全 文 ：第 36卷 第 2期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vol.36 No.2
2008年 2月 JOURNALOFNORTHEASTFORESTRYUNIVERSITY Feb.2008
思茅松成熟胚无菌萌发及农杆菌介导的遗传转化 1)
　　　　　吴　涛　陈少瑜　陈　芳　　　　　王寅冰　易善军　陈善娜
(云南省森林植物培育与开发利用重点实验室(云南省林业科学院),昆明 , 650204)　　　　　(西南林学院)　　　　　(云南大学)　　
　　摘　要　以思茅松成熟胚为外植体 , 研究其适宜的萌发培养基 ,并对其根癌农杆菌介导的遗传转化进行初步
研究。结果表明:适宜成熟胚萌发的培养基为 1/2MS培养基;卡那霉素的质量浓度为 40 mg· L-1 , 抑菌剂羧苄青
霉素的质量浓度为 800mg· L-1;遗传转化的适宜条件为:菌液比色浓度的 OD600为 0.8, 浸染时间 15 ～ 30min, 共培养时间 1 ～ 2d;组织化学染色检测到了 GUS瞬时表达。
关键词　思茅松;成熟胚;无菌萌发;根癌农杆菌;遗传转化
分类号　Q943.2
Germ-freeGerminationofMatureEmbryosandAgrobacterium-MediatedTransformationofPinuskesiyavar.langbianensis/WuTao, ChenShaoyu, ChenFang(KeyLaboratoryofForestPlantCultivationandUtilization, YunnanA-
cademyofForestry, Kunming650204, P.R.China);WangYinbin, YiShanjun(SouthwestForestryColege);Chen
Shanna(YunnanUniversity)//JournalofNortheastForestryUniversity.-2008, 36(2).-10 ～ 12, 15
InvitrogerminationandAgrobacterium-mediatedgenetictransformationprotocolsweredevelopedbyusingmaturezy-goticembryosofPinuskesiyavar.langbianensisasexperimentmaterials.Resultsshowthat1/2MSmediumisoptimalfor
invitrogermination.Theoptimumconditionsforgenetictransformationwereobtainedaskanamycin40mg· L-1 , carbeni-
cillin800mg· L-1 , soakingintheAgrobacteriumtumefacienssuspensionwithanOD600 of0.8for15～ 30minutes, and1～
2daysofco-cultivation.AhigherGUSexpressioncouldbemeasuredbyhistochemicalcoloration.
Keywords　Pinuskesiyavar.langbianensis;Matureembryos;Germ-freegermination;Agrobacteriumtumefaciens;Genetictransformation
　　思茅松(Pinuskesiyavar.langbianensis)是云南省主要用
材及采脂树种 , 其分布面积占云南省林地面积的 11%, 拥有 1
亿 m3的蓄积量 , 在云南省林业生产和生态环境建设中起着
极其重要的作用 [ 1] 。针对云南省松毛虫 、松小蠹发生严
重 [ 2-3]和纸浆生产企业对木材的特定要求 [ 4] , 将可以缩短育
种时间的植物转基因技术用于思茅松遗传改良研究具有重要
