全 文 ：浙江大学学报 (农业与生命科学版 )　 27( 4): 365～ 369, 2001
Journal of Zhejiang University ( Ag ric. & Life Sci. )
　　收稿日期: 2000-06-26
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 39070072)
作者简介: 傅承新 ( 1954- ) ,男 , 浙江杭州人 ,教授 ,从事植物系统进化和保护生物学研究 .
文章编号: 1008-9209( 2001) 04-0365-05
菝葜属圆锥菝葜组的 RAPD分析及系统发育研究初报
傅承新 , 邱英雄 , 孔航辉
(浙江大学 生物科学系 ,植物系统进化与生物多样性实验室 ,浙江 杭州 310029)
摘　要: 利用随机扩增多态 DN A( RAPD )分析技术 ,选取 13个 10 bp长度的随机引物 ,对菝葜属圆锥
菝葜组的 6种菝葜及其近缘种进行了 DNA多态性研究 ,对扩增产物用 DPS2000可变类平均法进行聚
类分析 . 结果表明: ①该组植物 DNA的随机引物扩增多态性较丰富 , 13个引物共得到 273个条带 ,组内
种间表现出较近的遗传距离 ,体现出具有共同祖先的特征 ;②同种不同个体具有相对一致的条带 ,也最
早聚合 ,表明 RAPD在种内是相对稳定的 ,具有一定的系统学意义 ;③海南岛产的材料具有一定的独特
性 ,值得进一步研究 ;④马达加斯加的菝葜 ( Smilax anceps)和外类群薯蓣科的薯蓣、百合科的油点草总
是首先聚合在一起 ,表明了马达加斯加菝葜的独特性 ,以及在分子水平体现的共同祖征 . 也说明菝葜的
起源可以追溯到地球板块分离以前 . 在板块分离后 ,该种菝葜在马达加斯加独立生长 ,保留了更多与其
他近缘单子叶植物的祖先性状 ,而保留在亚洲大陆的其它菝葜种则不断演化 ,出现了 DN A结构上的分
化 ,表现出与薯蓣、油点草较低的同源率 ;⑤ RAPD在菝葜属的分类上有一定的应用前景 .
关　键　词: 菝葜属 ; 圆锥菝葜组 ; RAPD; 聚类分析
中图分类号: Q949　　　文献标识码: A
FU Ch eng-xin, Q IU Ying-x iong , KONG Hang-hui ( Laborator y of Plant Systematic Evolution and Biodi-
versit y , Dept. of Biosciences, Zhe jiang University , Hangzhou 310029, China)
A prel iminary phylogeny study and RAPD analysis of Sect. Macrant hae Kunth. in Smilax L . Journal o f
Zh ejiang Univ ersity ( Ag ric. & Life Sci. ) , 2001, 27( 4): 365～ 369
Abstract: Six species o f Sect. Macranthae Kunth in Smilax L. and fiv e affinitiv e species from Smilax ,
Diosco reaceae and Liliaceae w ere analy zed by RAPD . Cluster analy sis o f the amplified da ta w as conducted
by using a variable-average method in the prog ram DPS2000. Result was show ed as follows: ① 273 bands
o f 13 primers w ere acquired through RAPD, which had the abundant polymo rphism in this section. These
species w ere show ed tha t they had ver y close genetic distance betw een species in the section, deriv ed from
th e common ancestor. ② RAPD bands of different individuals within definite species w ere same corr e-
spondingly in the cluster tree, which show ed that RAPD was o f classification sense in Smilax in some con-
tent. ③ The Hainan popula tions of some species had th e specia lity in RAPD and it was valuable to the fur-
ther research. ④ Smilax anceps from Madagascar show ed more affinity w ith one species of Dioscor eaceae
and one of Liliaceae than the ones of Smilax fr om other continent. From this, w e may draw a conclusion
tha t the species deriv ed from the common ancestor of Liliales in the old continent. Af ter the separa tion and
mov ing of the old continent, the species of Madagasca r keep a long stabilization in a unique env ironment,
so that some primitiv e character s w er e kept dow n which was ancesto r characters and can be found in some
species of Dio scoreaceae and Liliaceae. But much differentiation in morphological and genetic, even the
DNA characters appea r in Smilax species o f the other continents. ⑤ RAPD is valuable and helpful in the
systematic and evolutiona ry research of Smilax .
