 青霉素、
100 mg /L 链霉素和 10 μmol /L 全反式维甲酸的
DMEM/F12 培养基以诱导分化，隔天半量换液。细
胞处理条件参考文献［7］，细胞分化培养 7d 后加入
SMI(10 μmol /L)，预保护 24 h，加入 10 μmol /L
Aβ25 － 35继续作用 48 h后进行各项实验。
1．2．2 实时荧光定量 RT-PCR 法测定 BDNF mRNA
表达水平 采用 Trizol 法抽提细胞总 RNA，将 3 μg
RNA 反转录成 cDNA 后用实时定量 PCR 仪进行
BDNF mRNA 含量的测定。BDNF 引物序列:5-
AGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAG-3 (上游)，5-
ATTGCTTCAGTTGGCCTTTTGATAC-3(下游)。GAPDH
引物序列:5-GACCCCTTCATTGACCTCAACTACA-3 (上
游)，5-TCTCGCTCCTGGAAG ATGGTGATG-3 (下游)。
用反应的 Ct 值进行 BDNF 表达的数据分析，以
GAPDH为内参，采用 2 － ΔΔCt计算法进行目的基因各组
间相对定量分析。
1．2．3 Western blotting 法测定磷酸化 CREB 和磷酸
化 ERK1 /2 蛋白水平 取 6 孔板内培养的细胞，加入
SDS裂解液提取细胞总蛋白，采用 Bradford 法进行蛋
白定量。40μg蛋白经 5%的浓缩胶和 10%分离胶电
泳分离后转移到 PVDF 膜上，在含 5%脱脂奶粉的
TBST封闭液中室温封闭 2 h 后，加入一抗于 4 ℃孵
育过夜，CREB 抗体的稀释浓度为 1 ∶ 200，pCREB、
ERK 1 /2、pERK1 /2 和 β-actin 抗体稀释浓度均为
1∶ 1 000。经 PBST 漂洗后加入相应的二抗，室温孵
育 2 h，二抗稀释浓度均为 1∶ 5 000。最后经 ECL 显
色后，进行显影分析。
1．2．4 RNA 干扰实验 将 SH-SY5Y 细胞接种于 24
孔板，分化培养 7d 后进行转染实验，CREB RNAi 片
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段的设计参照文献［11 － 12］。CREB siRNA:5-UACA
GCUGGCUAACAAUGG-3。非特异 siRNA:5-UUCU
CCGAACGUGUCACGU-3。转染时非特异 siRNA 或
CREB特异性 siRNA 的终浓度均为 80 nmol /L，转染
过程按照 Lipofectamine2000 的说明书进行，转染 5 h
后更换成普通培养液，同时加入 SMI，培养 24 h 后加
入 Aβ 损伤，继续培养 48 h 后收集细胞，用 western
blotting的方法进行转染效果的鉴定，以及用定量
PCR的方法测定 BDNF mRNA的表达。
1．2．5 U0126 对 SMI 促进 CREB 磷酸化作用影响的
检测 SH-SY5Y 细胞分化培养 7d 后加入 SMI，在
SMI作用前 30 min 加入 ERK1 /2 通路抑制剂 U0126
(10 μmol /L)［13］，24 h 后加入 10 μmol /L 的 Aβ，Aβ
损伤 48 h 后收集细胞样品，用 Western blotting 的方
法测定 pCREB的蛋白表达情况。
1．3 统计学方法
采用 SPSS 20． 0 软件进行统计学处理。实验数
据以 珋x ± s表示，2 组数据比较采用配对 t 检验，多组
数据间比较用单因素方差分析(one way ANOVA)。
P ＜ 0. 05 表示差异有统计学意义。
2 结 果
2．1 SMI对 Aβ损伤 SH-SY5Y细胞 BDNF mRNA
表达的影响
定量 PCR的结果显示，与正常对照组(等量溶媒
处理)相比，Aβ损伤 48 h 后 BDNF mRNA 的表达显
著降低(P = 0. 000)，而 SMI 预保护能显著上调降低
的 BDNF mRNA含量(P = 0. 000)(图 1)。结果同时
显示 SMI 仅上调 Aβ 损伤细胞的 BDNF mRNA表达，
