全 文 ：收稿日期:2014-03-06 接受日期:2014-08-15
基金项目:浙江省医学重点学科群建设项目(XKQ-010-001) ;浙江
省科技计划项目(2012F10005，2007Ｒ20009)
* 通讯作者 Tel:86-571-88215620;E-mail:gaoli-z@ 163． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2014，26:1761-1766
文章编号:1001-6880(2014)11-1761-06
圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎的治疗作用及机制研究
屠凌岚1，2，郑晓亮1，2，程丽艳1，颜冬梅1，2，郑高利1*
1浙江省医学科学院药物研究所;2 浙江省医学科学院分子医学中心，杭州 310013
摘 要:本文研究圆锥铁线莲水提取物对实验性慢性非细菌性前列腺炎的治疗作用，并对其抗炎的作用机制进
行初步探讨。采用苯甲酸雌二醇致去势大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型，研究圆锥铁线莲对慢性非细菌性前
列腺炎的治疗作用。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清细胞因子白细胞介素 1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子 α
(TNF-α)的水平，Western Blot和免疫组化法检测前列腺组织环氧酶 2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)
的变化，探讨圆锥铁线莲发挥抗炎作用的可能机制。研究发现苯甲酸雌二醇致去势大鼠慢性非细菌性前列腺
炎模型中，圆锥铁线莲 2 g /kg组可见前列腺液中白细胞数明显降低，卵磷脂小体数量明显增加;病理切片可见
炎症细胞浸润和成纤维细胞增生的情况有所改善。圆锥铁线莲能明显降低苯甲酸雌二醇致去势大鼠慢性非细
菌性前列腺炎模型血清中 IL-1β及 TNF-α的含量，减少前列腺组织中 COX-2 和 iNOS的表达。表明圆锥铁线莲
水提取物对慢性非细菌性前列腺炎具有良好的抑制作用，其作用机制可能是通过调节炎症细胞因子水平、抑制
COX-2 以及 iNOS的表达，从而避免局部产生过量的前列腺素(PG)和一氧化氮(NO) ，减轻局部炎性损伤实现
的。
关键词:非细菌性前列腺炎;圆锥铁线莲
中图分类号:Ｒ932 文献标识码:A
Protective Effects of Clematis terniflora DC． on Chronic
Abacterial Prostatitis in Ｒats and Its Mechanism
TU Ling-lan1，2，ZHENG Xiao-liang1，2，CHENG Li-yan1，YAN Dong-mei1，2，ZHENG Gao-li1*
1 Institute of Materia Medica，Zhejiang Academy of Medical Sciences;2Center for Translational Molecular
Medicine，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013，China
Abstract:To investigate the protective effects of Clematis terniflora DC． on chronic abacterial prostatitis (CAP)in rats
and its possible mechanism． The CAP rat models were established by estrogen induction to observe the protective effects
of Clematis terniflora DC． The levels of IL-1β and TNF-α in serum were evaluated by enzyme-linked immunosorbent as-
say (ELISA)and the expression of iNOS and COX-2 were evaluated by Western Blotting and immunohistochemisty． The
number of white blood cells was obviously decreased，the density of lecithin corpuscle in prostatic secretion was increased
and the edema，inflammatory infiltration and proliferation of prostate were partly recovered by C． terniflora in estradiol
benzoate-induced chronic abacterial prostatitis rats． C． terniflora can obviously reduce the level of IL-1β and TNF-α in
serum and the expression of iNOS and COX-2 in prostate tissue． These results demonstrated that C． terniflora had protec-
