全 文 ：檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
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［责任编辑 邹晓翠］
［收稿日期］ 20120819(003)
［基金项目］ 云南省应用基础研究项目(2010ZC136) ;大理州科技项目;大理学院 2011 年中青年学术带头人培养项目;大理学院 2012 年
大学生科研基金项目(KYSX2012021)
［第一作者］ 杨淋，E-mail:862376190@ qq． com
［通讯作者］ * 李海峰，硕士，副教授，从事药用植物生物技术研究，Tel:0872-2251475，E-mail:lihfzh888@ sina． com
滇重楼种子无菌萌发及植株形态发生的研究
杨淋，胡侃，赵昱，李海峰*
( 云南省大理学院药学与化学学院，云南 大理 671000)
［摘要］ 目的:探讨滇重楼种子无菌萌发及植株形态发生的影响条件。方法:研究培养基、培养温度和光照强度对滇重
楼种子无菌萌发的影响，并对无菌萌发过程中植株形态发生进行观察。结果:滇重楼种子无菌萌发最佳培养基是 Knudson C，
种子萌动率和萌发率分别为 91. 0%，76. 7%;B5 培养基适宜胚根生长，胚根长(4. 567 ± 0. 251 7)cm。15 ℃ /25 ℃和 20 ℃ /
25 ℃变温培养种子萌动率达 81. 7%以上;15 ℃ /25 ℃ 变温培养能促进种子萌发，种子萌发率高达 55. 3%，部分种胚能突破种
皮生长发育成子叶;20 ℃ /25 ℃变温培养适宜胚根生长，胚根长为(3. 667 ± 0. 208 2)cm。750 ～ 1 500 lx弱光照培养适宜种子
萌发，种子萌动率和萌发率分别在 86. 7%，58. 3%以上;750 lx弱光照培养胚根生长迅速，胚根长达(4. 867 ±0. 152 8)cm;3 000 lx
强光照对种子萌发和胚根生长有一定的抑制作用。结论:建立了滇重楼种子无菌萌发胚根和胚芽培养系，为进一步研究无菌
条件下滇重楼胚根和胚芽的生长发育、生理生化变化提供参考。
［关键词］ 滇重楼种子;无菌萌发;形态发生;培养基;培养温度;光照强度
［中图分类号］ R282 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)03-0151-04
Studies on the Germ-free Germination of Seeds of Paris polyphylla var．
Yunnanensis and Plant Morphogenesis
YANG Lin，HU Kan，ZHAO Yu，LI Hai-feng*
(College of Pharmacy and Chemistry Yannan Dali University，Dali 671000，China)
［Abstract］ Objective:To explore the factors influencing the germ-free germination of seeds of Paris
polyphylla var． Yunnanensis and the plant morphogenesis． Method:The effects of culture medium，culture
temperature and light intensity on the germ-free germination of seeds of P． polyphylla var． Yunnanensis were
studied，and the plant morphogenesis during the course of germ-free germination of seeds of P． polyphylla var．
·151·
第 19 卷第 3 期
2013 年 2 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 3
Feb．，2013
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2013.03.003
Yunnanensis was observed at the same time． Result:The best culture medium for the germ-free germination of
seeds of P． polyphylla var． Yunnanensis was Knudson C，and seed protrusion rate and germination rate were
91. 0% and 76. 7%，respectively． B5 culture medium was suitable for the growth of radicle，and the radicle length
is (4. 567 ± 0. 251 7) cm． The seed protrusion rate was higher than 81. 7% when culture temperatures were