对正常细胞的 BDNF mRNA表达无影响(P =0. 934)。
注:1．正常对照组;2． SMI 组;3． Aβ 损伤组;4． Aβ + SMI 组。① P =
0. 000 与 Aβ损伤组比较。
图 1 SMI对 Aβ损伤 SH-SY5Y细胞 BDNF mRNA表达的影响
Fig 1 Effects of SMI on the BDNF mRNA expression in Aβ intoxicated
SH-SY5Y cells
2．2 SMI对 Aβ损伤 SH-SY5Y细胞CREB磷酸化
的影响
Western blotting的结果如图 2 A，用 Quantity One
软件对 western blotting 条带灰度进行统计分析后的
数据如图 2 B 所示。以 β-actin 为内参照，以正常对
照组为 100%，Aβ损伤后，相对于正常对照组 pCREB
的水平显著降低(P = 0. 000)，而 SMI 预保护后，
pCREB的水平较 Aβ 损伤细胞显著升高(P = 0. 001)。
Aβ及 SMI处理后，总 CREB 的表达和正常对照相比
均无显著差异(P = 0. 556，P = 0. 992)。
注:A． Western blotting图片;B． 灰度统计后的蛋白相对表达量。1．
正常对照组;2． Aβ 损伤组;3． Aβ + SMI 组。①P = 0. 000，②P = 0. 001
与 Aβ损伤组比较。
图 2 SMI对 Aβ损伤 SH-SY5Y细胞 CREB磷酸化的影响
Fig 2 Effects of SMI on the phosphorylation of CREB in Aβ treated SH-
SY5Y cells
2．3 SMI对 Aβ损伤 SH-SY5Y细胞 ERK1 /2 磷酸
化的影响
ERK1 /2 是引起 CREB 磷酸化的重要激酶，我们
观察了 SMI对总 ERK1 /2 和其活化形式 pERK1 /2 表
达的影响。Western blotting 的结果如图 3 A，统计结
果如图 3 B所示。Aβ损伤 48 h后，pERK1 /2 水平较
正常对照组显著降低(P = 0. 000)，而 SMI 预保护较
Aβ损伤组能显著升高 pERK1 /2 水平(P = 0. 000);
Aβ和 SMI作用后，总 ERK1 /2 的水平和正常对照相
比均无统计学显著性差异(P = 0. 349，P = 0. 785)。
2．4 阻断 CREB 后，SMI 对 Aβ 损伤 SH-SY5Y 细
胞 BDNF mRNA表达的影响
采用 RNAi的方法阻断 CREB 的表达，以研究转
录因子 CREB 在 SMI 促进 BDNF mRNA 表达中的作
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张 瑞，等． ERK /CREB信号通路在异菝葜皂苷元促进 Aβ损伤 SH-SY5Y细胞 BDNF表达中的作用
用。CREB干扰片段的阻断作用鉴定结果显示，以非
特异的 siRNA为阴性对照，80 nmol /L的 CREB siRNA
能降低 CREB蛋白表达至对照组的(27. 2 ± 4. 7)%，和
阴性对照组相比差异极其显著(P = 0. 001)(图 4 A)。
CREB siRNA抑制了超过 70%的 CREB 蛋白表达，符
合阻断实验的要求。阻断实验结果如图 4 B 所示，
CREB siRNA作用后的正常对照组和 Aβ 损伤组的
BDNF mRNA表达与各自非特异 siRNA 处理组相比
均无显著变化(P = 0. 746，P = 0. 850);但 CREB
siRNA作用后，SMI组的 BDNF mRNA表达降低，与非
特异 siRNA 处理的 SMI 组相比有显著差异(P =
0. 000)，与 Aβ损伤组相比无显著统计学差异(P =
0. 993)(图 4 B)。说明 CREB siRNA完全抑制了 SMI
引起的 BDNF mRNA水平的升高。
注:A．Western blotting图片;B．灰度统计后的蛋白相对表达量。1．正常
对照组;2． Aβ损伤组;3． Aβ + SMI组。①P =0. 000与 Aβ损伤组比较。
图 3 SMI对 Aβ损伤 SH-SY5Y细胞 ERK1 /2 磷酸化的影响
