全 文 ：上海交通大学学报 医学版 | 2015 年 第 35 卷 第 5 期
［基金项目］国家自然科学基金(81001426) ;上海市教委基金(12YZ038) ;教育部归国学者基金(National Natural Science Foundation of China，
81001426;Shanghai Municipal Education Commission Foundation，12YZ038;Foundation of the Ministry of Education of China for Ｒeturned Scholars)。
［作者简介］江文青(1990—) ，女，硕士生;电子信箱:qwjjwq@ 126． com。
［通信作者］张永芳，电子信箱:zhangyongfang1@ yahoo． com;胡雅儿，电子信箱:yaerhu@ shsmu． edu． cn。
论 著
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基础研究
异菝葜皂苷元对 H2 O2氧化损伤 SH-SY5Y细胞的
保护作用及其分子机制
江文青， 李加梅， 王韫智， 张 瑞， 胡雅儿， 张永芳
上海交通大学 医学院细胞调控研究室，上海 200025
［摘要］ 目的 观察异菝葜皂苷元(SMI)对氧化应激损伤人神经母细胞瘤株(SH-SY5Y)细胞的保护作用，并
初步探讨其分子机制。方法 将 SH-SY5Y细胞用不同浓度(0. 01、0． 1、1 μmol /L)SMI或等体积 DMSO预处理
24 h，然后加入 600 μmol /L 过氧化氢(H2O2)处理。显微镜下观察 SH-SY5Y细胞形态学变化，噻唑蓝(MTT)
法检测细胞存活率，流式细胞仪检测胞内活性氧(ＲOS)水平，Western blotting 检测 p-Akt /Akt 和 HSP70 的表
达，并检测 PI3K抑制剂 LY294002 对 HSP70 表达的影响。结果 SMI 预处理浓度依赖地改善 H2O2 损伤
SH-SY5Y细胞的形态，提高损伤细胞存活率，其中 0. 1、1 μmol /L SMI预处理细胞存活率显著升高(P ＜ 0. 05，
P ＜ 0. 001)。1 μmol /L SMI显著抑制 H2O2 诱导的 ＲOS升高(P ＜ 0. 05)。H2O2 诱导 p-Akt /Akt 和 HSP70 表
达，但 SMI 预处理进一步提高 p-Akt /Akt 和 HSP70 表达水平(P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05) ，且 PI3K 抑制剂能阻断
HSP70 表达的升高(P ＜ 0. 001)。结论 SMI 对 H2O2诱导的氧化应激损伤 SH-SY5Y 细胞具有明显的保护作
用，其作用机制可能与降低胞内 ＲOS水平及高度激活 PI3K /Akt /HSP70 信号通路有关。
［关键词］异菝葜皂苷元;氧化应激;Akt;HSP70;活性氧
［DOI］ 11． 3969 / j． issn． 1674-8115． 2015． 05． 002 ［中图分类号］ Ｒ966 ［文献标志码］ A
Protective effect of smilagenin on H2O2-induced oxidative damage of
SH-SY5Y cells and relevant molecular mechanisms
JIANG Wen-qing， LI Jia-mei， WANG Yun-zhi， ZHANG Ｒui， HU Ya-er， ZHANG Yong-fang
Ｒesearch Laboratory of Cell Ｒegulation， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200025， China
［Abstract］ Objective T o observe the protective effect of smilagenin ( SM I) on oxidative stress damage of
human neuroblastoma cells ( SH-SY5Y ) and preliminarily investigate the possible molecular mechanisms．
Methods SH-SY5Y cells were pretreated with different concentrations ( 0． 01， 0． 1， and 1 μmol /L) of SM I or an
equal volume of DMSO for 24 h and then added H2O 2 of 600 μmol /L． M orphological changes of SH-SY5Y cells