changed with 15 ℃ /25 ℃ and 20 ℃ /25 ℃ ． Culture by changed temperatures with 15 /25 ℃ could promote seed
germination，and the seed germination rate was as high as 55. 3% ． Some embryos could break through the seed
coat and grow into cotyledon． Culture by changed temperatures with 20 ℃ /25 ℃ is suitable for the growth of
radicle，and the radicle length is (3. 667 ± 0. 208 2)cm． Weak light irradiation of 750-1 500 lx is suitable for the
seed germination，the seed protrusion rate and germination rate were more than 86. 7% and 58. 3%，respectively．
Under 750 1x weak light，the radicle grow rapidly，and the radicle length could be up to (4. 867 ± 0. 152 8)cm．
3 000 lx strong light irradiation exhibited some inhibition for the seed germination and radicle growth． Conclusion:
This study established the germ-free germination culture system of radicle and embryo for the seeds of P． polyphylla
var． Yunnanensis，which could lay the foundation for further study the growth，physiological and biochemical
change of radicle and embryo of P． polyphylla var． Yunnanensis under aseptic condition．
［Key words］ seeds of Paris polyphylla var． Yunnanensis;germ-free germination;morphogenesis;culture
medium;culture temperature;light intensity
滇重楼为延龄草科多年生草本植物，又称云南
重楼、草河车、独脚莲，根状茎具有抗肿瘤、止血、免
疫调节和镇静镇痛等作用［1］，是云南白药系列、宫
血宁、热毒清等中成药的主要原料之一［2］。长期野
生无序采挖，致使滇重楼野生种质资源濒临灭绝，已
经被列为国家重点保护野生药材濒危物种［3］，是云
南 30 个重要濒危药用植物之一［4-5］。通过人工栽培
是解决药材资源紧缺的有效途径，但是，在如何缩短
滇重楼种胚形态学后熟和生理学后熟期、解除种子
休眠、提高种子萌发率等方面研究没有取得突破性
进展，成为滇重楼人工种植的主要限制因素。因此，
本项目拟以滇重楼成熟种子为试验材料，研究培养
基、培养温度和光照强度对滇重楼种子无菌萌发及
植株形态发生进行研究。
1 仪器和试药
1. 1 仪器 AIRTECH 型超净工作台(苏净集团安
泰公司制造) ，MGC-300H 型智能型人工气候箱(上
海一恒科技有限公司) ，SPX-250B-G 型微电脑光照
培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ，
YXQ-LS-30SⅡ型立式压力蒸气灭菌器(上海博讯
实业有限公司医疗设备厂) ，BCD-276AK4KELON
型冰箱(广东科龙电器股份有限公司) ，AB104 型
电子天平(瑞士 Mettletoledo 公司) ，pH S-4CT 型精
密酸度计。
1. 2 试药 试验用无机试剂、蔗糖均为国药集团化学
试剂有限公司生产的分析纯，琼脂(日本进口分装)。
试验材料为 2011 年采自云南省云龙县关坪镇滇重楼
种植基地的滇重楼成熟果实，并经作者鉴定为延龄草
科滇重楼 Paris polyphylla var． Yunnanensis果实，果实搓
去果皮，自来水充分洗涤后自然晒干，备用。
2 方法
2. 1 滇重楼种子的灭菌 外植体为在 4 ℃下湿沙
层积 60 d的滇重楼种子，用自来水洗净，在无菌操
作台上用 70%的乙醇浸泡 60 s，0. 1%的 HgCl2(加
吐温-80 数滴)溶液消毒杀菌 8 ～ 10 min，无菌水洗
涤 5 次，用无菌滤纸吸干水分备用。
2. 2 培养基及培养条件试验设计 培养基试验以
MS(1962) ，KnudsonC (1964) ，B5 (1968) ，White
(1943)和 Miller(1967)5 种培养基［6-7］作为基本培
养基，培养基中分别添加蔗糖 30 g·L －1、琼脂 8. 0 g·
