全 文 :第33卷 第3期
2015年9月
广西师范大学学报:自然科学版
Journal of Guangxi Normal University:Natural Science Edition
Vol.33 No.3
Sept.2015
doi:10.16088/j.issn.1001-6600.2015.03.015
收稿日期:2015-03-18
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81160554)
通信联系人:林鹏程(1966—),男,青海西宁人,青海民族大学教授,博导。E-mail:qhlpc@126.com
藏药多刺绿绒蒿超临界CO2萃取及其成分研究
曾擎屹1,2,3,刘小翠1,2,3,白 雪1,2,3,林鹏程1,2,3,吉守祥1,2
(1.青海民族大学 药学院,青海 西宁810007;2.青海民族大学 青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室,
青海 西宁810007;3.青海民族大学 青海省药物分析重点实验室,青海 西宁810007)
摘 要:本文以多刺绿绒蒿为原料,研究超临界CO2 萃取多刺绿绒蒿的最佳工艺及其萃取物的化学成分。采
用均匀设计方法考察萃取时间、压力、温度等影响因素,得到超临界CO2 萃取多刺绿绒蒿的最佳工艺条件,并
对萃取物结合GC-MS保留指数进行分析。本文得出最佳萃取工艺:萃取时间180min,萃取压力28MPa,萃
取温度45℃。从萃取物中分离出55个可识别峰,结合 Kovats保留指数共鉴定出53个成分,占总成分的
80.58%,其中主要成分为γ-谷甾醇、亚油酸、棕榈酸。
关键词:多刺绿绒蒿;超临界CO2;均匀设计;GC-MS;Kovats保留指数
中图分类号:O415.3 文献标志码:A 文章编号:1001-6600(2015)03-0098-06
多刺绿绒蒿Meconopsis horridula Hook.f.&Thoms.为罂粟科绿绒蒿属植物,藏文名称乌巴拉色
尔布,全体呈黄褐色或淡黄色、坚硬而平展,其花朵大,多显蓝灰色或绿色[1],茎带刺,刺长0.5~1cm,生
长于海拔3 600~5 400m以上的山坡石缝中,主要分布于云南、青海、西藏等地[2]。多刺绿绒蒿作为一种
高原植物,具有独特的药理活性,在藏医经典著作《晶珠本草》有载,其全草或地上部分有清热止痛、接骨、
活血化瘀等功效;同时也可用于治疗骨折、骨蒸、胸背疼痛、跌打损伤、头伤等症[3]。现代药理学证明其具
有抗流感病毒的作用[4]。
CO2 超临界萃取技术作为一种源于20世纪70年代的新型提取分离技术,在天然产物的提取分离中
得到广泛应用[5-6]。与传统方法相比,它具有分离效率好、萃取率高等特点,同时能保持萃取物无毒、无害、
无残留、无污染[7],而且处于超临界状态的CO2 具有扩散能力强、临界温度点低、易操作,以及CO2 减压后
即可气化与萃取物分离等优点,可以有效地将成分按照相对分子质量大小、沸点高低和极性大小依次萃取
出来,比较适用于提取中低极性成分。但是通过超临界CO2 萃取多刺绿绒蒿成分及其萃取工艺的研究却
尚未见过有关报道。
在目前的研究中,多以有机溶剂回流提取多刺绿绒蒿,获得提取物后再对其化学成分及工艺进行研
究[8-12],但这种方法具有工序复杂、消耗时间长、溶剂消耗多等缺点。本试验采用均匀设计的方法优化多
刺绿绒蒿超临界CO2 萃取工艺[13],并对萃取物结合GC-MS保留指数进行分析[14-15]。
1 实验部分
1.1 实验材料、仪器与试剂
多刺绿绒蒿于2014年8月采自青海省循化县达力加山,经青海民族大学药学院林鹏程教授鉴定为藏
药材多刺绿绒蒿。新鲜的多刺绿绒蒿阴干后用粉碎机粉碎,过孔径420μm的筛网。
Speed-SFE超临界萃取仪(美国Applied Separation,Inc公司);CO2 气瓶(北京市华元气体化工有限
第3期 曾擎屹等:藏药多刺绿绒蒿超临界CO2 萃取及其成分研究
公司);KQ-300B低温恒温槽(南京市新辰生物科技有限公司);7890/5975C-GC/MSD气相色谱-质谱联
用仪(美国安捷伦公司);MSD Chemstation D.03.00.611色谱数据处理系统(美国安捷伦公司);NIST
MS search 2.0质谱检索数据库(美国安捷伦公司);粉碎机(永康市红太阳机电有限公司);AL204电子天
平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。
正构烷烃混合对照品(C7~C30)(上海安谱科学仪器有限公司);乙酸乙酯(天津市富宇精细化工有限
公司);甲醇(天津市富宇精细化工有限公司);丙酮(洛阳市昊华化学试剂有限公司)。所用试剂为分析纯。