were observed under the inverted microscope． Cell viability was detected by the MTT method． Ｒeactive oxygen
species ( ＲOS) was detected by the flow cytometer． T he expressions of p-Akt /Akt and HSP70 and the effect of
PI3K inhibitor LY294002 on the expression of HSP70 were detected by the W estern blotting． Ｒesults SM I
pretreatment improved the morphology and cell viability of SH-SY5Y cells damaged by H2O 2 in a dose
dependent manner． T he cell viability significantly increased after being treated by SM I of 0． 1 and 1 μmol /L ( P ＜
0. 05， P ＜ 0. 001 ) ． Pretreatment by SM I of 1 μmol /L significantly inhibited the increase of ＲOS induced by
H2O 2 ( P ＜ 0. 05 ) ． H2O 2 induced the expression of p-Akt /Akt and HSP70 and SM I pretreatment further
increased expressions of p-Akt /Akt and HSP70 ( P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05) ． PI3K inhibitor could block the increase of
HSP70 expression ( P ＜ 0. 001 ) ． Conclusion SM I can significantly protect SH-SY5Y cells against H2O 2-
induced oxidative stress damage， which may be relevant to down-regulating the intracellular ＲOS level and
highly activating the PI3K /Akt /HSP70 signaling pathway．
［Key words］ smilagenin; oxidative stress; Akt; HSP70; reactive oxygen species
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JOUＲNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVEＲSITY MEDICAL SCIENCE | Vol． 35 No． 5 May 2015
江文青，等． 异菝葜皂苷元对 H2O2氧化损伤 SH-SY5Y细胞的保护作用及其分子机制
氧化应激主要由过量产生的活性氧(reactive
oxygen species，ＲOS)引起。一直以来，氧化应激都被
认为与神经退行性疾病［如阿尔茨海默病(Alzheimers
disease，AD)、帕金森病(Parkinsons disease，PD)等］
的发生和发展密切相关［1，2］。以往研究表明，氧化应
激可引起蛋白、脂质及 DNA 氧化修饰，继而引发线
粒体功能障碍，导致细胞损伤［3］。此外，中枢神经系
统由于其相对较低水平的细胞抗氧化活性、高代谢
率及高含量多不饱和脂肪酸，对于氧化应激更为敏
感［4］。因此，氧化应激被认为是神经退行性疾病的
主要风险因素，而寻找无毒的抗氧化药物成为治疗
这类疾病的新策略［5］。
异菝葜皂苷元(smilagenin，SMI)是来源于知母
的脂溶性小分子甾体皂苷元(图 1)。前期研究证明
SMI能显著改善老年鼠的记忆缺失［6］，且对于 AD 及
PD模型有显著的保护作用［7 － 9］，但是关于 SMI 是否
具有针对氧化应激损伤的神经保护潜能还未可知。
因此，本研究通过过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)诱
导 SH-SY5Y细胞氧化损伤模型研究 SMI的抗氧化损
伤神经保护作用，并初步探讨其可能的分子机制。