L －1、pH 5. 6，培养条件 20 ℃ /25 ℃变温培养、光照
强度 1 500 lx。培养温度和光照强度试验培养基为
B5 培养基、蔗糖 30 g·L
－1、琼脂 8. 0 g·L －1、pH 为
5. 6，培养温度设为 15，20，25 ℃ 3 个恒温培养和 15
℃ /25 ℃，20 ℃ /25 ℃ 2 个变温培养，培养条件为
1 500 lx光照培养;光照强度设为 3 000，1 500，750
lx和暗培养 4 个水平，培养条件为 20 ℃ /25 ℃变温
培养。每个处理接种经过消毒杀菌的滇重楼种子
100 粒，设 3 次重复。
2. 3 结果统计与分析 每周定时观察滇重楼种子
萌发情况 1 次，并用 Canon EOS600D 数码相机拍
照，记录种子萌发情况。在培养 60 d 时统计种子萌
动数，以胚根(或胚芽)开始膨大突破种皮视为萌
动，种子萌动率(%)为胚根突破种皮种子数占接种
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第 19 卷第 3 期
2013 年 2 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 3
Feb．，2013
种子数的质量分数;在培养 90 d 时统计种子萌发数
和胚根长，以胚根(或胚芽)长度≥5 mm 视为萌发，
种子萌发率(%)为萌发种子数占接种种子数的质
量分数，求萌发种子数平均根长。所得数据用 SPSS
13. 0 统计软件进行相关分析。
3 结果与分析
3. 1 培养基对滇重楼种子无菌萌发及植株形态发
生的影响 如表 1 所示，5 种培养基主要特点是:
Knudson C 培养基含有高浓度的 Ca2 +和较高浓度的
PO3 －4 ，NH
+
4 ，NO
－
3 ，K
+浓度较低;B5 培养基含有高浓
度的 NO －3 和 K
+，低浓度的 Ca2 +，NH +4 ，PO
3 －
4 ;MS
培养基含有高浓度的 NH +4 ，NO
－
3 和较高浓度的
Ca2 +，K +，低浓度的 PO3 －4 ;Miller培养基含有高浓度
的 PO3 －4 和较高浓度的 NO
－
3 ，K
+，Ca2 +，不含 NH +4 ;
White培养基 Ca2 +，NO －3 ，K
+，PO3 －4 的浓度较低，不
含 NH +4 。试验结果表明，含有高浓度 Ca
2 +和较高浓
度 PO3 －4 的 KnudsonC 培养基是滇重楼种子无菌萌
发的最佳培养基，种子萌动率和萌发率(P ＜ 0. 05)
显著高于其他培养基，分别为 91. 0%，76. 7%;含有
高浓度 NO －3 和 K
+的 B5 培养基适宜胚根生长，胚根
长(P ＜ 0. 05)显著高于其他培养基，胚根长高达
(4. 567 ± 0. 251 7)cm。
表 1 培养基对滇重楼种子无菌萌发及植株形态发生的影响
培养基
主要成分的浓度
Ca2 + NH +4 NO －3 K + PO3 －4
萌动率 /% 萌发率 /% 平均根长 / cm 植株形态发生
MS 3. 0 20. 6 37. 4 18. 1 1. 2 49. 3 d 26. 3 d 3. 733 ± 0. 208 2b 胚根生成
B5 1. 0 2. 0 24. 7 24. 7 1. 1 83. 3b 58. 0b 4. 567 ± 0. 251 7a 胚根生成
KnudsonC 4. 2 7. 6 8. 4 1. 8 1. 8 91. 0a 76. 7a 2. 033 ± 0. 208 2d 胚根生成
White 1. 3 0. 0 3. 3 3. 0 0. 1 62. 0c 33. 3c 0. 6000 ± 0. 200 0d 胚根生成
Miller 1. 5 0. 0 12. 8 13. 0 2. 2 67. 7c 52. 0b 3. 100 ± 0. 200 0c 胚根生成
注:同列不同字母表示差异显著 P ＜ 0. 05(表 2 ～ 3 同)。
滇重楼种子在 Knudson C 培养中萌发较快，经
过无菌培养 28 d后种子开始萌动，胚根生长膨大使
种皮一端隆起开始萌动，再经过 14 ～ 21 d 培养胚根
突破种皮萌发。滇重楼种子无菌萌发的胚根在 B5
培养基中生长较快，随着胚根的生长有少量根毛生
成，经过 90 d培养胚根长达到 4. 00 cm 以上，但是，
没有观察到胚芽分化。
3. 2 培养温度对滇重楼种子无菌萌发及植株形态
发生的影响 如表 2 所示，15 ℃ /25 ℃ 和
20 ℃ /25 ℃变温培养滇重楼种子萌动率(P ＜ 0. 05)
显著高于其他温度培养，种子萌动率达 81. 7%以上;
15 ℃ /25 ℃ 变温培养种子萌发率(P ＜ 0. 05)显著高
于其他温度培养，萌发率为 55. 3%;20 ℃ /25 ℃变温
培养适宜胚根生长，胚根长(P ＜ 0. 05)显著高于其他
温度培养，胚根长为(3. 667 ±0. 208 2)cm。
表 2 培养温度对滇重楼种子无菌萌发及植株形态发生的影响
培养温度
/℃
萌动率
/%
萌发率
/%
平均根长
/ cm
植株形态发生
15 0． 0 0． 0 0． 0 －
20 49． 3b 47． 3b 0． 966 7 ±0． 208 2d 胚根生成
25 28． 7c 14． 7c 2． 933 ±0． 3512b 胚根生成
