全 文 ：短芒大麦 DREB2基因的克隆及
其转基因烟草的鉴定
王呈玉1 , 2 , 张明哲2 , 万　生生2 , 李彦舫2
(1.吉林农业大学资源与环境学院 ,长春 130118;2.吉林大学农学部植物科学学院 ,长春 130062)
摘　要:以短芒大麦为材料 , 应用 RT-PCR技术扩增获得 792 bp 的 DREB2 基因 , 构建了重组植物表达载体
pBI-DREB2。通过农杆菌转化法将其导入烟草 , 并利用 PCR、PCR-Southern 和 RT-PCR技术对获得的 20 株卡
那霉素阳性转基因烟草进行分子鉴定。结果表明:短芒大麦 DREB2基因已整合到烟草基因组中 ,并能在转录
水平上表达。
关键词:短芒大麦;DREB2;基因克隆;转基因
中图分类号:Q785　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2007)06-0643-04
Clone of HbDREB2 Gene of Hordeum brevisubulatum
and Identification of Its Transgenic Tobaccos
WANG Cheng-yu1, 2 , ZHANGMing-zhe2 , WAN Sheng2 , LI Yan-fang2
(1.College of Resources and Environmental Sciences , J ilin Agricultural University , Changchun 130118;
2.College of Plant Science , Jilin University , Changchun 130062 , China)
Abstract:We constructed a recombinant botany expression vector of DREB2 gene isolated from Hordeum
brevisubulatum which was 792 bp , by RT -PCR technique and identified 20 of kan resistant positive
transgenic tobaccos by molecular biology methode of PCR , PCR-Sourthem and RT -PCR.These results
indicated that HbDREB2 gene has integrated into the tobacco genome and transcribed successfully
Key words:Hordeum brevisubulatum;DREB2;gene cloning;transgene
　　DREB(Dehydration responsive element binding
protein)转录因子(含 AP2/EREBP 结构域)是与
DRE(Dehydration responsive element)顺式作用元件
相结合 、调控对干旱 、高盐 、低温等逆境应答相关
基因表达的蛋白质[ 1-2] 。由于植物的抗逆性是由
复杂的多基因控制的数量性状 ,通过导入单一的
功能基因虽然在一定程度上能提高植物的抗逆
性 ,但总的来说效果不明显[ 3-4] ,用干旱 、高盐及低
温诱导的 rd29A基因进行转化 ,虽然也能使转基
因植株的干旱 、高盐及低温耐性得到增强[ 5-6] ,但
不及利用 DREB 转录因子基因的转化效果明
显[ 5-8] 。
短芒大麦[ Hordeum brevisubulatum(Trin)Link]
是一类耐盐性较强 、营养价值较高 、适口性较好的
牧草 。本研究根据Genbank中已经注册的短芒大
麦DREB2基因 ,从短芒大麦中克隆获得该基因 ,首
次构建其重组植物表达载体 pBI-DREB2 ,并对其
转基因烟草阳性植株进行分子鉴定 ,为下一步分
析转基因烟草生理生化特性 ,获得抗旱 、耐盐性较
强的植物奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
以苗 龄 2 周 的 短 芒 大 麦 为 材 料 , 用

通讯作者
基金项目:国家自然科学基金项目(30471229)
作者简介:王呈玉(1975-),女 ,博士 ,讲师 ,主要从事微生物学教学和分子生物学研究工作。
收稿日期:2007-03-30　　修回日期:2007-07-16
吉林农业大学学报　2007 ,29(6):643 ～ 646 http:// xuebaojlaueducn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vipsinacom
400 mmol/L NaCl进行盐胁迫处理 8 h。剪取叶片
于-80 ℃条件下备用 。
大肠杆菌 DH5α、农杆菌 EH105 、植物表达载
体pBI121 、烟草品种(Nicotiana tabacum Var W38)
均为吉林大学农学部植物科学学院基础生物系实
验室保存 。
根据 Genbank 中短芒大麦 DREB 2 基因
