全 文 ：２０１４年
第２期　　　　　　　
青海师范大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　　　　　　　　
２０１４
Ｎｏ．２
基金项目：国家自然科学基金项目（３１２６００５２）；系统与进化植物学国家重点实验室项目（ＬＳＥＢ２０１２－０１）；教育部“春晖计划”合作科研项
目（Ｚ２０１００７８）．
收稿日期：２０１４－０１－１０
作者简介：拉　本（１９６７－），男，藏族，青海海南人，副教授，硕士．研究方向：药用植物的开发及利用研究．
＊通讯作者简介：苏　旭（１９８０－），男，博士，教授，硕士研究生导师．研究方向：系统与进化植物学．Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｓｕ８５２７９７２＠１２６．ｃｏｍ
青海省唐古特铁线莲指纹图谱的构建
拉　本１，２，刘玉萍３，苏　旭１，２＊
（１．青海师范大学 生命与地理科学学院，青海 西宁　８１０００８；２．青海师范大学 青藏高原环境与资源教育部重点实验室，青海 西宁　８１０００８；
３．青海师范大学 思想政治理论课教学科研部，青海 西宁　８１０００８）
摘　要：［目的］建立青海省唐古特铁线莲中齐墩果酸成分 ＨＰＬＣ指纹图谱，为其质量控制提供方法学依据．［方法］采用 ＨＰＬＣ法
建立唐古特铁线莲中齐墩果酸指纹图谱，标示其共有峰与特征峰，进行相似度评价．［结果］通过对１０批唐古特铁线莲药材的测
定，标定１５个共有峰和１２个非共有峰，建立了测试样品的 ＨＰＬＣ指纹图谱．［结论］该方法准确、稳定、可靠，可用于唐古特铁线莲
的质量研究和评价．
关键词：青海省；唐古特铁线莲；指纹图谱；ＨＰＬＣ；齐墩果酸
中图分类号：Ｑ９４９．９５　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００１－７５４２（２０１４）０２－００３１－０５
唐古特铁线莲（Ｃｌｅｍａｔｉｓ　ｔａｎｇｕｔｉｃａ（Ｍａｘｉｍ．）Ｋｏｒｓｈ）别名甘青铁线莲、叶芒茶保（藏名），为毛莨科（Ｒａ－
ｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）铁线莲属（Ｃｌｅｍａｔｉｓ　Ｌ．）多年生草本植物，分布于青海、甘肃、新疆、陕西、西藏及四川西部［１］．全
草入药，可治风湿性关节炎［２］，同时能健胃、消食、治消化不良、恶心，并有排脓、除疮、消痞块等作用［３］．
国外内有关铁线莲属植物药理和化学性质的研究已有较多报道［４－５］，且许多生物学者已从该属植物中
分离出多种不同类型的化合物，包括皂甙、黄酮类化合物、木质素、生物碱、挥发油等［６］．现代药理研究表明，
铁线莲属植物的皂甙类化合物具有抗肿瘤、抗炎、镇痛等药理活性［７－８］；黄酮类化合物具有降血脂和胆固醇
的作用［９］，同时还可以消除自由基、抗肿瘤、保肝、泻下、保护心血管系统和抗病毒以及杀虫等光谱的生理活
性［１０］，而且国内一些学者对青藏高原地区唐古特铁线莲中的黄酮类化合物、总皂甙和齐墩果酸含量也做了
一定的研究报道［１１－１２］．然而，目前关于铁线莲属指纹图谱的研究较少，尤其是对青藏高原地区唐古特铁线莲
齐墩果酸进行指纹图谱的研究还尚属空白．据此，本文首次采用乙腈－磷酸水系统对１０批唐古特铁线莲中
齐墩果酸进行 ＨＰＬＣ指纹图谱研究，标示其共有峰与特征峰，进行相似度评价，旨在为青藏高原地区药用植
物的质量控制提供可靠的方法学依据．
１　仪器与试药
１．１　唐古特铁线莲药材
唐古特铁线莲药材均采集于青海省西宁市杨家寨实验种植地（表１），经青海师范大学生命与地理科学
学院吴学明教授鉴定为唐古特铁线莲（Ｃｌｅｍａｔｉｓ　ｔａｎｇｕｔｉｃａ（Ｍａｘｉｍ．）Ｋｏｒｓｈ）．
１．２　仪器及数据处理软件
Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ２６９５泵＋Ｗａｔｅｒｓ１９９６检测器＋ＥｍＰｏｗｅｒ色谱工作站）；色谱柱Ｐｈｅ－
ｎｏｍｅｎｅｘ　Ｌｕｎａ　Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）；ＫＱ３２００ＤＥ型医用数控超声波清洗器，由昆山市超声仪器有限
公司生产；ＤＫ－Ｓ２６型电热恒温水浴锅，由上海精宏试验设备有限公司生产；６２０２小型高速粉碎机，由北京
环亚天元机械技术有限公司生产；ＲＥ－５２ＣＳ型旋转蒸发仪，由上海亚荣生化仪器厂生产；ＳＨＢ－Ⅳ双Ｂ型
循环水式多用真空泵，由郑州长城科工贸有限公司生产；ＴＣ－１５恒温电热套２０００ｍＬ，由上海宁市华星仪器
厂生产；ＤＨＧ－９０５３Ａ型电热恒温鼓风干燥箱，由上海一恒科学仪器有限公司生产；电子天平，由北京赛多
DOI:10.16229/j.cnki.issn1001-7542.2014.02.019
青海师范大学学报（自然科学版） ２０１４年