的现实意义。 1983年首例转基因植株问世 , 迄今已发展的遗
传转化方法有农杆菌介导法 、基因枪法 、PEG法 、电击法和花
粉管通道法等 , 农杆菌介导法是其中应用最广泛 、技术路线较
成熟的方法之一 , 但该方法需要成熟完善的组培再生体系做
转化的受体系统 [ 5] 。与农作物和其它木本植物相比 , 松属树
种的体细胞胚胎发生比其他物种困难得多 [ 6] 。因此 , 笔者在
探索思茅松体细胞胚胎发生再生体系的同时 , 尝试用思茅松
成熟胚为材料 , 对其无菌萌发进行研究 , 在此基础上进一步对
根癌农杆菌介导的 GUS报告基因遗传转化条件进行初步探
索 , 旨在为思茅松进一步获得高效率的农杆菌介导转化目的
基因研究提供实验资料和技术支持。
1　材料与方法
思茅松成熟种子于 2004年采自思茅市镇沅县 , 4 ℃保
存。供试的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 C58
含有质粒载体 pBI121,该载体的 T-DNA区带有 NOS启动子
驱 动的新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ基因), 以及 35S启动
1)国家林业局 “ 948”项目(2003444)。
第一作者简介:吴涛 ,男 , 1979年 4月生 ,云南省森林植物培育与
开发利用重点实验室(云南省林业科学院),研究实习员。
通讯作者:陈少瑜 ,云南省森林植物培育与开发利用重点实验室
(云南省林业科学院),副研究员。
收稿日期:2007年 4月 3日。
责任编辑:潘　华。
子驱动的报告基因 β -葡糖苷酸酶基因(β -glucuronidase
gene, GUS基因), 本实验室保存。固体 LB培养基用于农杆菌
C58平板培养 ,液体 LB培养基用于农杆菌C58菌液制备 [ 7] , 2
种培养基均附加庆大霉素(Gentamycin, Gen)25mg· L-1和卡
那霉素(Kanamycin, Kan)50mg· L-1;MS培养基用于思茅松
成熟胚的无菌萌发和生长培养。
1.1　无菌萌发培养基筛选
成熟种子先用自来水浸泡 24～ 48h,然后用手搓洗并用流动
自来水冲洗 10 ～ 30min,之后于超净工作台上用 0.1%升汞消毒
15～ 20min,最后用灭菌水涮洗 4 ～ 5次,每次 3min,备用。
以添加蔗糖 30g· L-1和琼脂 7g· L-1的 1/4MS、1/2MS、
MS和 2MS培养基进行成熟胚萌发培养基筛选 , 以只有等量
蔗糖和琼脂的蒸馏水做对照。每个处理接种胚 20粒 ,重复 3
次。 (24±4)℃条件下 , 每日光照 12h,光强 4 000lx条件下培
养;以下培养条件相同。 1周后统计萌发率 , 萌发率 =(成苗
的胚数 /接种后未污染的胚数)×100%, 1个月后观察胚萌发
情况 ,统计苗长 、苗质量。
1.2　抗生素质量浓度筛选
Kan质量浓度对成熟胚萌发的影响:将剥出的思茅松成
熟胚置于附加 Kan10～ 200mg· L-1的 1/2MS培养基上培养 ,
无抗生素培养基作对照 , 培养 30d后观察胚萌发情况。
羧苄青霉素(Carbenicilin, Carb)对成熟胚萌发的影响:
将剥出的思茅松成熟胚置于附加 Carb100 ～ 900mg· L-1的 1/2
MS培养基上培养 , 无抗生素培养基作对照 , 分别培养 30、 60
d,观察胚萌发后的生长情况。
Carb抑菌浓度筛选:固体 LB培养基中附加 Carb100 ～
900mg· L-1 , 挑取农杆菌 C58单菌落 , 液体 LB培养基中 27
℃、180r/min条件下振荡培养 , 接种针蘸培养液划线培养 , 以
未加 Carb的培养基作对照。 10d后观察 C58生长情况 ,记录
DOI :10.13759/j.cnki.dlxb.2008.02.019
Carb抑菌效果。
1.3　遗传转化体系建立