(AY728807)序列设计 PCR扩增特异引物和35S-
up ,引物中的下划线部分分别表示酶切位点
Xba Ⅰ(DREB2-1)和 Sac Ⅰ(DREB2-2)。引物由上
海生工生物公司合成 ,DREB2-1:5′-ATTCTAGAGC-
CTTGATGACCAGGAAG-3′; DR EB2-2: 5′-AT-
GAGCTCAGCTA GGACCCTAATATGAGAA-3′;35S-
up: 5′-TGATATCTCCACTGACGTAAGGGATG-3′。
Actin 基因扩增引物序列 Actin-up :5′-CTAC-
CTTGATCTTCATGCTG-3′;Actin-down:5′-AGCAA
CTGGGATGACATGGAG-3′。
1.2　方法
1.2.1　短芒大麦 DREB2基因的扩增和系统进化
分析　按 Trizol试剂盒使用说明提取盐胁迫 8 h
的短芒大麦总 RNA 。以提取的短芒大麦总 RNA
为模板 ,常规方法进行反转录[ ImProm-Ⅱ(tm)反
转录试剂盒 , Promega] , 并以反转录产物为模板 ,
以DREB2-1和 DREB2-2 为引物按如下条件进行
PCR反应:94 ℃预变性 4 min;94 ℃ 30 s , 57 ℃
30 s ,72 ℃50 s ,35个循环;72 ℃延伸 10min 。反
应结束后用 1 %的琼脂糖凝胶电泳对 PCR产物
进行鉴定 。PCR产物的回收 、连接 、转化 、PCR及
酶切鉴定和测序均按常规方法操作 。
1.2.2　短芒大麦 DREB2基因植物表达载体的构
建　用限制性内切酶 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ分别对测序
结果正确的短芒大麦 DREB2 基因和植物表达载
体pBI121进行双酶切 ,回收基因片段。按如下体
系进行连接:T4DNA连接酶(5 U/μL)10 μL ,反应
缓冲液25μL ,回收的基因片段 75μL ,回收的载体
片段 140μL ,加灭菌水至 250 μL。16 ℃连接反应
过夜 。将构建正确的植物表达载体对农杆菌进行
转化 ,并进行 PCR和酶切鉴定 。
1.2.3　农杆菌介导的烟草转化及转基因烟草的
分子鉴定　利用农杆菌介导法转化烟草叶盘[ 9] 。
最后 ,以地高辛标记的短芒大麦 DREB2 基因的
cDNA片段作为探针 ,对本试验获得的 20株卡那
霉素阳性植株进行分子检测。
2　结果与分析
2.1　总 RNA的提取
Trizol法提取短芒大麦幼苗的总 RNA ,琼脂糖
凝胶电泳结果见图 1。
图 1　短芒大麦叶片总 RNA电泳图谱
Fig.1. The electrophoresis result of total RNA in
leaves of H.brevisubulatum
　　由图 1可以看出 ,所提取的总 RNA有明显的
完整的3条电泳带 ,从上到下分别为 28 S ,18 S和
5 S ,表明 RNA没有降解 ,完全符合反转录要求 。
2.2　短芒大麦 DREB2基因扩增
RT-PCR扩增结果是获得 1条 792 bp的核
苷酸链 ,测序结果与 Genbank 注册的短芒大麦
DREB 2基因只有 1个碱基发生突变 ,但该碱基所
编码的氨基酸残基并未改变。因此 ,认为所获得
的792 bp的核苷酸链即为短芒大麦 DREB 2基因 ,
其 RT-PCR扩增结果见图 2。
M.DL2000 Marker;1-2.RT-PCR扩增结果 Results of RT-
PCR
图 2　短芒大麦 DREB2基因 RT-PCR扩增结果
Fig. 2.RT-PCR amplification of DREB2 from
H.brevisubulatum
2.3　植物表达载体 pBI-DREB2的构建和鉴定
用限制性内切酶 Xba Ⅰ 、Sac Ⅰ分别对连接到
T-载体上的短芒大麦 DREB2基因和 pBI121植物
表达载体进行双酶切 ,将酶切获得的短芒大麦
DREB2基因和 pBI121 植物表达载体的载体片段
644　　　吉林农业大学学报　2007年 12月
Journal of J ilin Agricultural University 2007 , December
回收 ,并进行连接 。将构建好的表达载体利用农
杆菌冻 融的 方法转 化农 杆菌 EHA105。以
CaMV35S启动子的下游序列设计了 1 个 35S-up
引物作为 PCR扩增上游引物 ,以短芒大麦DREB2-
2为下游引物进行PCR扩增鉴定 ,扩增结果为 880
bp(图 3),与预期结果一致 。提取阳性质粒 ,并用
限制性内切酶 Xba Ⅰ 、Sac Ⅰ进行双酶切鉴定 ,切
下2条分别与短芒大麦 DREB2 和切除Gus基因
的 pBI121表达载体大小相符的目的片段 ,结果见
图 4。PCR 和酶切鉴定结果表明 , 短芒大麦
DREB 2基因已经构建到 CaMV35S启动子的下游。
M.DL2000 Marker;1～ 4.阳性质粒 Positive plasmids
图 3　pBI-DREB2表达载体的 PCR鉴定
