全 文 ：　收稿日期:2006-12-25
　△佳木斯大学科研基金资助项目(S15)　　*皖南医学院药学系
　　文章编号:1004-4337(2007)04-0447-03　　　中图分类号:R917　　　文献标识码:A 方法评介
递归渐进光谱投影比较中药材铁线莲色谱指纹特征△
方洪壮　　邹纯才* 　　宗希明
(佳木斯大学化学与药学　佳木斯 154007)
摘　要:　运用递归渐进光谱投影法 ,探索中药材东北铁线莲与棉团铁线莲石油醚提取物的色谱指纹特征化学成分的异同。指
纹特征数据由高效液相色谱法获得 ,流动相为乙腈 - 1‰磷酸水溶液梯度洗脱 ,流速 1. 0 m l /min ,柱温 20 ℃,光谱记录范围为 200～
400 nm。经比较 ,东北铁线莲和棉团铁线莲的色谱指纹特征中 ,至少分别有 8和 6种单独的化学成分存在 ,两者的共有的化学成分有
14种。
关键词:　递归渐进光谱投影法;　东北铁线莲;　棉团铁线莲;　指纹特征
　　借助化学计量学方法分析色谱光谱二维数据中化学成分
的异同 ,是中药指纹图谱研究的重要内容 , 已有光谱相关色
谱 、窗口目标检验因子分析 、交替移动窗口因子分析等方法成
功用于多种中药化学成分比较分析[ 1 ～ 3] 。 毛莨科植物东北铁
线莲(Clematis manshurica Rupr)和棉团铁线莲(Clematis hex-
apetala Pall)的干燥根及根茎被收载在中国药典一部中的威灵
仙药材项下[ 4] ,近年来发现具有多种药理作用[5] 。中药威灵
仙的指纹图谱研究 ,现仅涉及其挥发油部分[ 6] ,揭示威灵仙内
在化学成分本质的差异 , 对相关的药学深入研究与临床使用
有重要的意义。递归渐进光谱投影是新近提出的一种化学计
量学多元分辨方法 , 可用于二维色谱数据重叠峰浓度窗口的
确认[ 7] 。本研究将递归渐进光谱投影法用于不同色谱指纹特
征的化学成分的异同的分析 , 比较东北铁线莲和棉团铁线莲
石油醚提取物的指纹图谱 H PLC-DAD 二维数据 , 发现东北铁
线莲和棉团铁线莲石油醚提取部分中共有的化学成分有 14
种 ,两者单独的化学成分分别有 8 种和 6 种 , 东北铁线莲中较
棉团铁线莲含有较多的齐墩果酸。实验结果为进步确定两种
药材石油醚提取物中的化学成分及相关的药学研究奠定基
础。
1　方法原理
设 A 和B 分别为经色谱-光谱联用采集的两种中药样品
的色谱指纹图谱的数据矩阵 , 矩阵的大小均为 M ×N 阶 , 它
们行的方向表征了色谱的流出信息(M 个流出时间点), 列的
方向表征了光谱信息(N 个吸收波长)。选择 A 中某一指纹特
征峰的测定数据矩阵片断 X , 用渐近因子分析方法分别前向
计算和反向计算获得其秩图[8] ,根据秩图给出的组分数 m , 在
A 中设定 m 个前向和反向信息区 。从第一信息区 , 选取一列
数据作为代表性光谱 s1 ,按设定的窗口尺寸 w ,从样品 B 中数
据矩阵片断Y 自色谱起始时间取 w 行子矩阵Y 1 , 计算投影残
差 r11 :
r11 =s1 T(I -Y 1Y 1+)s1 (1)
其中 I 为 N 阶单位方阵 ,“ T”表示矢量的转置 , “ +”表示矩阵
的广义逆;移动 1个色谱时间点窗口 ,计算投影残差 r’ 2 ;不断
移动窗口 , 运算至 Y 的色谱终点 , 得一系列投影残差 r11 , r12 ,
… , r1i , … , r1n 。由第二信息区 ,选取代表性光谱 s2 , 对Y 计算一
系列投影残差 r2i =s2T( I -Y 2Y 2 +)s2 。其中矩阵 Y 2 由样品数
据Y 子矩阵 Y 1 和光谱 s1 构成:
Y 2 =[ Y 1 , s1] (2)
对每一信息区 j , 选取代表性光谱 sj , 按Y j =[Y 1 , s j - 1] 计算一
系列投影残差 r ji =s j T(I - Y jY j +)sj 。 以得到的 m 个投影残
差矢量对n 个保留时间作图 , 判定两样品中化学成分的异同。
当在某一保留时间 i处 ,样品 B 中含有样品 A 中的化学成分 ,
r ji 的数值必将接近于零 ,反之 ,在该保留时间点样品 B 中缺少
样品 A 中的化学成分。同理 ,以样品 B 为基准进行因子分析 ,
选取代表性光谱 , 对样品 A 计算投影残差 ,可判定 A 中有无B
