全 文 ：山东农业大学学报(自然科学版),2014,45(3):372-376 VOL.45 NO.3 2014
Journal of ShandongAgricultural University (Natural Science Edition) doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2014.03.010
镉处理下平邑甜茶 DNA的甲基化分析
王 利 1,3,李鹏飞 2,杨洪强 3*,谢会成 1,李 龙 1,谢永波 1
1.山东农业大学农业生态与环境重点实验室, 山东 泰安 271018
2.山东省东营市林业局, 山东 东营 257091
3.山东农业大学农业资源利用博士后流动站, 山东 泰安 271018
摘 要: 采用甲基化敏感扩增多态性（Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP）技术，对镉处理的平邑甜
茶叶片 DNA进行甲基化位点分析，研究镉对其甲基化多态性的影响。结果表明：在 0（CK）、2.5 mg·L-1、5 mg·L-1、
10 mg·L-1镉处理下，9对MSAP引物扩增，甲基化出现三种不同模式即未甲基化 A、半甲基化 B和全甲基化 C，共
扩增出 3150条谱带，单对引物最多扩增 656条，最少为 610条。5 mg.L-1镉处理的平邑甜茶甲基化较高，比例达到
60.1%；10 mg.L-1镉处理的平邑甜茶甲基化较低，比例达到 57.6%；与对照相比，镉处理的平邑甜茶甲基化水平降低，
可能镉抑制了其基因的表达。
关键词: 平邑甜茶; 甲基化; 甲基化敏感扩增多态性
中图法分类号: F812.4 文献标识码: A 文章编号: 1000-2324(2014)03-0372-05
Analysis of Methylation Polymorphism on Malus hupehensis
Leaves under Cd Treatment
WANG Li 1,3, LI Peng-fei2, YANG Hong-qiang3*, XIE Hui-cheng1, LI Long1,
XIE Yong-bo1
1.Key Laboratory of Agricultural Ecology and Environment, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China
2.Forestry Station, Dongying Municipal Forestry Bureau, Dongying 257091, China
3.Post-doctoral Mobile Station of Agricultural Resource Utilization, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China
Abstract: Methylation site and methylation polymorphism were analyzed on DNA of Malus hupehensis Rehd. under Cd
treatment with methylation sensitive amplified polymorphism (MSAP). The results showed that amplification of 9 primer
combinations formed three different modes and produced 3150 bands. The maximum number of bands was 656 and the
minum number of bands was 610 per primer combination under different concengtration Cd treatment of 0(CK), 2.5 mg·L-1,
5 mg·L-1, 10 mg·L-1. The highest rate of methylation polymorphism appeared under 5 mg·L-1Cd treatment with value of
60.1%, the lowest rate of methylation polymorphism appeared under 10 mg·L-1 Cd treatment with value of 57.6%. The level
of methylation polymorphism on Malus hupehensis Rehd under Cd treatment reduced compared with control sample. Its
reason might be Cd incurred the expression of gene.
Keywords: Malus hupehensis Rehd.; methylation; methylation sensitive amplified polymorphism
DNA甲基化是指生物体在 DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase）的催化下，将甲基供体
S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移到特定碱基上的过程。在动物和植物中普遍存在 DNA甲基化，它与
植物的生长发育、进化有密切的关系。植物 DNA甲基化水平受发育时期[1-2]、不同发育组织[3-4]、不
同种质资源[5-6]、DNA损伤与修复[7]及不同胁迫等的影响[8]。不同胁迫对植物甲基化影响存在差异，
低温使水稻甲基化差异片段 CIDM 7的去甲基化表达增强[9]，盐胁迫使小麦叶片发生超甲基化[10]，水
分胁迫导致水稻叶片根 DNA甲基化平均水平明显增加，其中根部增加幅度尤为明显[11]，生物胁迫
使小麦甲基化增加[12]，5～100 mg/L铬处理小麦幼苗的研究表明 100 mg/L铬浓度导致 3 d龄小麦幼
苗根系 DNA胞嘧啶甲基化水平降低，其他处理浓度却增加。重金属镉引起拟南芥、萝卜甲基化程度
的提高[13-14]，但是，关于镉究竟如何影响平邑甜茶甲基化还未见阐述，为此，以平邑甜茶为材料，
利用镉对其处理，探明镉处理下平邑甜茶 DNA甲基化的变化。
1 材料与方法
收稿日期: 2013-03-06 修回日期: 2013-03-11
基金项目: 山东农业大学博士后课题,苹果优质高效生产关键技术研究与示范(2014BAD16B02)
作者简介: 王 利(1968-),男,山东高密人,博士,研究方向为林木遗传与生理.