遗传转化体系建立试验为 4个菌液质量浓度与 6个浸染
时间的正交设计 , 每个处理接种胚 20粒 , 重复 3次。菌液比
色浓度的 OD600值分别为 0.2、0.5、0.8和 1.1,浸染时间分别
为 5、10、15、20、25和 30min。通过上述实验获得了合适的菌
液比色浓度和侵染时间后 ,进行 1、2、3和 4d的共培养时间选
择。具体操作如下:挑取含质粒 pBI121的农杆菌 C58单菌
落 , 接种含 Gen25mg· L-1和 Kan50 mg· L-1的液体 LB培养
基中 , 27℃下 180r/min振荡培养;将培养物于 5 000 r/min离
心 7 ～ 8min,收集菌体 ,用液体 1/2MS培养基将菌体稀释成所
需质量浓度;将剥出的思茅松成熟胚放入灭菌培养皿中 , 倒入
菌液浸没 , 摇晃使成熟胚与农杆菌充分接触;到处理时间时取
出胚 , 置于无菌滤纸上吸去多余的菌液 , 转入 1/2MS培养基上
共培养 1～ 4d, 之后再转到加 Carb600mg· L-1和 Kan40 mg·
L-1的选择性培养基上筛选培养。
1.4　GUS染色检测
GUS基因的瞬时表达活性用组织化学染色法检测 [ 8] :用
GUS染液浸没 , 37℃保温过夜 , 之后用透明液处理 3 h, 取出
在解剖镜下观察 GUS基因表达活性。
遗传转化体系建立时 , 菌液质量浓度与侵染时间正交设
计共 24个处理 ,每处理随机选取 10粒置于选择性培养基上
培养 2d的胚 , 进行 GUS染色 , 重复 3次 , 以统计转化瞬时表
达率;以未转化材料作对照(CK), 将选择性培养基上培养 4、
7和 35d的转化子随机选取 10粒进行 GUS染色 , 观察农杆菌
介导的思茅松成熟胚的转化结果 ,初步判断 GUS基因是否能
在一定时期内有效表达。
2　结果与分析
2.1　思茅松成熟胚无菌萌发结果
为了确定适宜思茅松成熟胚萌发的培养基质量浓度 , 试
验在 1/4MS、1/2MS、MS和 2MS4种不同质量浓度中进行筛
选。成熟胚培养 3 ～ 4d后开始萌发 , 1周后基本形成具有展
开的绿色子叶和红色下胚轴的幼苗。从表 1可以看出 ,对照
是无 MS成分的蔗糖琼脂培养基 ,排除污染后其萌发率最高 ,
为 94.9%, 其余处理成熟胚的萌发率均低于对照;随着培养
基成分质量浓度的升高 , 萌发率逐渐下降 , 但 1个月后苗长和
苗质量 , 除处理 2MS低于对照外 , 其余 3个处理均比对照高。
无菌萌发结果表明 , 虽然对照培养基萌发率最高 , 但在 1/2MS
和 MS培养基上萌发生长的幼苗具有较好的质量 , 其苗高和
苗质量与 1/4MS、2MS及对照培养基差异显著 ,因而认为适宜
成熟胚萌发的基本培养基为 1/2MS培养基。
表 1　MS培养基质量浓度对思茅松成熟胚无菌萌发的影响
处理 萌发率 /%(接种 1周后)
苗长(接种 1月后)
平均
数 /cm
显著性
(α=0.05)
苗质量(接种 1月后)
平均
数 /mg
显著性
(α=0.05)
对照 94.9(56/59) 2.39 c 37 c
1/4MS 89.7(52/58) 2.63 b 47 b
1/2MS 85.0(51/60) 2.87 a 53 a
MS 62.5(35/56) 2.80 ab 53 a
2MS 50.0(29/58) 1.98 d 31 c
　　注:显著性中的字母 a、b、c、d表示在 α=0.05水平上 ,用Duncan氏新复极
差法进行多重比较时差异达显著水平。
2.2　卡那霉素对思茅松成熟胚生长的影响
不同质量浓度卡那霉素对思茅松成熟胚生长具有一定影
响。当 Kan质量浓度为 0时 ,成熟胚萌发后长出主根 , 胚轴伸
长 , 子叶伸展 、绿色;质量浓度为 10、 20、40mg· L-1时 , 成熟胚
可以萌发 , 但没有根出现 ,胚轴伸长 , 子叶黄绿色;质量浓度为
60、80mg· L-1时 , 成熟胚可以萌发 , 没有根出现 , 胚轴伸长较