Fig.3.Identification of pBI-DREB2 by PCR
M.λ-Hind Ⅲ digest Marker;1.阳性质粒 Positive plasmid
图 4　pBI-DREB2表达载体的 Xba Ⅰ 和 Sac Ⅰ双酶
切鉴定
Fig.4.Identification of pBI-DREB2 by restriction en-
zyme digestion
2.4　转基因烟草的 PCR 和 PCR-Southern 检
测
以卡那霉素阳性植株的叶片为材料 ,小量提
取基因组 DNA ,然后以此 DNA为模板 ,以 DREB2-
2和 35S-up作为引物进行 PCR扩增 ,结果显示用
引物 DREB2-2与 35S-up从转基因烟草 DNA中扩
增得到的DNA片段与阳性对照相同 ,约为880 bp ,
阴性对照(野生型烟草)没有该扩增产物(图 5-
A)。为了进一步验证该结果 ,将部分转基因烟草
的PCR 产物经 Southern 吸印转至尼龙膜上 , 以
Digoxigenin标记的短芒大麦 DREB 2 cDNA为探针
对部分 PCR阳性植株进行 PCR-Southern 检测 ,
结果见图 5-B ,扩增产物均与探针产生杂交信
号。这一结果表明短芒大麦 DREB2 的 cDNA 可
能已整合到转基因烟草基因组 DNA中。
PCK.质粒 pBI-DREB2 Plasmid of pBI-DREB2;NCK.野生型
Wild-type tobacco;2～ 20.部分转基因烟草Partial transgenic to-
baccos
图 5　转基因烟草的 PCR 及 PCR-Southern检测结
果
Fig.5.PCR and PCR southern analysis was used to
determine the presence of the transgene in to-
baccos
2.5　转基因烟草的 RT-PCR检测
为了检测转基因烟草内短芒大麦 DREB2基
因是否能在转录水平表达 ,我们分别以 4个不同
转基因植株的叶片为材料提取 RNA ,反转录后首
先用 Actin 基因的 2 个引物进行 PCR扩增 ,半定
量 cDNA模板 ,然后用短芒大麦 DREB 2基因的特
异引物扩增 。结果表明整合到烟草核基因组
DNA上的短芒大麦 DREB2基因均能够在转录水
平表达(图 6)。
ck.野生型烟草 Wild-type tobacco;2 ～ 15不同的转基因植株
Different transgenic tobaccos;Actin 内标 Internal control
图 6　转基因烟草中短芒大麦 DREB2的 RT-PCR
分析
Fig.6.RT-PCR analysis of the HbDREB2 gene ex-
pression at transcriptional level in transformants
3　结　论
本研究成功克隆了短芒大麦 DREB2基因 ,该
基因与单子叶植物的 DREB2 类转录因子的亲源
关系较近 ,与水稻 OsDREB 2A[ 2] 、大麦 HvDRF1[ 11]
645王呈玉等:短芒大麦DREB2基因的克隆及其转基因烟草的鉴定
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
一样是受盐胁迫诱导表达的基因。将获得的短芒
大麦 DREB2基因克隆到植物表达载体 pBI121 ,成
功构建了高效表达重组子 pBI -DREB2。通过农
杆菌转化法将其导入烟草 ,阳性烟草植株分子鉴
定结果表明 ,短芒大麦 DREB 2基因的 cDNA已整
合到转基因烟草基因组 DNA中 ,并能够在转录水
平表达。
众所周知 ,多数重要的农作物为禾本科植物 ,
如水稻 、小麦 、大麦及玉米等 ,若将从双子叶植物
中分离的基因用于单子叶植物的品质改良 ,极有
可能由于基因的异源表达而导致许多问题产生。
而短芒大麦 DREB2基因来源于同大多数农作物
亲缘关系最近的禾本科植物短芒大麦 ,利用该基
因改良禾本科类农作物的耐盐和耐干旱性状将具
有更大的优越性 。
因此 ,进一步分析短芒大麦 DREB 2转基因烟
草的生理生化特性 ,探索高盐或干旱胁迫信号传
导途径 ,明确干旱 、高盐等逆境应答相关基因表达
的调控机制 ,进而培育抗旱 、耐盐性较强的农作物
将是我们下一步研究的主要内容。
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(上接第 642页)
3.3　样本量对条斑紫菜叶状体 DNA提取的影响
试验中观察到 ,不论是用 SDS法还是用 LiCl
法提取条斑紫菜 DNA ,小样本量(0.1 g)的效果都
没有大样本量(0.8 g)效果好 。在进行遗传转化
时转化体的鉴定常因材料少 、群体小而要求用小
样本量方法提取 DNA ,目前尚未见到小样本量提
取紫菜 DNA的较成熟方法的报道。本试验的结
果表明 ,在用小样本量提取紫菜DNA时 SDS 法效
果好于 LiCl法 。
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