Fig 3 Effects of SMI on the phosphorylation of ERK1 /2 in Aβ treated SH-
SY5Y cells
2．5 阻断 ERK1 /2 磷酸化后，SMI 对 Aβ 损伤 SH-
SY5Y细胞 pCREB的作用
为阐明 pERK1 /2 在 SMI 促进 pCREB 升高中的
作用，我们选用阻断剂 U0126 来抑制 ERK1 /2 的磷
酸化。Western blotting的结果如图 5 A，统计数据如
图 5 B所示。抑制剂 U0126 并不影响正常对照组及
Aβ损伤组 pCREB的表达(P = 1. 000，P = 0. 987)，而
SMI组加入抑制剂后，pCREB 的含量显著降低(P =
0. 003)，阻断后的 SMI 组 pCREB 的量与 Aβ 损伤组
相比无统计学差异(P = 0. 986)，说明 U0126 完全阻
断了 SMI引起的 pCREB水平的升高。
注:A． CREB siRNA对 CREB蛋白表达的作用;B． CREB 在 SMI提高
Aβ 损伤 SH-SY5Y细胞 BDNF mRNA表达中的作用。1． 正常对照组;
2． Aβ损伤组;3． Aβ + SMI 组。① P = 0. 001 与非特异 siRNA 组比较;
②P = 0. 000 与 Aβ损伤组比较;③P = 0. 000 与非特异 siRNA作用下的
Aβ + SMI组比较。
图 4 阻断 CREB后，SMI对 Aβ损伤 SH-SY5Y 细胞 BDNF mRNA
表达的影响
Fig 4 Effects of SMI on the BDNF mRNA expression in Aβ intoxicated
SH-SY5Y cells after blocking the CREB expression
注:A． Western blotting图片;B．灰度统计后的蛋白相对表达量。1． 正
常对照组;2． Aβ损伤组;3． Aβ + SMI组。①P = 0. 002，②P = 0. 003 与
vehicle作用下的 Aβ 损伤组比较;③P = 0. 001 与 U0126 作用下的 Aβ
损伤组比较;④P = 0. 003 与 vehicle作用下的 Aβ + SMI组比较。
图 5 阻断 ERK1 /2 磷酸化后，SMI对 Aβ损伤 SH-SY5Y细胞
pCREB的作用
Fig 5 Effects of SMI on the pCREB level in Aβ intoxicated SH-SY5Y
cells after blocking the ERK1 /2 phosphorylation
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3 讨 论
为研究 SMI 对 BDNF 表达的调控机制，本研究
选用全反式维甲酸诱导分化的人神经母细胞瘤细胞
SH-SY5Y 为研究对象。分化的 SH-SY5Y 细胞具有
神经元样的形态，表达神经元特异性的标志物［14］，是
一种理想的细胞模型，常用于神经细胞损伤研究。
RT-PCR 的结果显示，Aβ 作用后，BDNF mRNA 表
达水平显著下降，这与文献报道的基本一致［15］。在
SH-SY5Y细胞上，SMI 能升高因 Aβ 损伤而降低的
BDNF mRNA表达水平，这与我们以往在皮层神经元
上的结果类似［7］。
CREB与学习记忆功能密切相关，通过对靶基因
表达的调控而发挥功能。有研究表明，在 AD患者和
转基因小鼠中 CREB磷酸化水平降低，缺乏 CREB介
导的转录可能引起神经退行性病变、突触可塑性损
伤等。有结果显示，pCREB 也是 Aβ 降低神经营养
因子基因表达的关键因素［15］。本研究结果显示，在
分化的 SH-SY5Y细胞上，Aβ 作用 48 h 后 pCREB 量
下降，这与文献报道［16］的基本一致。相对于 Aβ 损
伤组，SMI预处理能显著上调 pCREB 的量至正常水
平，提示 pCREB 可能参与了 SMI 促进 BDNF mRNA
转录增强的作用。CREB磷酸化水平的变化与BDNF
mRNA水平的变化一致，也提示我们 CREB磷酸化水