中的化学成分。
2　实验部分
2. 1　仪器与试剂
高效液相色谱仪:H P1100 型 , 包括 Agilent1100 四元泵 ,
H P1100 二极管阵列检测器 , HP 色谱化学工作站(美国安捷
伦科技公司)。东北铁线莲 、棉团铁线莲:2005 年 9 月采自伊
春市亮子河林区 , 按中国药典 2005 版一部相关项下鉴别为药
典规定的相应品种。齐墩果酸对照品(110709-200304)购自中
国药品生物制品检定所。 乙腈 、甲醇为色谱纯;无水乙醇 、盐
酸与石油醚(60～ 90℃)为分析纯。
2. 2　样品制备
2. 2. 1　对照品溶液　取齐墩果酸对照品约 10mg , 精密称定 ,
置 10ml容量瓶中 , 加甲醇适量使其溶解 , 加甲醇至刻度。制
成 1mg /ml的齐墩果酸对照品溶液。
2. 2. 2　供试品溶液　东北铁线莲及棉团铁线莲的干燥根和
447
数理医药学杂志 2007 年第 20 卷第 4 期
根茎 ,经粉碎后 , 分别过 5 号(180±7. 6μm)药筛。分别取药材
粉末 1g , 加乙醇 50ml , 加热回流 2h , 滤过 , 滤液浓缩至约
20ml ,加盐酸 3m l , 加热回流 1h , 加水 10ml , 放冷 , 加石油醚振
摇提取 3 次 ,石油醚用量分别为 20ml 、10ml、10ml , 蒸干石油
醚 ,残渣用 1ml甲醇溶解 , 经 0. 45 μm 油性微孔滤膜过滤 , 制
成东北铁线莲及棉团铁线莲的供试品溶液。
2. 2. 3　空白溶液　取乙醇 50ml ,同供试品溶液制备方法 , 加
热回流提取 ,石油醚残渣加甲醇 1ml溶解制得。
2. 3　指纹图谱获取
2. 3. 1　色谱条件　色谱柱:Eclipse XDB-C18 柱(250 mm ×
4. 0mm ID , 5 μm), 保护柱:Zorbax SB-C18 柱(12. 5mm ×
4. 6mm ID , 5μm);流动相:乙腈(A)-1‰磷酸水溶液(B)作梯
度洗脱 , 0min , 25%A-75%B , 保持 5min;30min , 85%A-15%B ,
保持 10min;45min , 100%A , 保持 15min。 流速:1. 0ml /min;
柱温:20 ℃;检测波长与参比波长分别为 210nm 与 400nm , 相
应谱带宽分别为 4nm 与 50nm;进样量为 20μl。
2. 3. 2　指纹图谱　取齐墩果酸对照品溶液 、空白溶液 、东北
铁线莲及棉团铁线莲供试液 , 分别按 2. 3. 1 项下的色谱条件
进行检测。根据齐墩果酸对照品色谱与空白溶液的色谱确定
齐墩果酸与空白峰 ,见图 1a和图 1b。选取两种铁线莲色谱中
的齐墩果酸色谱峰为参照物峰 , 结合空白色谱峰 , 按国家药品
监督管理局的中药注射剂色谱指纹图谱研究技术要求(暂行)
规定的检测方法与相关内容制备指纹图谱 , 结果分别见图 2a
和 2b。
2. 4　数据分析
在色谱仪上间隔 2 nm 记录采集东北铁线莲与棉团铁线
莲色谱光谱二维数据 ,并选取各色谱中与参照物峰峰面积比
大于 2%的色谱峰作为比较分析的目标峰。以棉团铁线莲作
为被比较的样品 ,按方法原理 , 从东北铁线莲的色谱光谱数据
中的相应信息区内分别选取光谱 , 计算棉团铁线莲的数据投
影残差并绘图 ,判定相同的化学成分是否存在以及在色谱指
纹图谱中的位置。将东北铁线莲作为被比较的样品 , 比较计
算 、判定有无棉团铁线莲的化学成分 ,从而完成色谱指纹图谱
化学成分存在与否的判别。
s-齐墩果酸　　　1 , 2-空白色谱峰
图 1　齐墩果酸对照品 (a)和空白溶液(b)色谱图
图 2　东北铁线莲(a)与棉团铁线莲(b)的色谱指纹图
3　结果与讨论
表 1　东北铁线莲与棉团铁线莲的化学成分保留时间(min)
棉团铁线莲
目标峰数 保留时间
东北铁线莲
目标峰数 保留时间 共有成分数
1 12. 65 1 12. 89 1
2 15. 20 2 15. 12 2
3 15. 98 3 15. 94 3
4 17. 63 4 17. 63 4
5 19. 12 5 19. 08 5
6 23. 12 6 23. 08 6
7 25. 89 7 25. 84 7
No 8 26. 52
No 9 27. 95
8 30. 88 No
