全 文 ：滇重楼内生真菌转化万古霉素的研究
宣 群 １），潘红梅 ２）
（1） 昆明医科大学微生物学暨免疫学教研室；２） 昆明医科大学营养学系，云南昆明 650500）
［摘要］目的 利用滇重楼内生真菌生物转化万古霉素．方法 分离滇重楼内生真菌并筛查它们的生物转化
能力．鉴定具有转化能力的内生真菌．结果 有2株内生真菌可以转化万古霉素.经鉴定为产黄青霉和Fusarium
nematophilum．菌株 G01 和 G03 在添加万古霉素的液体培养基中培养 6 d 后，HPLC（High Performance Liquid
Chromatography） 分析发现，万古霉素的峰面积下降并有新吸收峰出现．结论 内生真菌发酵产生了某些新成分.
［关键词］滇重楼；内生真菌；生物转化；万古霉素
［中图分类号］R931.6［文献标识码］A［文章编号］2095－610X（2014） 11－0010－03
Biotransformation of Vancomycin by Endophytic Fungi from
Paris polyphyllavar.yunnanensis（Franch.） Hand.-Mazz
XUANQun１），PANHong－mei２）
（1）Dept. of Microbiology and Immunology，Kunming Medical University；2）Dept. of Nutriology，Kunming
Medical University，Kunming Yunnan 650500，China）
［Abstract］ObjectiveThe biotransformation of vancomycin by endophytic fungi isolated fromParis
polyphyllavar.unnanensis(Franch.) Hand.-Mazz was studied.ethodsEndophyt s were isolated and screened
for their biotransformational abilities. Afterwards，these endophytic fungi having transformation abilities were
identified.ResultsTwostrainsoftheendophyticfungiwereabletotransformvancomycin.Basedontheir26SrDNA
or ITS sequences, they were identified asP nicill um chrysogenuma dFusarium nematophilum.Af er strains G01
and G03 cultivated for 6 days in liquid media containing vancomycin，the peak area of vancomycin decreased and
new absorption peaks appeared according to the high performance liquid chromatography (HPLC).Conclusion
Somenewcomponentswereproducedbyfermentationofthetwostainsofendophyticfungi.
［Key words］Paris polyphyllavar.yunnanensis（ Franch.） Hand.-Mazz； Endophytic fungi；
Biotransformation；Vancomycin
Journal of Kunming Medical University
CN 53 -1221/ R
昆明医科大学学报 2014，35（11）：10～ 12
［基金项目］云南省教育厅科研基金资助项目（2012Y006）；云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金
资助项目（2014FB017）
［作者简介］宣群 （1968～），女，云南昆明市人，理学硕士，副教授，主要从事微生物资源开发利用及医学微生物学
暨免疫学教学科研工作.
内生真菌是指生活在健康植物细胞内或细胞
间，但不引起明显病症的真菌．由于与宿主植物
长期共同进化和基因重组，内生真菌获得了多样
化的生物合成能力．它们可以产生具有抗癌、抑
菌及调节植物生长等多种生物活性的物质[1]．此
外，与植物的共生关系迫使它们必须形成特殊的
生物降解途径以分解有毒化合物，因此有的内生
真菌还能转化天然化合物产生高效低毒产物[2]．经
内生真菌立体选择性转化后，镇静剂甲硫哒嗪可转
化为具有高效镇静作用的 R 型 2- 甲基亚砜吩噻
嗪，这是采用化学法难于做到的[3]．协同进化使植
物内生菌可能形成独特的酶系统．因此，它们可
以修饰相关药物的化学结构，增强药理活性并提高
药物的生物利用度．目前，越来越多研究者关注内
生真菌不仅因为它们能产生许多新物质，而且因为
它们可以转化天然产物．
万古霉素属于糖肽类抗生素，是临床上治疗革
兰阳性菌尤其是耐甲氧西林金葡菌、肠球菌和肺炎
球菌性严重感染的最后一线药物．然而，由于滥用
抗生素和病原菌变异，已经出现万古霉素耐药菌，
万古霉素的抗菌作用大打折扣，严重的革兰阳性菌
感染再一次向人类提出了严峻挑战．由于化学方法
制备的半合成万古霉素仍处于试验阶段，而且这些
半合成万古霉素具有较大副作用或尚未确认其安全
性能，所以化学合成的万古霉素衍生物是否能应用
于临床还是一个未知数[4]．由于内生菌具有局部立
体选择性的多酶系统，笔者采集了药用植物滇重楼
并分离其内生真菌．希望用这些内生真菌转化万古
霉素，为抗菌药物生物转化研究提供有价值的参
考．本文报导了分离自药用植物滇重楼的内生真菌
转化万古霉素．
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
HPLCDIONEX（戴安） UltiMeter3000；水为去
离子水（实验室自制）；其余试剂均为分析纯．滇
重楼采自云南武定，由云南白药集团优质种源繁
育有限责任公司惠赠．万古霉素盐酸盐（Sigma），
纯度≥99%，购自昆明丰科生物科技有限公司．
1.2培养基
分离培养基：酵母蛋白胨葡萄糖琼脂培养基
（yeastpeptonedextroseagar，YPD）．其成分：葡萄糖
20g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨2g/L，琼脂12g/L）1000
mL灭菌后，加入氨苄青霉素（1mg/mL）1mL．液体
发酵培养基：YPD液体培养基．
1.3内生真菌的分离
取新鲜健康滇重楼植株的根状茎、根、茎、
叶、花等样品用自来水冲洗干净，消毒纸巾擦干．
将各部位切成小块，于75％酒精中漂洗 3～5min
后，无菌水冲洗，随即用 0.1％升汞浸泡 0.5～1
min，无菌水冲洗数分钟．实验组样品边缘剪开，
置YPD平板上，于25℃培养箱中培养 7 d；对照
组样品直接置YPD平板，于相同条件下培养．实
验组有菌丝长出并进行纯化、斜面4℃保藏．在培
养期间，对照组无菌丝长出．
1.4底物发酵
在每个 250 mL 三角瓶中放入 150 mL 液体
YPD培养基，接种3块菌丝块（φ5cm） ．25℃、
120r/min摇瓶培养4d后，加入75mg（溶于无菌
纯净水） 的底物万古霉素盐酸盐再培养6d后收获
培养物．底物对照含有底物没有真菌，而培养对照
含有真菌没有底物，2种对照均在上述同样条件下培
养．过滤分离培养物和发酵液，发酵液冷藏待测.
