全 文 ：铺散亚菊超临界 CO2 萃取挥发油成分及其抑菌活性研究
达洛嘉，马家麟，白 雪，高世宝，林鹏程*
(青海民族大学药学院，青海省青藏高原植物化学重点实验室，青海省药物分析学重点实验室，青海西宁 810007)
摘要 ［目的］研究藏药铺散亚菊挥发油的主要成分及其抑菌活性。［方法］采用超临界 CO2 法萃取铺散亚菊挥发油成分，采用气相色谱
质谱联用(GC －MS)结合相对保留指数进行组分分析鉴定，并通过滤纸片扩散法筛选铺散亚菊挥发油对常见 13种致病菌的抑菌活性。
［结果］从铺散亚菊超临界 CO2 萃取物中共分离出 127个可识别峰，含量高于 0． 02%的化学成分为 46种，占总萃取物的 67． 30%。铺散
亚菊挥发油对乙型副伤寒沙门菌、产气肠杆菌等 11种供试菌表现出抑菌活性。［结论］GC － MS结合保留指数对铺散亚菊超临界 CO2
萃取挥发油进行定性分析，使定性结果更为可靠。该研究结果可为铺散亚菊挥发油的抗菌活性研究提供试验依据。
关键词 铺散亚菊;超临界 CO2萃取;GC －MS;抑菌活性
中图分类号 Ｒ284． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2016)04 －004 －04
Study on the Chemical Constituents and Antibacterial Activity of the Volatile Oil from Ajania khartensis by Supercritical CO2 Fluid Ex-
traction
DA Luo-jia，MA Jia-lin，BAI Xue，LIN Peng-cheng* et al (Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis in Qinghai Province，Key Laboratory
of Plant Ｒesources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Ｒesearch，College of Pharmacy，Qinghai University for Nationalities，Xining，Qinghai
810007)
Abstract ［Objective］To research the chemical components of volatile oil from Ajania khartensis，and to investigate their antimicrobial activi-
ties． ［Method］The volatile oil from Ajania khartensis was obtained by supercritical CO2 fluid extraction，then combined GC-MS analysis with re-
tention index to appraise the chemical components，and screened antimicrobial activities of the volatile to thirteen common bacterial pathogens by
filter paper diffusion method． ［Ｒesult］127 identifiable peaks were isolated from the volatile oil，among them，46 components relative content
were higher than 0． 02% which accounted for 67． 30% of the total extract． The volatile oil from Ajania khartensis showed some antimicrobial ac-
tivities against Salmonella paratyphy B and Enterobacter aerogenes． ［Conclusion］It ensures the qualitative results by using GC-MS and retention
index to analyze the chemical components of volatile oil from Ajania khartensis． The filter paper diffusion method provides a reliable preparatory
screening result for antimicrobial activities of volatile oil from Ajania khartensis．
Key words Ajania khartensis;Supercritical CO2 fluid extraction;GC-MS;Antibacterial activity