图 1 SMI的化学结构
Fig 1 Chemical structure of SMI
1 材料与方法
1． 1 试剂
SMI(纯度 ＞ 98%)购自英国 Phytopharm Plc 公
司;DMEM培养基和胎牛血清购自英国 Gibco 公司;
MTT和多聚赖氨酸购自美国 Sigma 公司;ＲOS 试剂
盒、ＲIPA裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、超敏
ECL化学发光试剂盒及 LY294002 购自广州碧云天
生物技术研究所;p-Akt(Ser473)、Akt 抗体购自美国
Cell Signaling 公司;HSP70 抗体购自美国 Santa Cruz
公司;β-actin抗体购自北京中杉生物技术有限公司。
1． 2 细胞培养与处理
SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞置于 5% CO2、
37 ℃的培养箱，用含 10%胎牛血清及 2% 青霉素和
链霉素的 DMEM培养基培养。对数期细胞接种于多
聚赖氨酸包被后的多孔板 12 h 后，换含不同终浓度
SMI (0. 01、0． 1、1 μmol /L)或同体积 DMSO 的无血
清 DMEM 培养基孵育 24 h，然后加入终浓度为 600
μmol /L 的 H2O2 处理。PI3K 抑制剂 LY294002(终浓
度 25 μmol /L)在加入 H2O2 前 30 min 加入。细胞存
活率、ＲOS及蛋白表达水平的检测在 H2O2 处理对应
时间后进行。
1． 3 细胞形态观察及细胞活力测定
SH-SY5Y细胞以 8 × 103 个 /mL，100 μL 每孔接
种于 96孔板，H2O2 处理 24 h。相差显微镜(DXM1200，
尼康)下观察细胞生长情况及形态变化。细胞的存
活率用 MTT 法检测，即细胞经对应处理后每孔加入
MTT 至终浓度 0. 5 mg /mL，培养箱中 37 ℃孵育 4 h，
弃去上清，每孔加入 150 μL DMSO，酶标仪振荡溶解
后于 492 nm 波长处测定光密度值［D(492 nm) ］。
1． 4 细胞内 ＲOS水平检测
胞内 ＲOS 水平测定参照试剂盒说明书操作。
SH-SY5Y以 2 × 105 个 /mL、1. 5 mL /孔接种于 6 孔板
中，H2O2 处理 6 h 后，胰酶消化并离心收集细胞，加
入溶有 2. 5 μmol /L DCFH-DA的无血清培养基 37 ℃
避光孵育 30 min，PBS 漂洗 2 次后加入 500 μL PBS
重悬，上流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)检测荧光
值，激发波长 488 nm，发射波长 530 nm。每个样品至少
收集 5 000个细胞，ＲOS水平以平均荧光强度表示。
1． 5 Western blotting检测
细胞接种于 6 孔板，分组处理后，预冷 PBS 洗
1 遍，每孔加入 120 μL ＲIPA裂解液裂解。细胞裂解
物于 4 ℃、12 000 × g 离心 5 min，收集上清，BCA 试
剂盒测定总蛋白浓度。选用 8% ～10% SDS-PAGE进
行电泳，每孔蛋白上样量为 40 μg。电泳结束后湿法
转移蛋白至 PVDF膜(Millipore，美国)上，5%脱脂奶
粉(TBST配)室温封闭 1 h 后，加入一抗(anti-p-Akt、
anti-Akt 及 anti-β-actin，1 ∶ 1 000 稀释;anti-HSP70，
1∶ 600稀释)4 ℃孵育过夜，TBST漂洗 3 次，室温孵育
相应辣根过氧化物酶标记的 IgG(1∶ 5 000 稀释)2 h。
目的蛋白条带用 ECL 通过双色红外成像系统(LI-
COＲ，美国)检测。
1． 6 统计学方法
采用 GraphPad Prism 5 软件进行统计学分析，数
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上海交通大学学报 医学版 | 2015 年 第 35 卷 第 5 期
江文青，等． 异菝葜皂苷元对 H2O2氧化损伤 SH-SY5Y细胞的保护作用及其分子机制
据以 珋x ± s表示。采用 Students t 检验进行两组间比
较，多组比较用 one-way ANOVA结合 Dunnetts检验，
P ＜ 0. 05 表示差异有统计学意义。
2 结 果
2． 1 SMI 对 H2O2 诱导的氧化损伤 SH-SY5Y 细
胞的保护作用
如图 2A所示，与正常细胞相比，H2O2损伤细胞
出现细胞皱缩、空泡变性及数量减少的现象，然而，
SMI预处理浓度梯度依赖地减少了以上现象的发生。
MTT结果与形态学观察结果一致，SMI 预处理剂量