tive effects on chronic abacterial prostatitis． Participation of immune regulation and inhibiting COX-2 and iNOS expres-
sion may be the possible mechanisms．
Key words:Abacterial Prostatitis;Clematis terniflora DC．
非细菌性前列腺炎是男科与泌尿科的常见疾病
之一，其发病缓慢，病因病理复杂，包括感染、自身免
疫反应和骨盆肌肉痉挛等;临床症状表现多样化，主
要表现为会阴或阴囊痛、排尿和下尿道刺激症状、前
列腺分泌增加等;并发症较多，病程迁延，反复发作，
经久难愈，是一种较顽固的慢性炎症。中药治疗慢
性非细菌性前列腺炎由来已久。中医认为，慢性非
细菌性前列腺炎其主要病机病理是下焦湿热，久之
精室被扰，精关不固，封藏失职。本病不仅是一个简
单的局部病症，也是一种内分泌及免疫系统失调的
全身性疾病，清热解毒为治疗慢性非细菌性前列腺
DOI:10.16333/j.1001-6880.2014.11.032
炎的一大法则［1］。圆锥铁线莲(Clematis terniflora
DC．)属于铁线莲属(Clematis) ，分布于低海拔(≤
600 m)山区，作为中药及民间草药已有很长的历
史，在中医临床和民间常用做利尿通淋或祛风止痛
类药物，全草用于治疗慢性咽炎和慢性前列腺炎等，
有较高的药用价值［2］。本文研究圆锥铁线莲水提
取物对实验性慢性非细菌性前列腺炎的治疗作用，
并对其抗炎的作用机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1． 1 药品与试剂
圆锥铁线莲水提物浸膏，含生药 1． 18 g /g，由本
室自制。高剂量组称取 1． 7 g 浸膏，加 20 mL 纯净
水，给药体积 0． 2 mL /10g，灌胃给药每天 1 次，相当
于生药 2 g /kg 的剂量;低剂量为高剂量对半稀释，
即为 1 g /kg;阳性对照药物舍尼通购自南京美瑞制
药有限公司，批号 20100102;苯甲酸雌二醇购自上
海通用药业股份有限公司，批号 100702;兔抗大鼠
COX-2、iNOS、GAPDH 多克隆抗体、Ｒabbit ABC Stai-
ning System免疫组化试剂盒均购自 SANTA CＲUZ
公司;ELISA试剂盒购自 Bender Med Systems公司。
1． 2 实验动物与分组
SD大鼠，清洁级，雄性，250 ～ 300 g，购自浙江
省实验动物中心，实验动物合格证号:SCXK(浙)
2008-0033;50 只大鼠随机分成 5 组:正常对照组、模
型组、舍尼通组(60 mg /kg)、圆锥铁线莲水提物高剂量
组(2 g /kg)、圆锥铁线莲水提物低剂量组(1 g /kg)。
1． 3 苯甲酸雌二醇致去势大鼠慢性非细菌性前列
腺炎模型
SD 大鼠以戊巴比妥钠 50 mg /kg 腹腔注射麻
醉，仰卧位固定，剪除阴囊部被毛，在阴囊中间纵行
剪一约 l cm 长切口，将双侧睾丸分别挤出阴囊，在
睾丸根部结扎切断，止血后缝合皮下组织及皮肤，术
后连续 3d每只肌注青霉素 4 万单位，术后第 7 d 将
去势大鼠随机分组给药，同时每日皮下注射苯甲酸
雌二醇 0． 25 mg /kg 诱导去势大鼠慢性非细菌性前
列腺［3］。
1． 4 样本采集
末次给药后取血，断颈处死大鼠，剖取前列腺侧
叶，肉眼观察前列腺病变状态并称湿重，计算前列腺
指数;取前列腺按摩液 5 μL 加入 195 μL 白细胞稀
释液中，光学显微镜下计数白细胞总数;取一滴前列
腺液涂片，镜下观察卵磷脂小体密度，评分标准为:
卵磷脂小体满视野为 4 分，1 /2 视野为 3 分，1 /4 视
野为 2 分，低倍镜下仅见数个为 1 分;取一侧组织制
备成组织匀浆，分装并在-80 ℃冰箱冻存备用;取另
一侧组织置于 10%福尔马林溶液中固定，常规脱水
透明，制备石蜡切片，用于 HE 染色后于光学显微镜
下观察组织形态变化，或免疫组化法检测组织中
COX-2 及 iNOS的表达。
1． 5 ELISA法检测血清 IL-1β、TNF-α的含量
按照试剂盒说明书建议的实验流程操作，取大
鼠动脉血，室温自然凝固 20 min，3000 rpm × 20
min离心，收集上清，加入预包被的反应板中，37 ℃
孵育 2 h后洗涤，加入酶结合物，37 ℃孵育 2 h后洗
涤，加入底物溶液并室温反应 30 min 后以 Bio-Ｒad
公司 Model 680 型酶标仪检测波长 490 nm 时各反
应孔吸光度值。
1． 6 免疫组化法检测前列腺组织 COX-2 及 iNOS
的表达
按照试剂盒说明书建议的实验流程操作，采用
SABC法，将组织切片二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，
微波修复抗原 5 min，3%过氧化氢处理 20 min 以抑
制内源性过氧化物酶活性，正常羊血清孵育 20 min
封闭抗原以减少非特异性背景，一抗工作浓度 1:
150，4 ℃孵育过夜，生物素化二抗孵育 20 min，链霉
亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC 复合物)
孵育 20 min，三氨基联苯二胺(DAB)显色，自来水