利斯仪器系统有限公司生产；国家药典委员会重要色谱指纹图谱相似度评价系统 Ａ版（２００４）；统计软件
ＳＰＳＳ１２．０．
表１　样品来源
Ｔａｂ．１　Ｏｒｉｇｉｎｓ　ｏｆ　ｃａｍｐｒｅｓｔ
样品号 原植物 来源 采集日期 采集人
１ 唐古特铁线莲 青海省西宁市杨家寨实验种植地 ２００８－０５－０１ 苏旭
２ 唐古特铁线莲 青海省西宁市杨家寨实验种植地 ２００８－０５－１５ 苏旭
３ 唐古特铁线莲 青海省西宁市杨家寨实验种植地 ２００８－０５－２９ 苏旭
４ 唐古特铁线莲 青海省西宁市杨家寨实验种植地 ２００８－０６－１３ 苏旭
５ 唐古特铁线莲 青海省西宁市杨家寨实验种植地 ２００８－０６－２５ 袁艳君
６ 唐古特铁线莲 青海省西宁市杨家寨实验种植地 ２００８－０７－０９ 袁艳君
７ 唐古特铁线莲 青海省西宁市杨家寨实验种植地 ２００８－０７－１５ 袁艳君
８ 唐古特铁线莲 青海省西宁市杨家寨实验种植地 ２００８－０７－２１ 袁艳君
９ 唐古特铁线莲 青海省西宁市杨家寨实验种植地 ２００８－０７－２９ 袁艳君
１０ 唐古特铁线莲 青海省西宁市杨家寨实验种植地 ２００８－０８－０８ 袁艳君
１．３　试剂
所有有机溶剂均为分析纯；乙腈为色谱纯；水为屈臣氏纯净水；自制０．２％磷酸水溶液，并经０．４５μｍ滤
膜过滤；齐墩果酸对照品（批号１１０８３ｌ－２００８０２），购自中国药品生物制品检验所．
２　方法与结果
２．１　色谱条件
色谱柱：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｌｕｎａ　Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）；流动相：乙腈－０．０２％磷酸水，梯度洗脱；检测
波长：２０５ｎｍ；分析时间：１１５ｍｉｎ；进样：１０μＬ．
２．２　样品制备
２．２．１　对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的齐墩果酸０．１４００ｍｇ，加甲醇溶解并定容至１０ｍＬ，即得．
２．２．２　供试品溶液的制备
将１０批样品干燥，分别精密称取粉末８ｇ，置于２５０ｍＬ圆底瓶中，甲醇加热回流提取４次，每次１ｈ，甲醇
提取液，转移至２５０ｍＬ容量瓶中，精密称取１ｍＬ，转移至１０ｍＬ容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得供试品．
２．３　方法学考察
选取齐墩果酸为参照峰，计算 ＨＰＬＣ色谱图中峰面积≥１％共有色谱峰的保留时间和峰面积的 ＲＳＤ
值．
２．３．１　精密度试验
取同一供试品溶液２０ｍＬ连续进样５次，检测指纹图谱，共有色谱峰的保留时间ＲＳＤ＜１％和峰面积
ＲＳＤ＜３．０％，表明仪器的精密度良好．
２．３．２　稳定性试验
取同一供试品溶液２０ｍＬ，分别在０、４、８、１２、２４ｈ分别进样，检测指纹图谱，１５个共有色谱峰的峰面积
ＲＳＤ＜３．０％．结果显示，样品溶液至少在２４ｈ内稳定．
２．３．３　重复性试验
取同一供试品溶液５份，分别进样２０ｍＬ，检测指纹图谱，１５个共有色谱峰的保留时间ＲＳＤ＜１％，表明
该方法重复性良好．
２．４　指纹图谱及技术参数
２．４．１　参数设置及相似度意义
（１）设定对照指纹图谱：设定对照指纹图谱，将待测指纹图谱与之比对计算．有２种方法：“采用某个样品
的指纹图谱作为对照指纹图谱“或”使用一个样本集（包含多个样品的指纹图谱）建立标准模板”．唐古特铁线
２３
第２期 拉　本，刘玉萍，苏　旭：青海省唐古特铁线莲指纹图谱的构建
莲指纹图谱相似度评价采用前者，即选取第３个样品的指纹图谱，由软件系统生成对照指纹图谱．
（２）对照图谱的生成方法：有均值法和中位数法．考虑到中药材来源的多样性及峰面积差异较大等，为了
避免均值向量受到极值（特大和特小）的影响而给出集中位置的虚假印象，故本研究统一采用中位数向量来
表征共有模式．
（３）时间窗宽度的设定：谱峰的匹配是运用时间窗口法将两张指纹图谱上的谱峰一一匹配，即以标准指
纹图谱中峰的保留时间为中心，取一定窗宽，若待测指纹图谱中的某峰落在该时间窗内，且中心位置最近，则
设定该两峰匹配；时间窗宽度是指相对于参照谱峰位置的可选保留时间范围，其单位根据横坐标轴的单位而
定（ｍｉｎ），时间窗宽度越大，可选的时间范围就越大．在色谱峰匹配时，选择一个合适的时间窗宽度非常重
要．本研究的时间窗宽度统一采用０．１ｍｉｎ．
（４）相似度的意义：指纹图谱表征的是样品整体特征，用来描述样品间的亲疏程度，直观比较峰的数目、
峰的顺序、峰面积或峰高的大小以及各峰间的相互比例是否相似，是带有主观性的定性描述，而相似度是样
品指纹图谱与对照指纹图谱共有模式的相似性的量度，可以量化描述指纹图谱相似性，即客观的数字化描
述，更精确地评价指纹图谱的相似性．
２．４．２　指纹图谱的建立（２０５ｎｍ处）