依赖地抑制 H2O2 诱导的细胞损伤，促进细胞存活，
其中 0. 1 和 1 μmol /L SMI预处理细胞存活率显著升
高(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 001) (图 2B)。同时，与正常细
胞相比，SMI (1 μmol /L)单独处理细胞对于细胞形
态及存活率无明显影响。1 μmol /L SMI 保护作用最
明显，因此选用这个浓度进行后续实验。
2． 2 SMI对 H2O2 诱导的 SH-SY5Y细胞内 ＲOS
蓄积的抑制作用
ＲOS检测结果显示:相对于正常细胞，H2O2 组
最大发射光谱右移(图 3A) ，荧光强度明显增加;而
经 SMI预处理后，荧光强度明显降低(P ＜ 0. 05) ，几
乎恢复到正常水平(图 3B)。相对于正常细胞，SMI
单独作用并不影响胞内 ＲOS水平。
注:A． SH-SY5Y细胞经对应处理后的形态学变化［a． 正常细胞;b． H2O2(600 μmol /L)损伤;c． SMI (0. 01 μmol /L)+ H2O2(600 μmol /L) ;
d． SMI (0. 1 μmol /L)+ H2O2(600 μmol /L) ;e． SMI (1 μmol /L)+ H2O2(600 μmol /L) ;f． SMI (1 μmol /L) ］;B． MTT 检测细胞存活率。①P ＜
0. 001 与正常细胞比较;②P ＜ 0. 05，③P ＜ 0. 001 与 H2O2 损伤细胞比较。
图 2 SMI对 H2O2 诱导 SH-SY5Y细胞毒性的作用(n = 5)
Fig 2 Effects of SMI on H2O2-induced cytotoxicity towards SH-SY5Y cells (n = 5)
注:A．流式细胞仪检测胞内 ＲOS水平;B．胞内 ＲOS水平比较。①P ＜ 0. 01 与正常细胞比较;②P ＜ 0. 05 与 H2O2 损伤细胞比较。
图 3 SMI对 H2O2 诱导 SH-SY5Y细胞内 ＲOS累积的影响(n = 5)
Fig 3 Effects of SMI on the intracellular accumulation of ＲOS induced by H2O2 in SH-SY5Y cells (n = 5)
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江文青，等． 异菝葜皂苷元对 H2O2氧化损伤 SH-SY5Y细胞的保护作用及其分子机制
2． 3 SMI对 H2O2 损伤 SH-SY5Y 细胞内的 Akt
磷酸化及 HSP70 表达的促进作用
Western blotting 分析结果显示:SH-SY5Y暴露于
H2O2 后，Akt 磷酸化水平较正常细胞明显提高(P ＜
0. 001) ，而经过 SMI预处理后，Akt信号通路进一步激
活，p-Akt /Akt的比率较 H2O2 损伤细胞显著升高(P ＜
0. 01) (图 4A)。如图 4B所示，与正常细胞相比，H2O2
处理促进细胞内 HSP70 的表达(P ＜ 0. 01) ;但经过
SMI预处理，HSP70表达进一步升高(P ＜0. 05)。
2． 4 LY294002对 SMI预处理H2O2 损伤 SH-SY5Y
细胞中HSP70表达的影响
使用 PI3K 抑制剂 LY294002 阻断 p-Akt 的表
达，观察在本实验条件下，Akt 磷酸化是否参与调控
HSP70 的表达。如图 5 所示，25 μmol /L LY294002
阻断了 p-Akt 的表达 (P ＜ 0. 001) ，且预孵育
LY294002 后，SMI 预处理细胞 HSP70 表达水平下降
64． 61%(P ＜ 0. 001) ，接近正常细胞。此外，单独孵
育 LY294002 并不影响 HSP70 表达。
注:A． Western blotting检测对应处理后 SH-SY5Y细胞内 p-Akt和 Akt的表达;B． SH-SY5Y细胞内 HSP70 表达的比较。①P ＜ 0. 001，③P ＜ 0. 01 与
正常细胞比较;②P ＜ 0. 01，④P ＜ 0. 05 与 H2O2 损伤细胞比较。
图 4 SMI对 H2O2 损伤 SH-SY5Y细胞内 Akt磷酸化和 HSP70 表达水平的影响(n = 3)
Fig 4 Effects of SMI on Akt phosphorylation and HSP70 expression in SH-SY5Y cells impaired by H2O2(n = 3)
注:A． Western blotting检测 LY294002 对 p-Akt和 Akt表达水平的影响;B． SH-SY5Y细胞内 HSP70 表达水平的比较。①P ＜ 0. 001 与正常细胞比