短 ,子叶黄化 、卷曲、细小, 严重畸形;质量浓度为 100、200mg·
L-1时 ,成熟胚不能萌发 , 子叶微微张开后即发白死亡。从而
看出培养基中没有加 Kan, 成熟胚萌发后能正常生长;随着
Kan质量浓度的升高 , 生长逐渐受到抑制;当质量浓度达到
100mg· L-1以上时 ,成熟胚不能萌发。 Kan质量浓度达到 60
mg· L-1时 , 成熟胚可以萌发但发生严重畸形 , 影响转化子的
后期生长 , 因而认为 40mg· L-1Kan是成熟胚可以耐受的适
宜质量浓度。实验结果表明 ,思茅松成熟胚遗传转化中 Kan
的筛选质量浓度为 40mg· L-1。
2.3　羧变青霉素抑制农杆菌生长的结果及对思茅松成熟胚
生长的影响
在 1/2MS培养基中加入 100 ～ 900mg· L-1的 Carb,菌落
及成熟胚的生长情况见表 2。从表 2可以看出 , 在固体 LB培
养基中加入 100 ～ 900mg· L-1的 Carb, 农杆菌 C58的生长随
着 Carb质量浓度的升高明显受到抑制。 当 Carb质量浓度低
于 300mg· L-1时不能抑制农杆菌生长;当质量浓度高于 600
mg· L-1时 , 农杆菌生长受到显著抑制;当质量浓度高于 800
mg· L-1时 , 农杆菌生长受到完全抑制。从外植体生长状况
来看 ,思茅松成熟胚在附加了不同质量浓度 Carb的培养基
上 ,生长情况接近一致 ,均生长良好 ,平均单株苗质量 46 ～ 57
mg, 平均苗高 2.78 ～ 3.11cm;但 60d后 , 外植体均开始发黑 、
干枯 ,表明外植体不适宜长期在含 Carb的培养基上生长。 综
合考虑抑菌及外植体生长情况 , 采用 800mg· L-1的 Carb作
为抑菌剂 , 在有效抑制农杆菌生长后 , 应停止使用 Carb, 避免
影响外植体后期的生长。
表 2　不同质量浓度羧变青霉素对根癌农杆菌 C58和思茅松成熟胚
生长的影响
Carb质量浓
度 /mg· L-1 根癌农杆菌 C58生长情况
思茅松成熟胚生长情况(30d后)
平均单株
苗长 /cm
平均单株苗
质量 /mg
0 菌落生长良好 ,在平板上形成大量菌落 2.87 53
100 与对照无差异 ,生长良好 2.92 57
200 2.94 49
300 2.79 46
400 只有部分平板上有菌落长出 ,生长较差 3.00 56
500 3.11 56
600 平板上只有零星部分有菌体长出 ,生长差 2.84 52
700 2.78 56
800 平板上无菌体长出 2.94 57
900 2.85 55
　　注:对于不同质量浓度的 Carb(0 ～ 900mg· L-1), 其对思茅松成熟胚的外部形态均表
现为子叶伸展 、绿色 ,胚轴伸长 ,有胚根。
2.4　农杆菌菌液质量浓度 、浸染时间和共培养时间对遗传转
化的影响
制备不同质量质量浓度的 C58菌液 ,分别浸染 5、 10、15、
20、25、30min, 共培养 1d后进行筛选培养 , 2d后 GUS染色检
测结果见表 3。从表 3可以看出 ,随着菌液比色浓度 OD600的
增加 ,瞬时表达率呈先升后降的趋势 , OD
600
为 0.2 ～ 1.1时的平
均瞬时表达率分别为 1.67%、46.67%、63.33%和 15.56%。浸染
11第 2期　　　　　　　　　　　　吴　涛等:思茅松成熟胚无菌萌发及农杆菌介导的遗传转化　　　　　　　
时间是影响遗传转化的重要因素 , 时间过短不能使农杆菌充
分地附着在外植体上;时间过长 ,则会因后期农杆菌过度繁殖
而使外植体缺氧导致软腐 、褐化死亡。实验表明 , 用低质量浓
度的菌液(OD
600
=0.2)浸染 5 ～ 20min不能检测到 GUS基因
的瞬时表达 ,即使浸染时间达到 30min,瞬时表达率只有 6.7%;
而 OD600为 0.8时 ,浸染 15 ～ 30min, 瞬时表达率能达到 70%
左右;当 OD600为 1.1时 , 瞬时表达率迅速下降 ,而且农杆菌过
度生长难以抑制。