Key words: Smilax ; Sect. Macranthae Kunth; RAPD; cluster analy sis
　　从 1753年林奈建立菝葜属 ( Smilax L. )
以来 ,人们对菝葜进行了几百年的研究 ,主要采
用了形态学、解剖学等常规性状的比较研究 ,以
探讨其在单子叶植物中的地位 ,以及各属的系
统演化关系 . 早期分类学家把菝葜作为百合科
的一个属 ; 1930年以后 ,人们从多方面认识到
菝 葜 应 作 为 一 独 立 的 科 , 即 菝 葜 科
( Smilacaceae)
[ 1]
. 菝葜科由菝葜属、肖菝葜属
( Heterosmilax Kunth)和类菝葜属 ( Ripogonum )
等组成 ,其中菝葜属是其重要组成部分 .菝葜属
多为攀援灌木 , 少数为直立小灌木 ; 常绿或有
时落叶 ,少数为草本 .常具坚硬的根状茎 , 枝条
常有刺和卷须 ,伞形花序 . 全世界约 200种 ,广
布于热带、亚热带地区以及东亚、北美的温暖地
区 . 我国有 79种 ,大多数分布在长江以南各省
区 . 形态分类研究认为菝葜属包括草本菝葜组
( Sect. Coprosmanthus To rrey )、菝葜组 ( Sect.
China Torrey )、土茯苓组 ( Sect. Coilanthus A.
DC)、圆锥菝葜组 ( Sect. Macranthae Kunth)和
穗菝葜组 ( Sect. Smilax ) [ 2～ 4] . 圆锥菝葜组系分
布于热带和南亚热带的一个组 ,约 30余种 . 圆
锥菝葜组最早是 Kunth提出的 , Koyama作了
进一步确认 [ 2] . 唐进等 [3 ]在《中国植物志》里对
圆锥菝葜组作了形态上的描述 ,但对该类群的
研究始终停留在形态水平 .
　　傅承新等对菝葜属进行了细胞分类学研
究 ,从细胞水平阐明了菝葜属内的组、种间关系
和系统发育 [5～ 8 ] . 但对于菝葜科的分子系统学
研究尚未见报道 .
　　虽然对于菝葜科的分类 ,前人已做了大量
的工作 ,但由于该类群种类繁多 ,加上研究方法
和所依据性状的差异以及分类标准的不一致 ,
对于菝葜科属间、属内及组内种间的系统关系
还不明确 . 近年来 ,随着分子生物学的发展 ,
RAPD技术在植物系统分类、推测物种的亲缘
关系方面得到了较大的应用 [9～ 15 ] . 笔者欲通过
对圆锥菝葜组植物的 RAPD分析 ,讨论其种内
变异和种间界限 ,明确圆锥菝葜组某些种的种
间关系、圆锥菝葜组与其它三组的关系和菝葜
属与其它属的关系 ,为世界菝葜科的系统进化
研究提供基础 .
1　实验材料和方法
1. 1　实验材料
　　本研究选取的 12个种 19份材料见表 1.
　 表 1　材料来源
Table 1　 Th e origin of plant material
编　号 学　　　　名 样本 来源 样　本　号
1 SPO 四棱菝葜 Smila x polycephala 云南马关古林菁乡 Fu93032
2 SF 长托菝葜 Smila x ferox 云南昆明西山 Fu91352
3 SB1 圆锥菝葜 Smila x bracteata 广西弄岗 Fu91077
4 SB2 圆锥菝葜 Smila x bracteata 广西弄岗 Fu91078
5 SO1 抱茎菝葜 Smila x ocreata 云南景东 Fu91369
6 SO2 抱茎菝葜 Smila x ocreata 云南版纳勐仑 Fu91386
7 SL1 马甲菝葜 Smila x lancei fol ia 海南尖峰岭 Fu94003
8 SA1 疣枝菝葜 Smilax aspericaulis 云南屏边大围山 Fu93009
9 SPE 穿鞘菝葜 Smila x per fol iata 云南普耳 -景洪 Fu91376
10 SM1 大果菝葜 Smila x macrocarpa 海南尖峰岭 Fu94026
11 SA2 疣枝菝葜 Smilax aspericaulis 云南屏边大围山 Fu93026
12 SM I 小叶菝葜 Smila x microphylla 四川灌县都江堰 Fu92029
13 SL2 马甲菝葜 Smila x lancei fol ia 云南景东 Fu91366
14 SB3 圆锥菝葜 Smila x bracteata 海南尖峰岭 Fu94008
15 SO3 抱茎菝葜 Smila x ocreata 海南尖峰岭 Fu94001
16 SM2 大果菝葜 Smila x macrocarpa 海南南林 Fu94028
17 DO 薯蓣 Dioscorea opposita 杭州 Fu20001
18 TM 油点草 Tricyrt is macropoda 杭州云栖 Fu20002
19 SA Smilax anceps 马达加斯加 Ku rita20003
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　　以圆锥菝葜组的圆锥菝葜、疣枝菝葜、抱茎
菝葜、穿鞘菝葜、马甲菝葜、大果菝葜为主要研
究材料 ,以长托菝葜 (菝葜组 )、小叶菝葜 (土茯
苓组 )、四棱菝葜 (穗菝葜组 )、采集自马达加斯
加的一种菝葜 ( Smilax anceps )为近缘种 ,以薯
蓣 (薯蓣科 )、油点草 (百合科 )为外类群 .