*通讯作者:Author for correspondence. E – mail:labft@sdau.edu.cn
第 3期 王 利等:镉处理下平邑甜茶 DNA的甲基化分析 ·373·
1.1 材料与处理
取大小一致的平邑甜茶种子,经消毒层积 1个多月后播在育苗容器中。当幼苗第 2片真叶刚出现
时，选生长相近的植株移至 1/2 Hoagland营养液中，每 3 d换 1次培养液，培养至出现第 6片叶后，
在营养液中加入氯化镉，使其终浓度为 0（CK）、0.5 mg·L-1、2.5 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1，每处
理 3株，重复 3次，30 d后，提取叶片DNA，利用甲基化敏感扩增多态性（Methylation sensitive amplified
polymorphism, MSAP）检测叶片 DNA甲基化的多态性。
1.2 引 物
（1）接头序列
EcoRI-adapterI 5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′
EcoRI-adapterII 5′-AATTGGTACGCAGTC-3′
HpaⅡ/ MspⅠ-adapterI 5′-GATCATGAGTCCTGCT-3′
HpaⅡ/ MspⅠ-adapeterII 5′-CGAGCAGGACTCATGA-3′
（2）预扩增引物
EcoRI +A 5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′
HpaⅡ/ MspⅠ+0 5′-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3′
（3）选扩增引物
EcoRI 引物 （5’端 FAM标记）
E-AAC: 5′-GACTGCGTACCAATTCAAC-3′
E-AAG: 5′-GACTGCGTACCAATTCAAG-3′
E-ACA: 5′-GACTGCGTACCAATTCACA-3′
E-ACT: 5′-GACTGCGTACCAATTCACT -3′
E-ACG: 5′-GACTGCGTACCAATTCACG-3′
E-AGC: 5′-GACTGCGTACCAATTCAGC-3′
E-ATC: 5′-GACTGCGTACCAATTCATC-3′
HpaⅡ/ MspⅠ引物
H/M-TCG: 5′- ATCATGAGTCCTGCTCGGTCG -3′
H/M-TTA: 5′- ATCATGAGTCCTGCTCGGTTA -3′
H/M-TGA: 5′- ATCATGAGTCCTGCTCGGTGA -3′
H/M-TGT: 5′- ATCATGAGTCCTGCTCGGTGT -3′
H/M-TGC: 5′-ATCATGAGTCCTGCTCGGTGC-3′
H/M-TCC: 5′- ATCATGAGTCCTGCTCGGTCC -3′
H/M-TCT: 5′-ATCATGAGTCCTGCTCGGTCT-3′
H/M-TTC: 5′-ATCATGAGTCCTGCTCGGTTC-3′
H/M-TAC: 5′- ATCATGAGTCCTGCTCGGTAC -3′
1.3 引物对的筛选
从 5 个供试样品中选出 2个具有代表性的样品利用银染技术对 63 对引物进行筛选，筛选出
E-AAC/H-TCG、E-AAC/H-TGT、E-AAC/H-TCC、E-AAG/H-TCG、E-AAG/H-TGC、E-AAG/H-TCC、
E-ACA/H-TCG、E-ACA/H-TGT、E-ACA/H-TCC9对引物对供试样品进行扩增。从中筛选出检测位
点较多，分布均匀，清晰可辨且多态位点百分比较高的引物对各个样品进行MSAP分析。
1.4 MSAP分析
据北京鼎国生物技术有限责任公司 FISH-MSAP试剂盒说明，先进行 EcoRI / HpaⅡ、MspⅠ酶
切与 T4连接酶连接，取 2 μL酶切连接液做模板，用带有 1个选择性碱基的引物进行预扩增，再将
·374· 山东农业大学学报(自然科学版) 第 45卷
预扩增液按 1:15比例稀释，以 2 μL预扩增稀释液为模板，用带有 3个选择性碱基的引物对进行选择
性扩增。变性产物（含有内标 GeneScan-500）上样于 4%变性聚炳烯酰胺凝胶，恒定功率 50 W、最
大电压 3000 V，进行电泳 2.4 h，利用 ABI 377测序仪对其进行检测。
图 1 DNA琼脂糖电泳结果
Fig.1 Result of DNA agarose electrophoresis
图 2 EcoR I/Hpa II酶切扩增结果