较;②P ＜ 0. 001 与 SMI + H2O2 细胞比较。
图 5 PI3K /Akt 通路参与 SMI上调 H2O2 损伤 SH-SY5Y细胞内的 HSP70 表达(n = 3)
Fig 5 Involvement of PI3K /Akt pathway in the up-regulation of HSP70 expression by SMI in SH-SY5Y cells impaired by H2O2(n = 3)
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3 讨 论
ＲOS介导的氧化应激损伤被认为与各种脑部疾
病的发生和发展有关，如各种神经退行性疾病和老
化等［10］。因此，具有清除胞内过量 ＲOS 或能抑制胞
内过多 ＲOS产生的药物可能是治疗氧化应激损伤相
关脑部疾病的潜力药物。H2O2 是 ＲOS 的一种主要
形式，易于穿过细胞膜并引起细胞氧化应激，被广泛
应用于构建体外模型来研究氧化应激机制和评估新
药物疗法的神经保护潜能［11］。SH-SY5Y 细胞由于
具有类似于神经元的细胞形态、生理及生化功能，经
常用于神经细胞损伤的研究［12］。因此，本研究使用
H2O2 诱导 SH-SY5Y 细胞构建氧化应激损伤细胞模
型。形态学观察及 MTT实验发现 SMI能浓度梯度依
赖地改善损伤细胞形态并提高细胞存活率，初步证
明 SMI具有抗氧化损伤的神经保护潜力。
外源 H2O2 可以进入细胞膜，引起胞内 ＲOS 累
积，同时会刺激胞内其他种类 ＲOS 的产生;过高的
ＲOS水平将引起细胞氧化应激，致使细胞重要组成
成分如蛋白、脂质体等过氧化，细胞功能紊乱，最终
导致细胞损伤甚至死亡［3］。因此，我们对经相应处
理的细胞 ＲOS水平进行检测，发现 H2O2 处理显著提
高胞内 ＲOS水平，而 SMI预孵育可以明显抑制 H2O2
诱导的 ＲOS水平上升，表明 SMI 具有一定的抗氧化
活性。SMI的抗氧化神经保护作用可能与其降低胞
内 ＲOS水平有关。
抗氧化活性药物改变的信号通路也可能是其发
挥神经保护作用的原因［13］，其中 PI3K /Akt信号通路
和 HSP70 蛋白作用较为突出。PI3K /Akt 信号通路
在介导众多类型神经元细胞的生存信号中发挥关键
作用［14，15］，且急性激活 Akt 可以有效抑制有害刺激
诱导的细胞死亡［16］;HSP70 是应激蛋白热休克蛋白
中的一种，它能保护各种病理状态下的细胞或组织
免于损伤［17，18］。由于激活 PI3K /Akt 和 HSP70 能够
有效中和氧化应激的有害影响［19 － 21］，本研究对磷酸
化 Akt及 HSP70 的表达水平进行检测，以进一步研
究 SMI的作用机制。与以往报道一致，当 SH-SY5Y
暴露于 H2O2 时，其磷酸化 Akt (Ser473)和 HSP70 表
达水平迅速提高［22，23］。这可能是细胞应对 H2O2 刺
激的补偿机制，但是还没有强大到足以抵消氧化损
伤［24］。与 H2O2 损伤细胞相比，SMI 预处理能进一步
显著地增强 p-Akt 和 HSP70 的表达，提示 SMI 可能
通过高度激活 Akt 和 HSP70 抑制 H2O2 刺激诱导的
细胞死亡。以往资料表明，一些复合物通过上调
p-Akt或 HSP70 的表达发挥其对抗 H2O2 氧化损伤的
神经保护作用［24，25］。由此，我们推测 p-Akt和 HSP70
的高度激活可能介导了 SMI 的抗氧化损伤神经保护
作用。
有研究表明，H2O2 诱导的 Akt 激活完全由 PI3K
介导［26］，HSP70 的诱导表达与 Akt 激活有关［27］，且
阻断 PI3K /Akt活性，降低 HSP70 表达［28］。因此，我
们使用 PI3K 抑制剂 LY294002 阻断 PI3K /Akt 后检
测 HSP70 的表达，进一步研究 PI3K /Akt信号通路是
否参与调控 HSP70 表达。结果显示，阻断 PI3K /Akt
通路后，诱导表达的 HSP70 几乎完全被抑制。由此
推测，SMI 可能通过诱导 Akt 磷酸化诱导 HSP70
表达。
综上所述，本研究表明 SMI 具有抗氧化损伤神
经保护潜能，且这一神经保护作用可能与 SMI 下调
ＲOS水平及高度激活 PI3K /Akt /HSP70 信号通路有
关。为研究 SMI神经保护作用及可能的机制提供了
新的线索，并进一步证明 SMI 是治疗神经退行性疾
病的潜力药物。
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［收稿日期］2015-01-14 ［本文编辑］吴 洋
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