冲洗终止反应，苏木素复染，脱水，透明，封片。O-
lympus光学显微镜下观察 COX-2 及 iNOS 的表达。
实验中用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对
照。
1． 7 Western blot 法检测前列腺组织 COX-2 及 iN-
OS的表达
前列腺组织匀浆解冻后于 4 ℃ 12000 rpm × 10
min离心，收集上清，考马氏亮蓝染色法测定总蛋白
质浓度;制备 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔加相
同浓度蛋白样品，应用 Bio-Ｒad Mini-PＲOTEAN电泳
仪电泳后通过 Bio-Ｒad电转移仪将蛋白转印到硝酸
纤维素滤膜;5%脱脂奶粉 TBS缓冲液封闭 2 h，4 ℃
下一抗孵育过夜后 TBS 洗膜 3 次，加入二抗后孵育
2 h，TBS 洗 5 次后加入 ECL 孵育 1 min，暗室中显
影、定影后曝光压片。
1． 8 数据统计
所有计量数据均表示为均数 ±标准差(x ± s) ，
采用 SPSS Statistics 17． 0 软件进行统计分析，组间比
2671 天然产物研究与开发 Vol. 26
较采用单因素方差分析，P ＜ 0． 05 认为统计学差异
有显著性;病理结果采用 Ｒidit法统计。
2 实验结果
2． 1 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎模型大
鼠前列腺液的影响
与正常对照组比较，模型组大鼠前列腺液中的
卵磷脂小体密度明显减少，白细胞数显著增加，呈现
出慢性前列腺炎的病理变化，表明造模成功。与模
型组比较，铁线莲 2 g /kg组卵磷脂小体密度显著增
加，白细胞数显著减少，表明炎症明显改善(表 1) ，
其治疗作用与阳性对照药物舍尼通组相当(P ＞
0. 05)。
表 1 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠前列腺液的影响(n = 10，x ± s)
Table 1 Effect of C． terniflora on prostatic fluid of chronic abacterial prostatitis rats (n = 10，x ± s)
组别
Group
剂量
Dose (g /kg)
侧叶前列腺湿重指数
Index of lateral lobe
prostate wet weight
白细胞数
Leukocyte number
(106 /mL)
卵磷脂小体密度
Lecithin density
正常对照 Control － 17． 5 ± 3． 6 9． 0 ± 2． 4 3． 5 ± 0． 5
模型 Model － 6． 7 ± 1． 3 # 51． 9 ± 15． 8 # 1． 0 ± 0． 8 #
舍尼通 Cer-nilton 0． 06 7． 3 ± 1． 3 38． 7 ± 12． 0 * 2． 4 ± 0． 7＊＊
铁线莲高剂量 Clematis-H 2 6． 9 ± 1． 2 39． 4 ± 8． 8 * 2． 2 ± 0． 9 ＊＊
铁线莲低剂量 Clematis-L 1 7． 1 ± 1． 1 50． 6 ± 13． 6 1． 5 ± 1． 2
注:与正常对照组比较，#P ＜ 0． 05;与模型组比较，* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01。
Note:Compare with control，#P ＜ 0． 05;Compare with model，* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01．
2． 2 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎模型大
鼠前列腺组织病理变化的影响
正常对照组大鼠侧叶前列腺腺体大小不一，腺
腔较大，腺腔内有大量粉红色的分泌物;模型组大鼠
侧叶前列腺间质中可见程度不等的淋巴细胞、单核
细胞等炎症细胞浸润和成纤维细胞增生，致间质明
显增宽，腺腔明显变小，腺腔内分泌物明显减少，甚
至无分泌物。与模型组比较，圆锥铁线莲 2 g /kg 组
大鼠侧叶前列腺间质中炎症细胞浸润和成纤维细胞
增生均显著减轻，腺腔扩大，腔内有较多分泌物，多
数前列腺形态结构基本正常(图 1) ，其治疗作用与
阳性对照药物舍尼通组相当;对前列腺组织炎症细
胞浸润、成纤维细胞增生、腺腔大小及腺腔内分泌物
多少四个指标评分并对分值进行 Ｒidit统计，结果显
示圆锥铁线莲对前列腺炎病理变化有显著的改善作
用(表 2、3) ，其治疗作用与舍尼通组相当(P ＞
0. 05)。
2． 3 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎模型大
鼠血清炎症因子表达的影响
与正常对照组比较，模型组 IL-1β、TNF-α 含量
均显著高于正常对照组，圆锥铁线莲 2 g /kg 组及 1
g /kg组均能明显减低血清中 IL-1β、TNF-α 含量(表
4)。
A:Control;B:Model;C:Cer-nilton;D:Clematis 2 g /kg;E:Clematis 1 g /kg
图 1 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠前列腺组织病理变化的影响