Fig.2 Results of EcoR I/Hpa II enzyme amplification
注：图中 1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、32-36、37-41、42-46泳道分别为样品 0（对照）、0.5、2.5、5、10 mg.L-1引物 E-AAC/H-TCG、
E-AAC/H-TGT、E-AAC/H-TCC、E-AAG/H-TCG、E-AAG/H-TGC、E-AAG/H-TCC、E-ACA/H-TCG、E-ACA/H-TGT、E-ACA/H-TCC扩增
结果，31、47泳道为 Marker 的电泳结果。
Note: 1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、32-36、37-41、42-46 lanes are amplified results of E-AAC/H-TCG、E-AAC/H-TGT、E-AAC/H-TCC、
E-AAG/H-TCG、E-AAG/H-TGC、E-AAG/H-TCC、E-ACA/H-TCG、E-ACA/H-TGT、E-ACA/H-TCC primer combinations respectively.31、47 lanes
are electrophoretic results of Marker respectively.
图 3 EcoR I/Msp I酶切扩增结果
Fig.3 Results of EcoR I/Msp I enzyme amplification
注：图中 1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、32-36、37-41、42-46泳道分别为样品 0（对照）、0.5、2.5、5、10mg.L-1引物 E-AAC /M-TCG、
E-AAC / M-TGT、E-AAC / M-TCC、E-AAG/ M-TCG、E-AAG/ M-TGC、E-AAG/ M-TCC、E-ACA/ M-TCG、E-ACA/ M-TGT、E-ACA/ M-TCC
扩增结果。31、47泳道为Marker的电泳结果。
Note: 1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、32-36、37-41、42-46 lanes are amplified results of E-AAC/M-TCG、E-AAC/M-TGT、E-AAC/M-TCC、
E-AAG/M-TCG、E-AAG/M-TGC、E-AAG/M-TCC、E-ACA/M-TCG、E-ACA/M-TGT、E-ACA/M-TCC primer combinations respectively. 31、
47 lanes are electrophoretic results of Marker respectively.
第 3期 王 利等:镉处理下平邑甜茶 DNA的甲基化分析 ·375·
1.5 统计分析
利用 GeneScan3.1软件对图像进行处理，构建 0、1数学矩阵。通过比较电泳谱带的差异，可以
推测出 CCGG 的甲基化情况[15]。
2 结果与分析
2.1 基因组的质量
本实验提取平邑甜茶 DNA经琼脂糖电泳检测（如图 1），主带清晰，片段大小在 23 kb左右，无
降解。这说明该法提取的银杏 DNA质量较高，符合MSAP技术要求。
2.2 镉处理下平邑甜茶 DNA甲基化模式分析
平邑甜茶 DNA经过 EcoR I/Hpa II、EcoR I/Msp I酶切、连接、预选扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳
后得到MSAP图谱（图 2，图 3），谱带清晰。图中谱带表明其甲基化主要有三种不同模式：模式 A
是指 EH、EM均有带，代表非甲基化位点，说明未发生甲基化（或单链酶切位点内侧甲基化）；模
式 B是指 EH有带、EM无带，代表半甲基化位点，说明该位点发生了单链酶切位点外侧的胞嘧啶
甲基化；模式 C是指 EH无带、EM有带，代表全甲基化位点，说明该位点发生了双链酶切位点内
侧的胞嘧啶甲基化。
2.3 镉处理下平邑甜茶 DNA甲基化水平分析
MSAP图谱中每个泳道的每一条带代表一个酶切位点，根据有带记为 1，无带记为 0的方法分
析统计其电泳谱带。9对引物共扩增出 3150条谱带，单对引物最多扩增 656条，最少为 610条。在
镉处理中，5 mg.L-1镉处理的平邑甜茶甲基化条带最多，共 385条，甲基化达到 60.1%；2.5 mg.L-1