基金项目 国家自然科学基金项目(81160554)。
作者简介 达洛嘉(1990 － ) ，男，青海共和人，硕士研究生，研究方向:
藏药继承与研发。* 通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从
事藏药化学成分及质量控制研究。
收稿日期 2016-01-11
铺散亚菊(Ajania khartensis) ，为菊科亚菊属多年生铺散
草本，分布在印度、俄罗斯以及我国青海、云南、宁夏、西藏、
四川、甘肃等地区，生长于海拔 2 500 ～ 5 300 m的地区，一般
生长于向阳山坡［1］，具有浓郁的特征气味。铺散亚菊在藏药
典籍《晶珠本草》中记载为蒿阿仲，主要用于治疗肺热症［2］。
张兴旺等［3］通过水蒸馏法提取铺散亚菊挥发油并使用 GC-
MS进行分析鉴定，但使用超临界 CO2提取铺散亚菊挥发油
及后续抑菌活性的研究则鲜见报道。笔者采用超临界 CO2
通用条件对铺散亚菊挥发油进行萃取［4］，获得挥发油使用
GC-MS分离鉴定，结合相对保留指数进行更准确地定性［5］。
致病微生物所引起的肺部感染属于中医肺热证范畴［6］。笔
者用铺散亚菊治疗肺热，采用滤纸片扩散法［7 －8］研究其挥发
油对 13种常见致病菌的抑菌效果，以佐证其在藏药中的
功效。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌种。13 株供试菌株购自中国药品生物制品检定
所，具体见表 1。
1． 1． 2 药材。藏药铺散亚菊于 2014年 8月采自青海省互助
北山林场，经青海民族大学药学院毛继祖教授鉴定为藏药铺
散亚菊。
1． 1． 3 试剂与耗材。CO2 为医用级(北京市华元气体化工
有限公司) ;正构烷烃混合对照品(C7 ～ C30) ，购自上海安谱
科学仪器有限公司;营养琼脂，购自北京陆桥技术责任有限
公司;蛋白胨，购自北京奥博星生物技术有限责任公司;牛肉
膏，购自北京奥博星生物技术有限责任公司;氯化钠，购自天
津市大茂化学试剂厂;丙酮，购自天津市富宇精细化工有限
公司。所用试剂都为分析纯。耗材有滤纸片等(d =6 mm)。
1． 1． 4 仪器。气相色谱 /质谱联用仪，型号为 7890A /5975C，
为美国 Agilent公司产品;G1888顶空进样器，为 Agilent公司
产品;四极杆质谱检测器;质谱检索数据库:NIST08 MS
search 2． 0;色 谱 数 据 处 理 系 统 (MSD Chemstation
D． 03． 00． 611) ，为美国 Agilent 公司产品;超临界 CO2 萃取
仪，型号为 7071(SFE －2) ，购自美国 ASI公司;空压机;SDC-
6冷循环水系统;HZQ-X100A 型恒温振荡培养箱，为上海一
恒科学仪器有限公司产品;AS-1060L型高压灭菌锅，为邝杏
生物技术有限公司产品;SW-CJ-2FD 型超洁净工作台，为苏
州净化设备有限公司产品。
1． 2 方法
1． 2． 1 超临界 CO2 萃取物的制备。将铺散亚菊全草粉碎后
过60目筛，称取200 g投入1 L萃取釜中，加热萃取釜温度至
50 ℃稳定，泵入 CO2 压力设定为 25 MPa，静态萃取 1． 5 h，出
样口温度 100 ℃。
1． 2． 2 铺散亚菊萃取物的 GC －MS保留指数分析。
1． 2． 2． 1 样品制备。取 0． 01 g铺散亚菊萃取物，加到 2 mL
丙酮中充分溶解。
责任编辑 陈玉敏 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2016，44(4) :4 － 7
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.04.002
1． 2． 2． 2 色谱条件。色谱柱为 HP-5 弹性石英毛细管柱(30
m ×250 μm，0． 25 μm) ;进样口温度 250 ℃;载气为 He 气，柱
流量为 0． 8 mL /min。用于手动进样的程序升温条件为:初始
温度 60 ℃，保持 1 min，再以 3 ℃ /min 升至 150 ℃，保持
5 min;以 5 ℃ /min升至 260 ℃，保持 10 min。进样量 5 μL。
表 1 供试菌株
Table 1 Tested strains
序号
Serial No．
菌种
Bacteria
拉丁学名
Latin name
批号
Batch No．
1 藤黄微球菌 Micrococcus luteus CMCC(B)28001
2 大肠埃希氏杆菌 Escherichia coli CMCC(B)44102
3 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC(B)26003
4 乙型溶血性链球菌 Streptococcus hemdytis-β CMCC(B)32210
5 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis CMCC(B)63501