15 /25 82． 0a 55． 3a 1． 900 ±0． 100 0c 胚根、胚芽生成
20 /25 81． 7a 41． 0b 3． 667 ±0． 208 2a 胚根生成
15 ℃培养 90 d 滇重楼种子不能萌发。15 ℃ /
25 ℃ 变温培养适宜滇重楼胚根、胚芽的生长，经过
28 ～ 42 d 培养，不仅有大量的胚根突破种皮萌发，
还有部分胚芽突破种皮萌发，胚芽生长较快，经过
14 ～ 21 d 培养胚芽生长发育成子叶，子叶生长较
快，经过 90 d培养子叶高达 3 ～ 4 cm，但是，没有观
察到胚根分化。
表 3 光照强度对滇重楼种子无菌萌发及植株形态发生的影响
光照强度
/ lx
萌动率
/%
萌发率
/%
平均根长
/ cm
植株形态发生
0(暗) 32. 0c 0. 0 0. 0 －
750 86. 7a 60. 7a 4. 867 ± 0. 152 8a 胚根生成
1 500 90. 3a 58. 3a 2. 333 ± 0. 251 7b 胚根生成
3 000 60. 0b 34. 0b 1. 367 ± 0. 208 2c 胚根生成
3. 3 光照强度对滇重楼种子无菌萌发及植株形态
发生的影响 如表 3 所示，暗培养种子能够萌动，但
是不能萌发。750 ～ 1 500 lx 弱光照培养，种子萌动
率和萌发率(P ＜ 0. 05)显著高于暗培养和 3 000 lx
光照培养，种子萌动率和萌发率分别在 86. 7% 和
58. 3%以上。750 lx 弱光照培养胚根生长迅速，胚
根长(P ＜ 0. 05)显著高于其他光照培养，胚根长为
(4. 867 ± 0. 152 8)cm。750 ～ 1 500 lx 弱光照培养
适宜滇重楼种子的萌发及胚根生长。
暗培养 28 d后滇重楼种子开始萌动，但是，经过培
养 90 d后种子也不能萌发。750 ～ 1 500 lx 弱光照
·351·
杨淋，等:滇重楼种子无菌萌发及植株形态发生的研究
培养适宜胚根生长，经过 28 ～ 35 d 培养，有大量的
胚根突破种皮萌发。750 lx弱光照培养胚根生长迅
速，经过 90 d培养胚根长达 4 ～ 5 cm。3 000 lx强光
照培养胚根生长缓慢。
4 讨论
种子休眠特性是植物在长期进化过程中形成的
对不良环境适应的策略之一，不同的植物具有不同
的内源休眠机制。黄玮等［8］研究发现，种子内存在
萌发抑制物、种胚发育不完全及生理学后熟是滇重
楼种子休眠的主要因素。本研究结果表明，培养基、
培养温度及光照强度对滇重楼种子无菌萌发及植株
形态发生影响显著，滇重楼种子在 4 ℃湿沙层积
60 d后接种在无菌培养基中，经过 28 d 培养种子开
始萌动，再经过 28 ～ 35 d 培养胚根能突破种皮萌
发，比李运昌等［9］研究结果滇重楼种子需要经过两
冬一夏才能完成形态学后熟和生理学后熟时间大大
缩短;Bemard［10］研究发现，种胚发育不完全的兰科
植物种子接种在无菌培养基上，经过培养能够完成
种胚发育、萌发成苗，滇重楼种子无菌萌发过程与兰
科植物种子相似，不同培养基对种子萌发及胚根生长
影响较大，Knudson C培养基适宜滇重楼种子无菌萌
发，B5 培养基适宜胚根生长。15 ℃ /25 ℃ 和 20 ℃ /
25 ℃变温培养有利于种子的萌动;15 ℃ /25 ℃变温
培养种子萌发率最高，同时还有部分种子胚芽突破
种皮萌发，经过培养胚芽生长发育成子叶，这与周立
刚等［10］和熊海浪等［11］研究结果相一致，滇重楼种
子经过低温交替处理和二次变温处理休眠能得到明
显解除。暗培养种子能够萌动，但是不能萌发;
750 ～ 1 500 lx是滇重楼种子萌动和萌发最适宜光照
强度;750 lx弱光照适宜胚根生长，3 000 lx 强光照
培养胚根生长缓慢，这可能与光照促进 GA3 的形
成、降低 ABA 含量有关［12］，孟繁蕴等［13］研究结果
也发现，滇重楼种胚休眠和生理后熟期种子内抑制
萌发物质 ABA 含量的减少及促进萌发物质 GA，
IAA，ZR的增加是导致种胚休眠解除的主要原因。
经过离体培养可以大大缩短滇重楼种子完成形
态学后熟和生理学后熟时间，主要原因可能是培养
基能够为种胚发育提供 N，P，K 等营养物质，Ca2 +，
K +等离子对种子萌发过程中某些酶有活化作用，
Ca2 +可能还与其受体蛋白结合作为调节细胞功能
的第二信使参与种子萌发过程中的代谢调控，所以
Ca2 +浓度含量较高的 Knudson C培养基是滇重楼种
子无菌萌发的最佳培养基;种子萌发过程中需要一
系列的酶的调控才能完成，而酶的活性与温度、光照
密切相关，因此，可以通过人工调控温度和光照控制
种子萌发过程中关键酶的活性，促进种子的萌发。
因此，用离体培养缩短滇重楼种子形态学后熟和生
理学后熟，用处于萌动状态的滇重楼种子育苗是否
能缩短种子育苗时间及提高种子出苗率，需要进一
步研究证明。在滇重楼种子萌发及植株形态发生过
程中，胚根突破种皮萌发的种子经过培养没有观察
到胚芽分化，胚芽突破种皮萌发的种子经过培养也
没有观察到胚根的分化，所以在离体培养条件下，滇
重楼胚根的生长是否对胚芽分化有抑制作用，胚芽
的生长是否又对胚根分化有抑制作用，也还需要进
一步研究。
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