1. 2　方　法
1. 2. 1　基因组 DNA的提取与检测　　 DNA
提取按照迷你试剂盒 ( DNeasy Plant Mini,德国
QIAGEN公司 )提供的方法进行 .
1. 2. 2　 DNA浓度测定　　吸取 200μL的
ddH2O做空白对照实验校正零点 ,然后取各样
品 DNA 20μL稀释 10倍 ,将 200μL稀释液在
分光光度计上测定 OD260和 OD280值 . 按以下公
式计算 DNA的含量: DN A浓度 (μg /mL) =
OD260× 50×稀释倍数 . 然后以 20 ng /μL为标
准来稀释原溶液 .
　　本实验用两种检测方法来估计所提取的模
板 DNA的质量 . 紫外分光比色检测和琼脂糖
凝胶电泳检测 . 样品的 DNA电泳如图 1所示 .
图 1　基因组总 DNA电泳结果
Fig. 1　 Th e electroph oresi s result of th e total
DN A ext racted f rom leaf
1. 3　RAPD-PCR
1. 3. 1　引　物　　引物及 PCR试剂均购自上
海 Sangon公司 ,为十聚体寡核苷酸随机引物 .
本实验共选用了 23个引物 ,依据扩增结果 ,对
比可重复性、多态性后 ,筛选确定了扩增效果良
好的 13个引物 ,其序列见表 2.
1. 3. 2　 PCR体系及 PCR扩增程序　　反应
体系 ( 25μL)含有 2. 0 mmol /L MgCl2 , 0. 2
mmol /L DN TPs, 1× PCR buf fer, 1. 2单位
Tag Polymerase, 24 ng引物 , 20 ng模板 DNA.
反应在 PE480扩增仪上进行 ,反应参数为: 94
℃预变性 4 min, 94℃变性 15 s, 38℃复性 50
s, 72℃延伸 75 s,共 45个循环 ; 72℃延伸 7
min. 反应产物在 4℃下保存 .
表 2　引物及其序列
Table 2　 Th e primers and thei r sequences
引 物 序列 ( 5 -3′) 引 物 序列 ( 5 -3′)
S6 TGCTCTGCCC S28 GTGACGTAGG
S7 GGTGACGCAG S34 TCTGTGCTGG
S13 TTCCCCCGCT S36 AGCCAGCGAA
S16 TT TGCCCGGA S45 TGAGCGGACA
S18 CCACAGCAGT S47 TT GGCACGGG
S19 ACCCCCGAAG S48 GTGTGCCCCA
S24 AATCGGGCTG
1. 4　 PCR产物的电泳及拍照
　　在 0. 8%的琼脂糖凝胶上 , 100 V稳压电泳
50 min. 用 Kodak DC-120数码相机 (加盖红色
滤色镜 )拍照 ,将图象输入计算机待分析 . 图 2
为引物 S16的扩增产物图谱 .
图 2　引物 S16 PCR扩增图谱
Fig. 2　 RAPD pat terns amplif ied by primer 16
1. 5　数据分析
　　用 Kodak数据分析软件对图象进行 DNA
条带标记 ,将有带的记为 1,无带的记为 0,得原
始数据 .
　　将所有数据汇总 ,用 DPS2000数据处理系
统分析软件 ( Data Processing System )进行系统
聚类分析 ,选择欧氏距离中较可靠的可变类平
均法进行系统分析 .
2　结果与讨论
2. 1　聚类结果
　　该组及其近缘的 19种植物 DNA的随机
367　第 4期 　 傅承新 , 等　　菝葜属圆锥菝葜组的 RAPD分析及系统发育研究初报 　 　　　　
引物扩增多态性较丰富 , 13个引物共得到 273
个条带 , 其中 236条表现出多态性 ,占总带数
的 86. 44% ,平均每个引物扩增的 DNA带数为
18. 15条 (表 3) . 将这些数据标准化后 ,通过聚
类分析得可变类平均法系统树 (图 3) .