6 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa CMCC(B)10104
7 乙型副伤寒沙门菌 Salmonella paratyphy B CMCC(B)50094
8 白色念球菌 Candida albicans CMCC(F)98001
9 黑曲霉 Aspergillus niger CMCC(F)98003
10 酿酒酵母菌 Saccharomyces cerevisiae Hansen CMCC(F)23854
11 产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes CMCC(B)12021
12 蜡样芽胞杆菌 Bacillus cereus CMCC(B)63301
13 肺炎克雷伯菌 Klebsiella Pneumoniae CMCC(B)46117
1． 2． 2． 3 质谱条件。标准质谱调谐;电离方式 EI，电子能量
70 eV;四级杆温度:150 ℃;离子源温度:230 ℃;辅助区温度:
295 ℃;溶剂延迟时间:3 min;数据采集扫描模式:全扫描。
质谱扫描质量范围(m/z)50 ～550。
1． 2． 2． 4 保留指数(KI)的测定。手动进样针精密移取正构
烷烃混合对照品 5 μL，按照“1． 2． 2． 3”下的条件直接进样，经
程序升温后得到条件分析的结果，用于组分 KI 值的计算;记
录该条件下 C7 ～ C30各正烷烃的保留时间，采用线性升温公
式 KI =100n +100(tx － tn)/(tn +1 － tn)计算各组分的 KI值，
其中 tx、tn 和 tn +1分别为被分析组分流出峰的保留时间和被
分析组分保留时间相邻的碳原子数处于 n 和 n +1 之间的正
烷烃(tn ＜ tx ＜ tn +1)的流出峰的保留时间。
1． 2． 3 铺散亚菊挥发油的抑菌活性测定。
1． 2． 3． 1 菌种活化。①接种乙型溶血性链球菌、产气肠杆
菌、藤黄微球菌等 11 种细菌的新鲜培养物于营养肉汤培养
基或营养琼脂培养基，30 ℃培养 18 ～24 h。②接种白色念球
菌和黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁培养基上，25 ℃下培
养 3 ～5 d。
1． 2． 3． 2 菌悬液的制备。①将上述细菌培养物加入无菌
0． 9%氯化钠溶液配制成浓度为 108 CFU /mL的菌悬液;②将
上述真菌培养物加入 3 mL无菌的 0． 9%氯化钠溶液(含 0．
05%(V /V)吐温 80) ，混匀后将溶液表面的孢子缓慢吸出至
无菌试管内，并配制成浓度为 108 CFU /mL的孢子悬液。
1． 2． 3． 3 含菌平板的制备及最低抑菌浓度(MIC)的测定。
采用滤纸片琼脂平板扩散法，对铺散亚菊挥发油的抑菌圈直
径进行测定。用移液枪吸取已制备好的待试菌株菌悬液 0． 2
mL，加入 200 mL的营养琼脂培养基或马丁氏培养基中，混合
均匀。将带有菌悬液的培养基依次倒入培养皿中，待培养基
凝固。配制不同浓度(2． 00、1． 00、0． 50 和 0． 25 mg /mL)的挥
发油。用移液枪分别吸取 4种不同浓度的挥发油溶液，加至
滤纸片上，待滤纸片完全润透，用已灭菌的镊子将浸有挥发
油溶液的滤纸片贴在待试菌培养基上，用丙酮或 0． 9%氯化
钠溶液(含 0． 05%(V /V)吐温 80)溶液作为空白对照。每个
浓度进行 3次平行试验。将含菌平板置于培养箱中，将细菌
在 30 ℃下培养 18 ～24 h，真菌 25 ℃条件下培养 24 ～48 h后
测量抑菌圈直径。置于培养箱培养 10 h后，每 1 h对平板进
行观察，以抑菌圈最大直径为最终记录值。
2 结果与分析
2． 1 超临界 CO2 萃取物 所得萃取物为黄色固体，具有浓
郁的香气。
2． 2 铺散亚菊萃取物的 GC －MS保留指数分析 以峰面
积归一化法计算萃取物各组分相对含量，选择峰面积大于
0． 02%、NIST标准谱库匹配度高于 90 以上的组分共 46 个，
并计算各峰与标准谱库匹配度前 3 位的组分保留指数，与
NIST数据库中保留指数进行比较，以质谱和保留指数匹配
度最接近的物质为最优结果。由表 2可知，从铺散亚菊超临
界 CO2 萃取物中共分离出 127个可识别峰，按照以上条件鉴
定出 46种组分，占总萃取物的 67． 30%。
2． 3 最低抑菌浓度(MIC) 平板产生抑菌效果时的挥发油
最低浓度即为最低抑菌浓度。由表 3可知，铺散亚菊挥发油
对 11种致病菌具有抑菌活性。其中，乙型副伤寒沙门菌、产
气肠杆菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯菌的 MIC 值为 0． 50
mg /mL;金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌、
乙型溶血性链球菌、白色念球菌的 MIC值为 1． 00 mg /mL;蜡