9 32. 05 No
No 10 32. 37
10 35. 47 11 35. 40 8
No 12 38. 94
No 13 40. 83
11 40. 93 No
12 43. 22 14 43. 61 9
13 43. 80 No
14 45. 64 15 45. 54 10
15 46. 82 No
No 16 48. 36
16 48. 46 No
No 17 49. 00
17 49. 97 18 49. 83 11
18 50. 66 19 50. 51 12
No 20 51. 68
19 53. 45 21 53. 13 13
20 53. 96 22 53. 74 14
448
Journal o f Mathematical Medicine Vo l. 20　　 No . 4　　 2007
3. 1　两种铁线莲的比较
交替比较计算分析东北铁线莲与棉团铁线莲色谱-光谱
数据 ,得到两色谱指纹图谱中各化学成分和峰位结果如表 1。
由表1 可知 , 东北铁线莲及棉团铁线莲分别有 22 及 20 个化学
成分 ,至少有 8 个化学成分存在于东北铁线莲中 , 而在棉团铁
线莲色谱指纹图谱中未发现 , 棉团铁线莲至少有 6 个化学成
分在东北铁线莲中未发现。色谱指纹图中东北铁线莲 43. 61
min 与棉团铁线莲 43. 22 min 处的色谱峰为齐墩果酸色谱峰。
与棉团铁线莲比较 ,齐墩果酸在东北铁线莲中的含量较高。
3. 2　空白溶液色谱峰
空白溶液的色谱图 1b 显示 , 空白溶液在 35. 20min 与
52. 30min处有两个不可忽略的色谱峰。 另由图 2 可知 , 东北
铁线莲及棉团铁线莲的色谱在相对应的保留时间处 , 均有一
定强度的色谱峰。两种铁线莲色谱光谱所涉及的空白色谱峰
处数据秩图表明 , 第 1 与第 2 个色谱峰的成分数分别为 1 和
2。分别用空白溶液峰 1 和峰 2 的光谱 ,对两种铁线莲涉及的
色谱峰处的数据作窗口移动正交投影 、计算投影残差 , 结果得
到东北铁线莲与棉团铁线莲在保留时间 35. 18 min 及
52. 24min处色谱峰的光谱 , 与空白溶液色谱峰的光谱相同 , 可
断定为是由样品制备的溶剂而引入 , 而在保留时间东北铁线
莲与棉团铁线莲 52. 32、52. 54min 处重叠色谱峰中有空白溶
剂峰 2。
3. 3　化学成分的比较
实验结果表明 ,递归渐进光谱投影不仅可用于二维色谱
数据重叠峰浓度窗口的确认 , 而且可用于不同色谱指纹特征
的化学成分异同的比较分析。东北铁线莲与棉团铁线莲含有
较多的相同化学成分 ,这些成分与威灵仙药理作用的联系 , 需
要深入的相关药学研究加以证实。另外 , 由于实验中色谱特
征的光谱数据为紫外光谱 , 仅能在一定的程度上判定不同色
谱指纹特征的化学成分的异同 , 无法确定化学成分归属。递
归渐进光谱投影法及本实验的色谱条件可供液-质的二维数
据的获取 ,以便分析确认色谱指纹特征的化学结构。东北铁
线莲与棉团铁线莲色谱指纹特征可用于相关药材的质量控
制。
参　考　文　献
1　Li BY , Hu Y , Liang YZ , et al. Spect ral correlat ive chromatog ra-
phy and it s applicat ion to analysi s of chromatograp hic f ingerprint s
of herbal m edicin es. J Sep S ci , 2004 , 27:581～ 588.
2　Zeng ZD , Liang YZ , Xu CJ. C om paring chemical f ingerprint s of
herbal medicines u sing modif ied window target-t es ting factor analy-
sis. Anal Bioanal C hem , 2005 , 381:913～ 924.
3　Zeng ZD , Liang YZ , Wang YL , et al. Altern at ive moving w indow
factor an aly si s for comparison analysi s betw een com plex ch rom ato-