1.5HPLC分析条件
流速0.8mL/min，柱子C18（WelchMaterials），
流动相甲醇：磷酸二氢钾（0.05mol/LpH3.2） =28:
82，波长230nm，手动进样20μL/针．
1.6菌株鉴定
对具有生物转化作用的内生真菌菌株进行分子
生物学鉴定．从真菌 G01 中扩增 26srDNA D1/D2
区序列，从真菌 G03 中扩增 ITS 区 （Internal
transcribed spacer regions） 序列，并分别回收测
序．
从斜面培养物中挑取菌丝于 50μL TaKaRa
Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（Code
No.9164） 中于80℃处理15min，变性后离心取上
清作为模板．使用 TaKaRa 真菌鉴定 PCR 试剂盒
（CodeNo.RR178），进行PCR扩增G01菌株的26S
D1/D2区目的片段和G03菌株的ITS区目的片段．
然后使用TakaraMiniBEST琼脂糖凝胶DNA提取试
剂盒Ver.3.0（CodeNo.9762） 切胶回收目的片段进
行DNA测序．
2 结果
2.1 HPLC分析
按化学成分分析条件检测，比较250nm波长
下底物万古霉素盐酸盐与内生真菌转化产物的保留
时间，发现底物经生物转化后不仅化学成分含量出
现不同程度的变化，且出现了底物不具有的化学成
分，从保留时间上反映出新吸收峰的化合物极性相
对偏高，见图1．
对比含有万古霉素盐酸盐培养基中，经内生真
菌 G01 转化后，万古霉素盐酸盐的峰面积下降，
并在保留时间12.357min和17.867min有新色谱峰
出现；而经G03转化后，万古霉素盐酸盐的峰面
积同样下降，并在保留时间 15.683 min 和 17.193
min有新色谱峰出现．这说明，经内生真菌G01和
G03可转化万古霉素盐酸盐并产生新的转化产物．
2.2内生真菌鉴定
经鉴定，内生真菌 G01 为产黄青霉 （图 2），
G03 为镰孢菌属的Fusarium nematophilum（图
3） ．
11第11期 宣 群，等．滇重楼内生真菌转化万古霉素的研究
3 讨论
很少有研究者们用滇重楼内生真菌修饰天然
产物．笔者研究了内生真菌产黄青霉和 Fusarium
nematophilum转化万古霉素盐酸盐的能力．
生物转化结合现代生物工程技术，利用微生
物或其代谢酶对现存有机物质进行分解或水合、
酯化、酯转移、脱水、脱羧、酰化、胺化、异构
化和芳构化等各类化学反应，产生新的活性物质，
从而导致药物活性发生相应的改变[5]．从结果可
知，万古霉素盐酸盐在滇重楼内生真菌产黄青霉
（ Penicillium chrysogenum） 和 Fusarium
nematophilum代谢中某些酶的催化下发生了生物转
化，导致底物万古霉素盐酸盐含量下降，且伴随
新化合物的产生．为万古霉素衍生物的筛选与发
现提供了新途径.
总之，内生真菌作为有用的资源不仅因为它
们的代谢物具有生物活性，而且因为它们对天然
产物的生物转化能力．研究证明，内生真菌等微
生物能通过生物转化获得手性化合物，这在化学
方法是很难获得的．本研究发现，内生真菌产黄
青 霉 （Penicillium chrysogenum） 和 Fu arium
nematophilum可转化万古霉素盐酸盐并产生新的代
谢物．关于转化产物中的化学成分的改变及其所
引起的药理作用差别有待对转化产物进一步的分
离纯化、结构鉴定及相关药理的分析来解释．
［参考文献］
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［4］ 王德心．活性多肽与药物开发［M］．北京：中国医药科
技出版社，2008:147－773.
［5］ 王劝绪．浅谈微生物催化在药物合成中的应用及其发
展前景［J］．科技创新，2012，5:31.
（2014－07－10收稿）
图3 G03ITS区PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.3Agarose gel electrophoresis of PCR-amplified
ITS regions
M:DL2000DNAMarker；1:ITS-G03-PCR产物；+：正对
照；-：负对照.
图1 转化产物及万古霉素底物对照在250nm的HPLC图
谱
Fig.1The HPLC chromatograms of transformation
products and vancomycin (230 nm)
A:G01转化万古霉素；B:G03转化万古霉素；
C:万古霉素底物对照.
图 2 G01 26SrDNA D1/D2区 PCR 产物的琼脂糖凝胶电
泳
Fig.2Agarose gel electrophoresis of PCR-amplified
D1/D2 regions of G01 26SrDNA
M:DL2，000 DNA Marker；1:26S rDNA-G01-PCR 产物；
+：正对照；-：负对照.
C
A
B
M 1 + -
M 1 + -
第35卷12 昆明医科大学学报