1.2 超临界CO2 萃取
称取100g样品投入到1L的萃取釜中,加热萃取釜,使之达到预定的温度,按一定流速送入CO2 气
体,并调节萃取釜压力和温度,然后开始循环萃取。各次试验中出样口温度为100℃保持不变,按照均匀
设计安排进行试验,以萃取物的提取率作为评价指标,考察各因素水平对萃取效果的影响,从而得出最佳
条件。
1.3 均匀试验设计
通过预试验,发现影响超临界CO2 萃取物提取率最大的因素分别为萃取压力、萃取温度和萃取时间。
我们选用均匀试验设计表U5(53)进行最佳萃取工艺的筛选。试验设计见表1。
表1 均匀试验设计表
Tab.1 Uniform design
试验号 X1萃取压力/MPa X2萃取温度/℃ X3萃取时间/min
1 20 50 120
2 22 60 90
3 24 45 60
4 26 55 30
5 28 65 180
1.4 多刺绿绒蒿萃取物的GC-MS保留指数分析
1.4.1 样品准备
取0.01g多刺绿绒蒿萃取物加入到装有2mL甲醇的样品瓶中并密封冷冻保存。
1.4.2 色谱条件
进样口温度250℃;色谱柱 HP-5弹性石英毛细管柱(30m×250μm,0.25μm);载气 He气,柱流量
0.8mL/min。用于手动进样的程序升温条件:初始温度60℃,保持1min,再以3℃/min升至150℃,保
持5min,以5℃/min升至260℃,保持10min。进样量5μL。
1.4.3 质谱条件
标准质谱调谐;电离方式EI,电子能量70eV;四级杆温度:150℃;离子源温度:230℃;辅助区温度:
295℃;溶剂延迟时间:3min;数据采集扫描模式:全扫描;质谱扫描质量范围(m/z):50~550。
2 结果与分析
2.1 超临界CO2 萃取结果与数据处理
超临界CO2萃取均匀试验结果见表2。运用SPSS13.0软件对均匀设计的实验结果进行回归分析,回
归数学模型为:Y=1.727+0.008 X1-0.031 X2+0.002 X3,相关系数r=0.999,显著性水平α=0.05,剩
余标准差S=0.015,F检验值Ft=222.37,大于F检验临床值F(0.05,3,1)=215.171,说明该模型精确
性和稳定性较高,可用于多刺绿绒蒿超临界CO2 萃取工艺的研究;当Y 值最大时多刺绿绒蒿萃取率最高,
所以X1、X3条件应取表中最大值,X2应取表中最小值。即多刺绿绒蒿的最佳萃取工艺条件:萃取压力
28MPa,萃取温度45℃,萃取时间180min。为了验证此结果的准确性,我们在最佳条件下做了3次验证
试验,得率分别为0.89%、0.92%和0.90%,平均萃取率为0.91%,高于表2中的试验结果,说明我们找
99
广西师范大学学报:自然科学版 第33卷
到的最佳提取条件是正确的。回归显著性检验见表3。
表2 试验结果表
Tab.2 Experimental results
试验号 样品质量/g 萃取物质量/g 提取率1/%
1 100.01 0.54 0.54
2 100.07 0.18 0.18
3 100.06 0.16 0.61
4 100.01 0.28 0.28
5 100.02 0.23 0.23
1.提取率=(萃取物质量/样品质量)×100%。
表3 变量分析表
Tab.3 Analysis of variance
变异来源 平方和 自由度 均方 均方比
回归 U=0.15 K=3 U/K=0.05 F=222.37
剩余 Q=0.000 2 N-1-K=1 U/(N-1-K)=0.000 2
总和 L=0.15 N-1=4
2.2 KI保留指数的测定
手动进样针精密移取正构烷烃混合对照品5μL,按照1.4.2节的条件直接进样,经程序升温后得到
条件分析的结果,用于组分的KI值计算;记录该条件下C7~C30各正烷烃的保留时间,采用线性升温公式
KI=100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)计算各组分的KI值,其中tx、tn 和tn+1分别为被分析组分流出峰的
保留时间和被分析组分保留时间相邻的碳原子数处于n和n+1之间的正烷烃(tn<tx<tn+1)的流出峰的
保留时间。
2.3 多刺绿绒蒿萃取物成分GC-MS分析
以峰面积归一化法计算萃取物各组分相对含量,对相对峰面积大于0.01%的组分进行鉴定。对各峰
质谱图进行NIST标准谱库检索,选取质谱匹配度高的前10个可能物质,计算其KI值,并与NIST库KI
值检索结果相比较,以质谱和KI值匹配度最高的化学结构为最佳鉴定结果,结果见表4。
2.4 多刺绿绒蒿萃取物在不同溶剂中溶解性能比较
将多刺绿绒蒿的萃取物分别溶解于乙酸乙酯、丙酮、甲醇中,按照上述GC-MS的条件进行分析,得到