Fig. 1 The pathological changes in prostate tissue of chronic abacterial prostatitis rats treated by C． terniflora stained with HE under
the light microscope
3671Vol. 26 屠凌岚等:圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎的治疗作用及机制研究
表 2 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠前列腺组织病理学的影响(n = 10)
Table 2 Effect of C． terniflora on pathological changes in prostate tissue of chronic abacterial prostatitis rats (n = 10)
组别
Group
剂量
Dose (g /kg)
炎症细胞浸润和成纤维细胞增生
Infiltration of inflammatory
cells and proliferation of fibroblast
腺腔大小及腺腔内分泌物多少
The cavity size and secretions of glandular
－ + + + + + + － + + +
正常对照 Control － 5 5 0 0 5 5 0
模型 Model － 0 0 2 8 0 0 10
舍尼通 Cer-nilton 0． 06 2 4 3 1 2 6 2
铁线莲高剂量 Clematis-H 2 1 4 2 3 1 6 3
铁线莲低剂量 Clematis-L 1 0 4 2 4 0 6 4
注:表中所列为发生该等级病理变化的动物数。
Note:Number of animals listed in the table for the occurrence of pathological changes in the level．
表 3 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠前列腺组织病理学影响 Ｒidit统计结果
Table 3 Ｒesults of Ｒidit Statistics for the pathological changes in prostate tissue of chronic abacterial prostatitis rats treated with C． ter-
niflora
组别
Group
剂量
Dose (g /kg)
炎症细胞浸润和成纤维细胞增生
Infiltration of inflammatory cells
and proliferation of fibroblast
腺腔大小及腺腔内分泌物多少
The cavity size and secretions of glandular
Ｒidit均值
Ｒidit Mean
95%可信限
95% Confidence
Intervals
P值
P Value
Ｒidit均值
Ｒidit Mean
95%可信限
95% Confidence
Intervals
P值
P Value
正常对照 Control － 1． 000 0． 817 ～ 1． 183 ＜ 0． 05 1． 000 0． 817 ～ 1． 183 ＜ 0． 05
模型 Model － 0． 500 0． 317 ～ 0． 683 － 0． 500 0． 317 ～ 0． 683 －
舍尼通 Cer-nilton 0． 06 0． 910 0． 727 ～ 1． 093 ＜ 0． 05 0． 900 0． 717 ～ 1． 083 ＜ 0． 05
铁线莲高剂量 Clematis-H 2 0． 800 0． 617 ～ 0． 983 ＜ 0． 05 0． 850 0． 667 ～ 1． 033 ＜ 0． 05
铁线莲低剂量 Clematis-L 1 0． 740 0． 557 ～ 0． 923 ＜ 0． 05 0． 800 0． 617 ～ 0． 983 ＜ 0． 05
表 4 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠血清炎症因子表达的影响(n = 10，x ± s)
Table 4 Effect of C． terniflora on serum inflammatory cytokines of chronic abacterial prostatitis rats (n = 10，x ± s)
组别
Group
剂量
Dose (g /kg) IL-1β (pg /mL) TNF-α (pg /mL)
正常对照 Control － 42． 0 ± 10． 8 60． 8 ± 14． 8
模型 Model － 75． 1 ± 17． 0 # 86． 3 ± 20． 3 #
舍尼通 Cer-nilton 0． 06 41． 0 ± 16． 6 ＊＊ 61． 0 ± 19． 5 ＊＊
铁线莲高剂量 Clematis-H 2 48． 1 ± 16． 2 ＊＊ 59． 4 ± 19． 4 ＊＊
铁线莲低剂量 Clematis-L 1 53． 7 ± 18． 7 * 70． 6 ± 16． 6 *
注:与正常对照组比较，#P ＜ 0． 01;与模型组比较，* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01。