平升高可能是 BDNF转录增强的直接原因。
为了进一步确认 CREB 在 BDNF 转录增强中的
作用，本研究选用 RNAi 技术以特异性阻断 CREB。
阻断实验结果显示，阻断 CREB作用后，SMI促进 Aβ
损伤 SH-SY5Y细胞 BDNF mRNA表达的作用完全消
失。说明 CREB 是 SMI 上调 BDNF mRNA 表达功能
所必需的，CREB在 SMI调控 BDNF基因表达中发挥
主导作用。
另外，在阻断实验中除了观察 CREB siRNA 对
SMI处理组细胞作用的影响，我们也观察了 RNAi 对
正常以及 Aβ损伤细胞的影响。结果显示，CREB 阻
断后正常对照和 Aβ 损伤细胞 BDNF mRNA 的表达
量均略有降低，但分别和各自非特异干扰片段处理
组相比无统计学差异，说明阻断 CREB 对基础水平
以及 Aβ损伤状态下的 BDNF mRNA 表达并无显著
影响。BDNF的转录调控机制相当复杂，CREB 是调
控 BDNF表达的重要转录因子，但并不是唯一，有多
个其他转录因子如 CaRF、USF1 /2 及 MeCP2 等在
BDNF的转录调控中发挥重要功能［15］。我们的研究
结果也提示在 CREB 被阻断后，有其他转录因子或
其他机制代偿调节正常和 Aβ 损伤细胞 BDNF 的
转录。
另外，CREB磷酸化的动态变化可能也是转录激
活的决定因素。比如，CREB 磷酸化的瞬时增强并不
足以刺激 CREB 依赖的基因转录。有研究表明，
CaMK IV信号通路能产生一种快速但是瞬时的磷酸
化，而 MAPK(ERK)通路则产生一种迟发但持久的
CREB磷酸化［10］。本文我们观察到了 SMI 作用 72 h
后 CREB 水平仍显著升高，说明 SMI 诱发的是一个
长时程的磷酸化作用，也提示了 MAPK(ERK)通路
可能在其中发挥重要的作用。为验证 MAPK 通路在
SMI促进 CREB磷酸化的作用中，本研究选用阻断剂
U0126 来阻断 ERK1 /2 通路;结果显示，阻断 ERK1 /2
通路对正常细胞 CREB 的磷酸化水平无影响，这提
示我们长时间阻断作用(72h)后正常细胞通过其他
激酶或其他机制维持 CREB 的磷酸化［17］。阻断
ERK1 /2 通路后 SMI引起的 pCREB 表达升高作用完
全消失;这提示 ERK1 /2 信号通路在 SMI 促进 CREB
磷酸化中的重要作用，但也不排除其他通路也有可
能参与其中。在进行阻断实验的同时，我们也对
ERK和 pERK 的水平进行了测定;结果显示，Aβ 和
SMI作用对总 ERK 的蛋白水平没有影响，Aβ 作用
48 h 后 pERK 的水平显著降低，而 SMI 预保护能显
著升高 pERK。
综上所述，本研究发现，Aβ 损伤后的 SH-SY5Y
细胞磷酸化 ERK 和 CREB 的水平均显著降低，而
SMI 预保护能恢复受损的 ERK /CREB /BDNF 通路。
本研究结果也提示了对 ERK /CREB /BDNF 信号通路
的调控可能是 AD 治疗药物开发的一个靶点。近期
的文献报道也提示了该信号通路在 Aβ 损伤以及转
基因拟 AD 小鼠治疗分子机制中的重要性［18］。
BDNF能调节突触可塑性，在突触的形成、突触形态
的维持等方面发挥重要作用。长时程的 ERK活化能
引起皮层神经元树突复杂性的增加，该过程与 CREB
介导的信号通路密切相关［19］。我们之前的研究也发
现，SMI能保护 Aβ 损伤皮层神经元，增加神经元轴
突长度，那么 SMI 是否通过 ERK /CREB /BDNF 通路
来发挥其促进神经元突起形成的作用还有待进一步
的实验验证。
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［收稿日期］2015-12-30 ［本文编辑］
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曹智勇
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［收稿日期］2015-12-30 ［本文编辑］瞿麟平
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