graphic data. J Ch rom atogr A ,2006 , 1107:273～ 285.
4　国家药典委员会. 中华人民共和国药典 , 2005版一部. 北京:化学
工业出版社 ,2005:175.
5　王亚 ,张彦 ,孙玉军. 中药威灵仙研究. 中药材 , 2006 , 29(5):513～
515.
6　曾映旭 ,赵晨曦 ,梁逸曾 ,等. 中药威灵仙的化学模式识别研究. 计
算机与应用化学 , 2006 , 23(9):825～ 828.
7　Chen ZP , Morri s J , Mart in E , et al. Recu rsive evolving spect ral
projection for revealing the concent ration w indow of overlapping
peaks in tw o-w ay chromatog raphic experiments. Chemomet r In tel
Lab sy st , 2004 , 72:9～ 19.
8　Maeder M , Zuberb ueh ler AD. T he res olut ion of overlapping chro-
matographic peaks by evolving factor analysis. An al C him Actor ,
1986 , 181:287～ 291.
Comparison Analysis of Chromatographic Profiles of Clematis Radix using
Recursive Evolving Spectral Projection
Fang Hong zhuang , e t al
(College of Chem istry and Pharmacy J iamusi Universi ty , J iamusi 154007)
Abstract　To find out the similarit ies and dif ference s o f chemical components betw een the chromato-
g raphic profiles of benzinum purif icatum ex tract f rom Clematis manshurica Rupr and Clematis hexapetala
Pall , tw o t radit ional Chinese medicine herbs , by recursive evo lving spect ral project ion method. The chroma-
to graphic finge rprint data w ere acquired by high perfo rmance liquid chromatog raphy w ith acetoni t rile-1‰
phosphoric acid g radient elution mobi le phase , flow rate 1. 0 m l m/ in , column temperature of 20 ℃, and the
200 ～ 400 nm of spect rum reco rded w aveleng th range. The comparison resul ts show ed that at lest 8 and 6
chemical components present alone in chromato graphy fingerprints of Clematis manshurica Rupr and Clemat is
hexapetala Pall respectively , whi le 14 common components are pre sent in both samples.
Key words　 recursive evolving spect ral projection method;Clemat is manshurica Rupr;Clematis hexap-
etala Pall;profiles
449
数理医药学杂志 2007 年第 20 卷第 4 期