表 3　不同处理条件下 GUS瞬时表达结果
处　理
菌液比色浓
度(OD600)
浸染时
间 /min
瞬时表
达率 /%
处　理
菌液比色浓
度(OD600)
浸染时
间 /min
瞬时表
达率 /%
0.2 5 0 0.8 5 50.0
10 0 10 53.3
15 0 15 66.7
20 0 20 73.3
25 3.3 25 70.0
30 6.7 30 66.7
0.5 5 33.3 1.1 5 16.7
10 40.0 10 23.3
15 46.7 15 26.7
20 50.0 20 13.3
25 56.7 25 6.7
30 53.3 30 6.7
　　外植体与农杆菌共培养是外源基因向受体材料转化的过
程 , 适当的共培养时间是能否获得转化体的关键 , 时间过短则
转化不完全 , 很难获得转化子;时间过长则农杆菌太多 ,在后
期筛选培养过程中除菌困难 ,因过量农杆菌的生长导致外植
体变黑 、变软而死亡。实验结果表明 , 共培养时间为 1 ～ 2d
时 , 成熟胚周围刚刚有菌落晕圈出现时 , 瞬时表达率为 60%,
后期除菌也较容易;共培养时间为 3 ～ 4d时 , 成熟胚周围已
有少量菌体形成 , 瞬时表达率为 20%, 但后期筛选培养过程
中很难彻底除菌。因此 , 用 OD600为 0.8的菌液浸染 15 ～ 30min, 共培养 1 ～ 2d可以得到较好的转化结果。
2.5　GUS染色检测转化结果
取筛选培养 4、7和 35d的转化受体进行 GUS染色 ,以未
转化材料作对照(CK), 检测 GUS基因的表达 ,初步判断农杆
菌介导的思茅松成熟胚的转化结果。从图 1、2、 3可以看出 ,
筛选培养第 4、7、35 d的转化子用组织化学染色法都能检测
到 GUS基因的表达 ,初步说明 GUS基因已整合到外植体基因
组内。以本方法筛选出的转化子还需作进一步分子鉴定
(PCR、Southern杂交等)。
图 1　 4d后转化子 GUS基因瞬时表达检测
图 2　 7d后转化子 GUS基因瞬时表达检测
图 3　 35d后转化子 GUS基因瞬时表达检测
3　结论与讨论
适宜成熟胚萌发的基本培养基为 1/2MS培养基;以根癌
农杆菌介导的思茅松成熟胚的遗传转化 , Kan的筛选质量浓
度为 40mg· L-1;Carb的抑菌质量浓度为 800mg· L-1时 , 可
以有效抑制农杆菌生长而不对成熟胚的萌发和生长产生不良
影响 , 但在有效抑制住农杆菌生长后须停止使用 Carb, 避免
影响成熟胚后期生长;遗传转化的适宜条件为菌液比色浓度
OD600为 0.8, 浸染时间 15 ～ 30min, 共培养时间 1～ 2d。
通常 , 植物再生体系的建立是遗传转化的基础 , 但对于还
没有建立再生系统或很难建立再生系统的树种 , 比如松属树
种来说 ,利用合子胚进行转化并成苗也不失为一种获得转基
因植株的方式。贾彩风等 [ 9]以华山松子叶期幼胚为外植体 ,
在 1/2LM培养基上诱导出具有根和茎的完整植株 , 认为虽然
其繁殖系数低 ,但可以作为遗传转化的受体系统 ,对提高华山
松改良效率具有重要意义。本研究进行了思茅松合子胚萌发
以及根癌农杆菌介导成熟胚遗传转化探索 , 获得萌发苗 ,建立
了转化体系 , 并检测到了转化子的 GUS表达 , 研究结果为进
一步转化植株的获得奠定了良好的基础。
根癌农杆菌在感染植物时 , 能将 Ti质粒的 T-DNA转移
进入植物细胞并整合到植物基因组中 , 随基因组进行遗传和
表达。 Ti质粒早期被认为是双子叶植物转化的有(下转 15页)
12 　　　　　　　　　　　东　北　林　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第 36卷
长如高度 、生长量 、叶片形状 、大小等方面与未转因的正常烟
草植株表观上没有任何差异 ,均能正常开花结实。为了获得
转基因的烟草在盐碱胁迫下的表现 , 用 0.2mol/LNa2CO3溶液分别对转基因烟草株系及对照株系进行了处理 , 分别间隔