样芽胞杆菌、铜绿假单胞菌的 MIC值为 2． 00 mg /mL。
544 卷 4 期 达洛嘉等 铺散亚菊超临界 CO2萃取挥发油成分及其抑菌活性研究
表 2 铺散亚菊萃取物的成分分析
Table 2 Analysis of chemical components of Ajania khartensis extracts
中文名称
Chinese name
英文名称
English name
分子式
Molecular formula
保留指数
Ｒetention index
含量
Content∥%
亚麻油酸 Linoleic acid C18H32O2 2 168 20． 147 6
棕榈酸 Palmitic acid C16H32O2 1 980 8． 993 6
谷甾醇 Stigmast-5-en-3-ol C29H50O 2 635 3． 997 4
(Z)-7-十二碳烯-1-醇乙酸酯 Looplure C14H26O2 2 145 3． 995 4
豆甾醇-4-烯-3-酮 Stigmast-4-en-3-one C29H48O 2 615 3． 808 8
角鲨烯 Squalene C30H50 2 759 3． 080 0
山嵛酸 Behenic acid C22H44O2 2 572 2． 921 9
白桦酯醇 Beta-amyrin C30H50O 2 650 2． 755 9
花生酸 Eicosanoic acid C20H40O2 2 369 2． 100 5
环氧鲨烯 Squalene epoxide C30H50O 2 824 1． 990 3
1，21-二十二碳二烯 1，21-docosadiene C22H42 2 488 1． 773 7
1，19-二十碳二烯 1，19-eicosadiene C20H38 2 276 3． 806 2
二十五烷 Pentacosane C25H52 2 497 0． 868 1
十八烷 Octadecane C18H38 1 798 0． 729 1
十六烷基环氧乙烷 2-hexadecyloxirane C18H36O 2 146 0． 612 3
苯乙酸茴香酯 Anisyl phenylacetate C16H16O3 2 042 0． 506 2
芥酸 Erucic acid C22H42O2 2 308 0． 487 4
二十四烷醇 n-tetracosanol-1 C24H50O 2 421 0． 479 9
硬脂酸 Stearic acid C18H36O2 1 994 0． 475 4
叶绿醇 Plant alcohol C20H40O 2 112 0． 473 7
二十六烷 Hexacosane C26H54 2 532 0． 471 3
1-十八烯 Octadec-1-ene C18H36 2 288 0． 449 4
顺式 －十八碳烯酸 Asclepic acid C18H34O2 2 193 0． 419 6
1-二十二烯 1-docosene C22H44 2 488 0． 273 9
6，10，14-三甲基-2-十五烷酮 Perhydrofarnesyl acetone C18H36O 1 846 0． 272 4
油酸 Oleic acid C18H34O2 2 106 0． 244 6
正十五酸 Pentadecanoic acid C15H30O2 1 865 0． 215 3
肉豆蔻酸 Myristic acid C14H28O2 1 767 0． 190 0
ω-二十三烯酸 ω-tricosenoic acid C23H44O2 2 466 0． 177 5
苯乙醇 Phenethyl alcohol C8H10O 1 113 0． 064 0
香草醛 Vanillin C8H8O3 1 396 0． 056 2
壬酸 Nonanoic acid C9H18O2 1 272 0． 043 1
二氢猕猴桃内酯 Dihydroactindiolide C11H16O2 1 525 0． 042 4
月桂酸 Lauric acid C12H24O2 1 562 0． 041 6
10-顺 －十七碳烯酸 10-heptadecenoic acid C17H32O2 2 049 0． 038 7
茴香脑 Cis-anethol C10H12O 1 285 0． 033 4
丁香醛 Syringaldehyde C9H10O4 1 654 0． 032 3
苄基醇 Benzyl alcohol C7H8O 1 034 0． 030 6
正庚酸 Heptanoic acid C7H14O2 1 078 0． 030 1
α-蒎烯 α-copaene C15H24 1 375 0． 029 9
α-水芹烯 p-mentha-1，5-diene C10H16 1 007 0． 026 2
对甲氧基苯乙酮 4-methoxyacetophenone C9H10O2 1 351 0． 026 1
大茴香醛 Anisic aldehyde C8H8O2 1 253 0． 025 3