表 3　 13个有效引物的扩增情况
Table 3　 Ampli fications of 13 effective primers
引物号 DNA条带数 多态性条带数
多态性条带
所占百分率 /%
S6
S7
S13
S16
S18
S19
S24
S28
S34
S36
S45
S47
S48
17
29
10
25
23
24
21
15
22
25
20
19
23
15
26
7
23
19
21
20
15
18
19
18
15
20
88. 24
89. 66
70. 00
92. 00
82. 61
87. 50
95. 24
100. 00
81. 82
76. 00
90. 00
78. 95
86. 96
总　计 273 236
平均值 21 18. 15 86. 44
图 3　菝葜 RAPD性状树系图
Fig. 3　 Cluster diagram of 19 species based on RAPD
data using O HM model
2. 2　讨　论
　　从图 3可以看出 ,实验所用各种菝葜及其
近缘类群之间的遗传距离变化幅度在 7. 21～
11. 12之间 . 我们在 9. 5处画一直线 ,可把 19
个分类单位分成四类 ,分别为 A类、 B类、 C类
和 D类 . A类包括样本 S1、 S6、 S2、 S3、 S5, B类
包括 S4、 S9、 S12、 S13、 S15、 S8、 S11, C类包括
S7、D17、 T18、 S19, D类包括 S10、 S14、 S16. 从
树系图中可看出 , Smilax属的绝大多数构成了
A类与 B类 , 而作为外类群的薯蓣、油点草及
马达加斯加的一种菝葜构成了 C类 ,采自海南
岛的几种菝葜构成了 D类 ,表明菝葜属是一个
自然的类群 ,具有相似的 RAPD片段 . 同种不
同居群材料的 RAPD也表现相同的特征 ,如疣
枝菝葜材料 8和 11的遗传距离最近 ,首先聚
合 . 圆锥菝葜 ( S14、 S16)和大果菝葜 ( S10)构成
的 D支其亲缘关系也较近 ,遗传距离为 8. 25;
在形态上 ,这两者都是攀援灌木 ,生长在热带及
南亚热带 , 茎长可达 10 m,枝条无刺或少刺 ,
叶纸质 ,椭圆形或卵形 , 具 1个或数个伞形花
序 , 花序基部有宿存的苞片 (即所谓先出叶 ) ;
在叶柄长度、卷须有无、 脱落点位置、内外花被
的长宽等方面都极为相似 . 两个种的主要区别
在于:大果菝葜通常具 2个伞形花序 . 较少具 3
个或仅单个的 ,圆锥菝葜通常具 3～ 7个伞形花
序 . RAPD结果也支持它们的关系 .
　　从构成菝葜属的 A和 B两大支可以看到 ,
近缘组的几个种从 RAPD片段上是不能与圆
锥菝葜组分开的 , 常交叉在一起 ,如穗菝葜组
的四棱菝葜和菝葜组的长托菝葜 ,以及圆锥菝
葜组的三种菝葜聚在 A分支中 ,而土茯苓组的
小叶菝葜和圆锥菝葜组的 6种菝葜组成 B分
支 ,表明菝葜属根据形态所划分的组在 DNA
上的分化是不明显的 ,形态分支分类的工作也
表明这一点 (傅承新 ,待发表 ) . 在树系图中 ,有
一个重要的信息 ,薯蓣科的薯蓣 ( S17)和百合
科的油点草 ( S18)的遗传距离为 8. 25,在整个
供试样品中其亲缘关系较为靠近 ,而 Smilax
anceps ( S19,采自非洲的马达加斯加 )与两者聚
为 C类 . 这与傅承新等提出的菝葜起源的观点
相一致 ,即菝葜起源于大陆板块分离前 [8 ] .板块
分离后 ,马达加斯加岛上的菝葜与其他大陆长
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期隔绝而独立生长 , 与其它种的基因交流中
断 ,保留了更多与薯蓣科的薯蓣和百合科的油
点草相似的祖先性状 .同时也说明菝葜与薯蓣、
油点草在起源上有共同的祖先 .马甲菝葜 (采自
海南岛的 S7)也归于 C类 ,是独特的现象 ,有侍
进一步研究 . D分支中的三种菝葜 ,全为来自海
南岛的材料 ,与大陆产的菝葜并不聚在一起 ,表
明海南岛的菝葜有其特殊性 ,有可能是由其地
理环境引起的分化现象 ,值得进一步研究 .
　　通过研究 ,笔者认为 RAPD技术在菝葜属
的分类中有一定的应用前景 ; RAPD对同一物
种不同居群的鉴定是有价值的 ;从 RAPD得到
的系统树并不支持菝葜属内组的划分 ,表明菝
葜是一个自然的家族 ,但要搞清其系统发生 ,有
待于分子系统学 (正在进行 )结合形态、细胞、地
理分布等的全面研究 .
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