总离子流图。结果发现多刺绿绒蒿的萃取物在甲醇中溶解出的成分较多,在乙酸乙酯、丙酮中溶解所得产
物较少,因此本试验选择甲醇作为溶剂。
3 小结与讨论
通过超临界CO2 萃取技术得到了黄色粉末状的多刺绿绒蒿萃取物,而不是液态萃取物。这是由于超
临界CO2 萃取技术主要是萃取中低极性成分[16],因此其萃取物不只包含挥发油,还包括脂肪酸、萜类、醌
类及蒽衍生物等,以上物质均可以以固体形式存在,所以萃取物的最终性状取决于萃取成分的固液比例,
因此萃取物为固体粉末是合理的情况。
采用GC-MS结合保留指数对多刺绿绒蒿萃取物进行分析,共分离鉴定出53种化学成分,主要为饱
和脂肪酸、脂肪烃及萜类化合物,其中以γ-谷甾醇、亚油酸、棕榈酸含量较高。对53种化学成分的性状进
行研究发现其多数常温下为固体且占比例较大,符合萃取物是固体粉末的事实。
本实验使用均匀设计的方法用最少的实验次数揭示了影响多刺绿绒蒿萃取各因素与指标间的规律,
从而获得满意的结果,为多刺绿绒蒿的进一步研究与开发利用提供可靠的实验依据。
001
第3期 曾擎屹等:藏药多刺绿绒蒿超临界CO2 萃取及其成分研究
表4 多刺绿绒蒿萃取物成分分析结果(n=5)
Tab.4 Meconopsis horridula Hook.f.&Thoms.chemical analysis results(n=5)
保留时间/min 化合物名称 分子式 相对含量/% KI
4.879 1,4-二甲苯 C8H10 1.10 897
11.494 正十一烷 C11H24 0.02 1 100
14.898 2-甲基-3,5-羟基-4H-吡喃酮 C6H6O4 0.02 1 181
15.666 十二碳烷 C12H26 0.04 1 199
17.548 右旋香芹酮 C10H14O 0.08 1 243
18.689 壬酸 C9H18O2 0.09 1 270
22.803 癸酸 C10H20O2 0.06 1 367
27.651 乙位紫罗兰酮 C13H20O 0.07 1 484
29.289 二氢猕猴桃内酯 C11H16O2 0.08 1 525
30.675 月桂酸 C12H24O2 0.12 1 560
37.902 邻苯二甲酸二甲氧基乙酯 C14H18O6 0.03 1 716
39.843 肉豆蔻酸 C14H28O2 0.26 1 764
41.210 十四烷 C14H30 0.02 1 798
42.648 植酮 C18H36O 0.09 1 845
43.118 正十五烷酸 C15H30O2 0.08 1 861
43.312 邻苯二甲酸二异丁酯 C16H22O4 0.11 1 867
44.930 棕榈酸甲酯 C17H34O2 0.06 1 926
45.310 9-十六碳烯酸 C16H30O2 0.11 1 941
45.575 棕榈油酸 C16H30O2 0.09 1 951
46.000 棕榈酸 C16H32O2 7.17 1 968
47.502 贝壳杉-16-烯 C20H32 0.37 2 032
48.115 十七烷酸 C17H34O2 0.17 2 060
48.805 亚油酸甲酯 C19H34O2 0.11 2 092
48.927 二十一烷 C21H44 0.23 2 098
49.204 植物醇 C20H40O 3.07 2 111
49.817 亚油酸 C18H32O2 10.55 2 142
49.933 亚麻酸 C18H30O2 7.85 2 148
50.262 硬脂酸 C18H36O2 3.27 2 165
51.126 亚麻酸乙酯 C20H34O2 0.48 2 209
51.300 R-14-甲基-8-十六烷醇 C17H32O 0.48 2 219
52.222 1-二十碳烯 C20H40 0.40 2 269
52.505 13-十六碳烯酸 C16H26O3 0.25 2 284
52.731 植烷 C20H42 1.23 2 297
52.970 13-十四烯-11-炔-1-醇 C14H24O 0.44 2 311
53.447 4-(4-乙基环己基)-1-戊基环己烯 C19H34 0.25 2 338
101
广西师范大学学报:自然科学版 第33卷
续表
保留时间/min 化合物名称 分子式 相对含量/% KI
53.982 二十二烷 C22H46 1.09 2 370
54.446 二十四烷 C2 4H50 0.22 2 397
54.833 2,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚) C23H32O2 0.88 2 420
55.194 5α-4,4-二甲基-雄甾-1-烯-3-酮 C23H40O 0.48 2 442
55.645 11-二十三烯 C23H46 0.77 2 470