取１０批样品见表１，分别按“２．２”项下的方法制备，按照“２．１”项下的色谱条件进样，记录色谱图，得１０
批成品在２０５ｎｍ处的 ＨＰＬＣ指纹图谱并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（２００４Ａ）”进行评价．选取
指纹图谱中色谱峰分离良好的齐墩果酸（Ｓ）为参照峰，以参照峰的保留时间和峰面积作为１，分别计算共有
指纹峰的相对保留时间和相对峰面积．其中，共有峰１５个：１（５．５９１）、２（６．３７５）、３（９．５２３）、４（１０．１０４）、５
（１７．５６７）、６（２０．７９８）、７（２３．６３７）、８（３１．８４６）、９（３３．７１４）、１０（３４．８８８）、１１（３９．８１５）、１２（４４．４０７）、１３
（８５．１０９）、１４（９４．４１９）、１５（９９．９９４）；非共有峰１２个：１（６．４９１）、２（７．９５３）、３（１２．２９）、４（１８．４４６）、５（３０．０８９）、
６（３２．０４７）、７（３４．４８）、８（３４．８３２）、９（３５．１１）、１０（６４．４５３）、１１（９７．１６３）、１２（９８．３０９）．结果详见图１－２．
图１　叠加的指纹图谱（２０５ｎｍ）
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
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青海师范大学学报（自然科学版） ２０１４年
图２　１０批样品共有峰图谱
Ｆｉｇ．２　Ｃｏｍｍｏｎ　Ｐｅａｋｓ　ｆｏｒ　Ｔｅｎ　Ｂａｔｃｈｅｓ　ｏｆ　Ｓａｍｐｌｅｓ
２．４．３　１０批样品齐墩果酸吸收峰面积比较
１０批样品齐墩果酸吸收峰面积进行比较（图３），表明随着植物的生长齐墩果酸的含量逐渐递增．
图３　１０批样品齐墩果酸吸收峰面积示意图
Ｆｉｇ．３　Ａｒｅａｓ　ｏｆ　Ｃｏｍｍｏｎ　Ｐｅａｋｓ　ｏｆ　Ｏｌｅａｎｏｌｉｃａｃｉｄ　ｆｏｒ　Ｔｅｎ　Ｂａｔｃｈｅｓ　ｏｆ　Ｓａｍｐｌｅｓ
３　分析与讨论
３．１　提取溶剂的分析
齐墩果酸是脂溶性物质，故分别以乙醇，甲醇，石油醚，氯仿，盐酸—氯仿提取溶剂制备供试品溶液，按液
相色谱条件进样．结果表明，甲醇提取包含的色谱峰最多，总峰面积最大，故选择甲醇作为提取溶剂．
３．２　流动相的分析
在实验中，我们曾经使用乙腈－０．０２％磷酸水溶液系统、乙腈－水系统、甲醇－水溶液系统．我们的研究
发现，在甲醇－水系统下，色谱峰个数少；在乙腈－水溶液系统下，峰分离度良好，但峰型不好；在乙腈
－０．０２％磷酸水溶液系统下，峰分离度良好，基线较稳．因此，本实验采用乙腈－０．０２％磷酸水溶液系统效果
最佳．
３．３　检测波长的分析
由于各类成分ＵＶ吸收差别较大，在一个检测波长下不能全面检测各成分，齐墩果酸末端吸收，检测波
长在１９５ｎｍ～２２５ｎｍ 之间．因此，在２６２ｎｍ 下，齐墩果酸有非常小的吸收，而其他吸收明显；如果选用
２６２ｎｍ，所有峰将是未知峰；而在２２５ｎｍ下，齐墩果酸有较小的吸收，通过计算峰面积，不符合要求，所以选
择了在同一色谱条件的２０５ｎｍ检测波长来监控．
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３．４　指纹图谱的确立
初步建立了唐古特铁线莲的高效液相指纹图谱，在２０５ｎｍ检测波长下，对唐古特铁线莲中的成分的进
行了检测，并通过相似度软件对其进行了评价．其中，共有峰１５个：１（５．５９１）、２（６．３７５）、３（９．５２３）、
４（１０．１０４）、５（１７．５６７）、６（２０．７９８）、７（２３．６３７）、８（３１．８４６）、９（３３．７１４）、１０（３４．８８８）、１１（３９．８１５）、
１２（４４．４０７）、１３（８５．１０９）、１４（９４．４１９）、１５（９９．９９４）；非共有峰１２个：１（６．４９１）、２（７．９５３）、３（１２．２９）、
４（１８．４４６）、５（３０．０８９）、６（３２．０４７）、７（３４．４８）、８（３４．８３２）、９（３５．１１）、１０（６４．４５３）、１１（９７．１６３）、１２（９８．３０９）．
由于受各方面条件的限制，我们只采用了１０批次同一实验地的栽培品种作为供试材料，只选用齐墩果
酸一个参照峰，初步建立了青海省唐古特铁线莲的中药指纹图谱，因此该图谱样品少，产地单一，已知峰少，
不够完善．所以，在以后的研究工作中，我们将采集大量样本，采用不同产地的实验材料来进行相似度评价，
进一步完善青海省唐古特铁线莲的中药指纹图谱．
参考文献：
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Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｎ　Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｅｍａｔｉｓ　ｔａｎｇｕｔｉｃａｉｎ　Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