Note:Compare with control，#P ＜ 0． 01;Compare with model，* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01．
2． 4 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎大鼠前
列腺组织内 iNOS及 COX-2 表达的影响
免疫组化实验检测结果显示，正常对照组大鼠
前列腺组织内 iNOS 和 COX-2 表达均为阴性;模型
组前列腺上皮细胞胞浆内 iNOS 和 COX-2 呈棕褐色
阳性表达;圆锥铁线莲 2 g /kg 组细胞胞浆呈浅棕黄
色，iNOS和 COX-2 均呈弱阳性表达，与模型组相比
表达明显减弱(图 2、3)。
Western Blot 检测结果显示，与正常对照组相
比，模型组大鼠前列腺组织 COX-2 和 iNOS 的表达
显著增强;与模型组相比，圆锥铁线莲 2 g /kg 和 1
g /kg组 COX-2 和 iNOS的表达显著减少(图 4)。
4671 天然产物研究与开发 Vol. 26
A:Control;B:Model;C:Cer-nilton;D:Clematis 2 g /kg;E:Clematis 1 g /kg (Bar = 50 μm)
图 2 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠前列腺组织 iNOS表达的影响
Fig. 2 The iNOS level in prostate tissue of chronic abacterial prostatitis rats treated with C． terniflora
A:Control;B:Model;C:Cer-nilton;D:Clematis 2 g /kg;E:Clematis 1 g /kg (Bar = 50 μm)
图 3 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠前列腺组织 COX-2 表达的影响
Fig. 3 The COX-2 level in prostate tissue of chronic abacterial prostatitis rats treated with C． terniflora
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
iN
OS
(P
er
ce
nt
%of
%β
鄄a
ct
in
/%
)
CO
X 鄄
2
(P
er
ce
nt
%of
%β
鄄a
ct
in
/%
)
COX鄄2
β鄄actinβ鄄actin
iNOS
Sh
am
M
od
el
SN
T
2%
g/
kg
1%
g/
kg
铁线莲
Sh
am
M
od
el
SN
T
2%
g/
kg
1%
g/
kg
铁线莲
图 4 圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠前列腺组织 iNOS和 COX-2 表达的影响
Fig. 4 The iNOS and COX-2 level in prostate tissue of chronic abacterial prostatitis rats treated with C． terniflora
3 讨论
实验结果证明圆锥铁线莲水提取物对苯甲酸雌
二醇诱导的去势大鼠慢性非细菌性前列腺炎具有良
好的治疗作用，同时发现血清炎症细胞因子水平、前
列腺组织炎症相关因子 COX-2 和 iNOS 的表达均显
著降低。
多项研究表明大鼠体内类固醇激素水平的变化
5671Vol. 26 屠凌岚等:圆锥铁线莲对慢性非细菌性前列腺炎的治疗作用及机制研究
是引起慢性非细菌性前列腺炎的一个重要因素［4-6］。
Seethalakshmi等研究证实注射 17β-雌二醇可诱导大
鼠前列腺炎症，表现为淋巴细胞浸润、肥大细胞浸润
和组胺释放肽增加，据此推断这种方法诱导的前列
腺炎是由免疫细胞介导的自身免疫性的炎症，其病
理表现非常接近于临床慢性非细菌性前列腺炎［7］。
本实验参考了这种方法来构建慢性非细菌性前列腺
炎模型，实验中模型组白细胞明显升高，卵磷脂小体
明显减少，病理呈现慢性炎症表现，最大程度模拟临
床疾病的特点。
细胞因子是免疫和炎症细胞产生的调节局部和
全身免疫反应的小分子蛋白，其主要作用是通过信
号转导调节机体的免疫反应，决定炎症反应的类型
和持续时间。现已发现细胞因子与某些免疫性疾
病、感染性疾病有关。前炎症细胞因子在组织的炎
症反应过程中起促进作用，而抗炎症细胞因子可抑
制炎症反应及促进组织的修复和再生。两者的平衡
将影响组织创伤和炎症的结局［8］。前列腺组织的
炎症是以细胞因子为中介产生的连锁反应。
本实验中圆锥铁线莲能缓解炎症引起的促炎性
细胞因子的增高，提示其抗炎的机理可能是通过抑
制 IL-1β，TNF-α等细胞因子的产生和分泌，降低其
表达水平，从而抑制免疫过反应，减轻由此引起的炎
症损伤;同时抑制 COX-2 以及 iNOS 的表达，避免局
部产生过量的 PG 和 NO，减轻局部炎性损伤，达到
治疗的目的。结果提示圆锥铁线莲具有抑制雌激素
诱导的炎症的作用可能是由于其具有一定的免疫调
节作用，从而抑制了由于激素异常变化引起的免疫
性炎症。而这正验证民间认为这种植物具有祛风除
湿，凉血消肿的功效。
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