己酸 Hexanoic acid C6H12O2 984 0． 024 1
辛酸 Octanoic acid C8H16O2 1 175 0． 022 9
4-甲氧基苄醇 4-methoxybenzyl alcohol C8H10O2 1 282 0． 020 4
3 结论与讨论
笔者通过超临界 CO2 所萃取的铺散亚菊挥发油，外观上
为黄色固体，具有浓烈的特异性气味，区别于常规水蒸汽蒸
馏法提取的挥发油，这是由于超临界 CO2所萃取组分为小极
性，含较多的脂肪族类化合物，此类物质常温下大多为固体，
在挥发油中占据主要成分，因此通过超临界 CO2萃取的藏药
铺散亚菊挥发油常温下为固态。在收集萃取物时应将出样
口温度保持在 100 ℃，以防止样品中所含水分在出样口结冰
堵住管路，出样时气体流速不能过快，流速过快会使挥发油
得率下降，尤其是低沸点组分容易流失。超临界 CO2 萃取法
具有提取得率高、没有有机溶剂残留、操作温度低、萃取物纯
度高等优点，非常适合于高效率制备植物挥发油成分［9］。
6 安徽农业科学 2016年
表 3 铺散亚菊挥发油对 12种常见致病菌的抑菌圈直径
Table 3 The inhibition zone diameter of volatile oil from Ajania khartensis on 12 common pathogenic bacteria mm
挥发油浓度
Volatile oil
concentration
mg /mL
乙型副伤寒沙门菌
Salmonella
paratyphy B
产气肠杆菌
Enterobacter
aerogenes
藤黄微球菌
Micrococcus
luteus
肺炎克雷伯菌
Klebsiella
pneumoniae
金黄色葡萄球菌
Staphylococcus
aureus
枯草芽孢杆菌
Bacillus
subtilis
2． 00 12． 45 ±0． 27 10． 31 ±0． 18 9． 45 ±0． 11 15． 51 ±0． 11 9． 84 ±0． 04 9． 02 ±0． 39
1． 00 10． 02 ±0． 14 9． 90 ±0． 14 8． 17 ±0． 07 13． 13 ±0． 09 7． 82 ±0． 24 7． 59 ±0． 03
0． 50 7． 63 ±0． 05 9． 58 ±0． 06 7． 89 ±0． 06 8． 81 ±0． 09 － －
0． 25 － － － － － －
0(CK) － － － － － －
挥发油浓度
Volatile oil
concentration
mg /mL
大肠埃希氏杆菌
Escherichia
coli
乙型溶血性链球菌
Streptococcus
hemdytis － β
白色念球菌
Candida
albicans
蜡样芽胞杆菌
Bacillus
cereus
酿酒酵母菌
Saccharomyces
cerevisiae
Hansen
黑曲霉
Aspergillus
niger
铜绿假单胞菌
Pseudomonas
aeruginosa
2． 00 8． 28 ±0． 03 8． 30 ±0． 25 8． 68 ±0． 35 8． 36 ±0． 27 8． 74 ±0． 29 － －
1． 00 7． 88 ±0． 10 7． 69 ±0． 12 7． 70 ±0． 30 － － － －
0． 50 － － － － － － －
0． 25 － － － － － － －
0(CK) － － － － － － －
GC －MS结合相对保留指数对铺散亚菊挥发油进行分
析鉴定，能够使鉴定结果更为准确。从铺散亚菊超临界 CO2
萃取物中共分离出 127 个可识别峰，其中峰面积大于
0． 02%，NIST标准谱库匹配度高于 90 以上的组分 46 个，占
总萃取物的 67． 30%，其中以脂肪酸类、烃类、醇类、酯类为主
要成分。脂肪酸中亚麻油酸含量高达 20． 15%，具有调节血
脂作用、预防心肌梗塞和脑梗塞、抗炎等作用［10 －11］。
笔者通过滤纸片琼脂平板扩散法对铺散亚菊挥发油进
行抑菌试验，发现对乙型副伤寒沙门菌、产气肠杆菌、藤黄微
球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠
埃希氏杆菌、乙型溶血性链球菌、白色念球菌、蜡样芽胞杆
菌、铜绿假单胞菌 11种供试菌具有抑菌作用，且对其中的乙
型副伤寒沙门菌、产气肠杆菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯菌 4
种菌具有较好的抑菌作用。铺散亚菊挥发油浓度与抑菌效
果成正比，铺散亚菊挥发油浓度越高，抑菌效果越好，而且无
论是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌，均有着明显的抑菌活
性，说明铺散亚菊挥发油有广谱、高效的抗菌活性。该试验
结果可为今后对铺散亚菊挥发油在抑菌方面的开发提供有
效的试验依据。
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