ＬＡＢｅｎ１，２，ＬＩＵ　Ｙｕ－ｐｉｎｇ３，ＳＵ　Ｘｕ１，２＊
（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｇｅｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｉｎｇ　８１０００８，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｎ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｉｎ　Ｔｉｂｅｔａｎ　Ｐｌａｔｅａｕ，
Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｉｎｇ　８１０００８，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｄｅｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｏｌｉｔｉｃａｌ　Ｔｈｅｏｒｙ　Ｔｅａｃｈｉｎｇ　ａｎｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｉｎｇ　８１０００８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ＨＰＬＣ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｏｆ　Ｏｌｅａｎｏｌｉｃａｃｉｄ　ｆｏｒｍ　Ｃｌｅｍａｔｉｓ　ｔａｎｇｕｔｉｃａ　ｉｎ
Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ　ｂａｓｅ　ｏｎ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＨＰＬＣ　ｍｅｔｈ－
ｏｄ，ｔｈｅ　ＨＰＬＣ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｏｆ　Ｏｌｅａｎｏｌｉｃａｃｉｄ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｍｕｔｕａｌ　ｐｅａｋｓ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ－
ｔｉｃ　ｐｅａｋｓ　ｗｅｒｅ　ｍａｒｋｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｂｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　１０ｂａｔｃｈｅｓ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｍａｔｅ－
ｒｉａｌｓ，１５ｌａｂｅｌｅｄ　ｍｕｔｕａｌ　ｐｅａｋｓ　ａｎｄ　１２ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｐｅａｋｓ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｍａｒｋｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＨＰＬＣ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｈａｄ
ｂｅｅｎ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｔａｂｌｅ　ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ．Ｓｏ　ｉｔ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｌ－
ｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｃｌｅｍａｔｉｓ　ｔａｎｇｕｔｉｃａ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ；Ｃｌｅｍａｔｉｓ　ｔａｎｇｕｔｉｃａ （Ｍａｘｉｍ．）Ｋｏｒｓｈ；Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ；Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；Ｏｌｅａｎｏｌｉｃａｃｉｄ
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