55.774 13-十四碳烯-1-醇乙酸酯 C16H30O2 0.28 2 478
55.942 1-二十二烯 C22H44 0.28 2 488
56.077 正二十五烷 C25H52 3.27 2 496
57.051 γ-谷甾醇 C20H34O2 15.05 2 580
57.921 28-异岩藻甾醇 C29H48O 2.04 2 615
58.224 白桦酯醇 C30H50O 4.59 2 634
59.017 2-单亚油酸甘油酯 C21H38O4 0.79 2 684
59.166 甘油亚麻酸酯 C21H36O 2.93 2 693
61.042 汉地醇 C30H50O 5.55 2 793
61.725 角鲨烯 C30H50 0.77 2 824
62.621 N-(2-三氟甲基苯)-3-吡啶甲酰胺肟 C13H10F3N3O 0.53 2 863
64.265 2,6,10,15,19,23-六甲基二十四碳烯 C30H52 1.52 2 927
65.961 维他命E C29H50O2 0.69 2 984
参 考 文 献:
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Composition of Meconopsis horridula Hook.f.&Thomson in SCF-CO2Extraction
ZENG Qing-yi 1,2,3,LIU Xiao-cui 1,2,3,BAI Xue1,2,3,LIN Peng-cheng1,2,3,JI Shou-xiang1,2
(1.Colege of Pharmacy,Qinghai University for Nationalities,Xining Qinghai 810007,China;2.Key Laboratory of Plant
Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research,Qinghai University for Nationalities,Xining Qinghai 810007,
China;3.Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis in Qinghai Province,Xining Qinghai 810007,China;)
Abstract:Meconopsis horridula Hook.f.&Thomson was chosen as raw materials to study the optimum
parameters of SCF-CO2 extraction of Meconopsis horridula Hook.f.& Thomson and chemical
constituents of extractive matters.SCF-CO2extraction condition was selected by uniform design.In the
experiment,three factors should be taken into consideration,such us the extraction time,extraction
pressure and extraction temperature.GC-MS was applied to analyze the extraction.The optimum
condition were obtained:the extraction time was 180minutes,the extraction pressure was 28MPa and
the extraction temperature was 45℃.55compounds in Meconopsis horridula Hook.f.& Thomson
were detected by GC-MS and 53compounds were identified by MS combined with Kovats retention
index.The major constituents of the extractive matters were clionasterol,linoleic acid and palmic acid.
Keywords:Meconopsis horridula Hook.f.&Thomson;SCF-CO2;uniform design;GC-MS;Kovats
(责任编辑 王龙杰)
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