镉处理的平邑甜茶甲基化条带最少，共 355条，甲基化达到 57.8%。在扩增位点中，检测到甲基化
位点 1871个，甲基化比例为 59.4%；其中，半甲基化位点 941个，比例为 29.9%，全甲基化位点为
930个，比例为 29.5%，半甲基化与全甲基化位点比例接近，说明镉处理对单链酶切位点外侧的胞嘧
啶甲基化和双链酶切位点内侧的胞嘧啶甲基化的影响差异不大。另外，模式 B中对照扩增谱带最多
206条，10 mg.L-1镉处理最少 167条，总体呈现减少的趋势；模式 C中对照扩增谱带最多 197条，
2.5 mg.L-1最少 168条，出现先减少后增加的变化。与对照相比，镉处理使平邑甜茶甲基化位点数量
总体出现减少的趋势（表 1）。
表 1 镉处理下平邑甜茶叶片甲基化多态性分析
Table1 Analysis of methylation polymorphism on Malus hupehensis leaves under Cd treatment
注：表中 A为未甲基化位点，B为半甲基化位点，C为全甲基化位点，B+C为甲基化位点数， RHMS半甲基化位点比例，全甲基化位点比
例 RFMS，甲基化位点比例 RMS。
Note: A indicates No-methylaed sites, B indicates Hemi-methylaed sites, C indicates Full-methylaed sites, RHMS- Rate of hemi-methylaed site,
RFMS-Rate of full-methylaed site，RMS-Rate of methylaed sit.
3 讨 论
表观遗传学是指在 DNA序列没有发生改变的情况下，遗传信息在基因功能上发生可遗传的变
化，导致表型变异[16]，近 10年来逐渐受到广泛重视，其研究成为当今生命科学研究的热点领域。植
处理浓度
(mg·L-1)
Treatment
concentration
总带数
Totalbands
A
No-methylaed
sites
B
Hemi-methylaed
sites
C
Full-methylaed
sites
B+C B%RHMS(%)
C%
RFMS(%)
(B+C)%
RMS(%)
0 656 253 206 197 403 31.4 30.0 61.4
0.5 610 244 190 176 366 31.1 28.9 60
2.5 614 259 187 168 355 30.4 27.4 57.8
5 641 256 191 194 385 29.8 30.3 60.1
10 629 267 167 195 362 26.6 31.0 57.6
总计 Total 3150 1279 941 930 1871 - - -
百分比(%) - - - - 29.9 29.5 59.4
·376· 山东农业大学学报(自然科学版) 第 45卷
物 DNA甲基化是在甲基转移酶的作用下，把 DNA的一个甲基添加在 DNA分子的碱基上，通常加
在胞嘧啶上，形成甲基胞嘧啶[16]。在植物正常发育过程中，DNA甲基化能够调控生长发育等过程，
对植物生长发育具有重要的调节作用。DNA甲基化的水平模式发生改变，就会影响到植物的生长发
育，使其生长发育异常。李海林等研究巴西橡胶树 DNA甲基化模式表明，其存在非甲基化、半甲基
化和全甲基化三种模式[17]，本实验研究也得到了上述三种不同的甲基化模式。不同植物甲基化多态
性水平不一[14, 17]。随着镉处理浓度的增加，拟南芥甲基化程度增加[14]。本研究结果表明，镉处理影
响平邑甜茶叶片 DNA的甲基化水平，使半甲基化和甲基化多态性发生了改变，它们的多态性比例为
26.6~31.1%，尤其是使平邑甜茶叶片 DNA半甲基化多态性出现减小的趋势，这与马子成等研究结果
相反，甲基化多态性出现减小可能是镉处理抑制了基因的表达。
4 结 论
（1）在镉处理中，甲基化出现三种不同模式即未甲基化 A（EcoR I/Hpa II、EcoR I/Msp I酶切扩增
均有带）、半甲基化 B（EcoR I/Hpa II酶切扩增有带、EcoR I/Msp I酶切扩增无带）
（2）在镉处理中，5 mg.L-1镉处理的平邑甜茶甲基化较高，比例达到 60.1%；10 mg.L-1镉处理的平
邑甜茶甲基化较低，比例达到 57.6%；与对照相比，镉处理的平邑甜茶甲基化水平降低，可能镉抑
制了其基因的表达和全甲基化 C（EcoR I/Hpa II酶切扩增无带、EcoR I/Msp I酶切扩增有带）。
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