2d处理 1次 , 每次 100mL,共 2次。结果 5 ～ 7d后烟草下部
成熟叶片均出现水渍状坏死 , 叶片发黄 , 都表现出受胁迫失水
症状。两周后 , 转基因株系逐渐恢复正常 , 而对照植株却表现
出严重的受胁迫失水症状 ,没有恢复 , 如图 4所示 。并且转基
因植株明显有生长的迹象 , 而对照植株没有生长。这表明从
小菊耐盐碱株系中克隆到的类锌指蛋白基因转入烟草中表
现出较强的耐盐碱胁迫能力。因此 , 本研究所获得的小菊类
锌指蛋白基因与耐盐抗性密切相关。
图 4　转基因株系的耐盐碱验证
A.转基因烟草;B.对照。
3　讨论
锌指蛋白转录因子的应用研究在人类医学及动物领域已
经开展了大量工作 ,但在植物上的研究才刚刚起步。目前, 锌
指蛋白基因主要应用于植物抗旱 、耐盐 、抗冻及抗病研究上 ,已
经从拟南芥 [ 5] 、棉花 [ 6] 、水稻 [ 7]等植物上获得了锌指蛋白基因
的克隆 ,并在烟草 [ 4] 、水稻 [ 7]等植物上获得了转基因植物。
本研究利用从耐盐小菊株系上克隆得到的 CmSTZF锌指
蛋白基因构建了表达载体 , 并成功转入烟草植株 。高浓度
Na2CO3溶液胁迫处理后 , 5 ～ 7d时转基因植株和未转基因烟
草植株下部成熟叶片均出现水渍状坏死 , 直到 2周后 ,转基因
植株恢复正常生长 , 未转基因植株仍没有恢复 , 这表明虽然
CmSTZF锌指蛋白基因在 35S启动子作用下为组成型表达 ,
但是这一转录因子作用于下游耐盐胁迫功能基因的表达可能
还需要其它受胁迫诱导类蛋白因子的协同作用 , 共同启动耐
盐胁迫功能基因的表达。因此 , 2周后转基因烟草才表现出
抗盐碱特性。而未转基因烟草虽然有受胁迫诱导类蛋白因子
的表达 ,但是缺乏锌指类蛋白类因子不能启动相关耐盐胁迫
功能基因的表达 , 因此受胁迫后没有恢复生长。
转小菊锌指蛋白基因 CmSTZF烟草在碳酸钠胁迫下表现
出较强的抗逆性。本研究的开展将为该基因的进一步功能研
究和分子育种打下良好基础。
参　考　文　献
[ 1] 　黄越敏 ,胡红红 ,武从庆.一个逆境诱导表达的水稻锌指蛋白基
因的分离和鉴定 [ J] .华中农业大学学报 , 2006, 25(6):581-
585.[ 2] 　KimJC, LeeSH, CheongYH, etal.Anovelcold-inducible
zincfingerproteinfromsoybean, SCOF-1, enhancescoldtoler-
anceintransgenicplants[ J] .PlantJournal, 2001, 25:247-259.
[ 3] 　SuganoS, KaminakaH, RybkaZ, etal.Stress-responsiveZinc
FingerGeneZPT2-3playsaRoleinDroughtToleranceinPetunia
[ J] .PlantJournal, 2003, 36(6):830-841.
[ 4] 　MukhopadhyayA, VijS, TyagiAK.OverexpressionofaZinc-
fingerProteinGenefromRiceConfersTolerancetoCold, Dehydra-
tion, andSaltStressinTransgenicTobacco[ J] .ProcNatlAcad
Sci, 2004(16):6309-6314.
[ 5] 　LippunerV, MarthaS, CharlesS, etal.TwoClasofPlantcDNA
ClonesDiferentialyComplementYeastCalcineurinMutantsandIn-
creaseSaltToleranceofWild-typeYeast[ J].JBiolChem, 1996,
22:12859-12866.[ 6] 　王东 , 杨金水.棉花类耐盐锌指蛋白基因的克隆与结构分析
[ J] .复旦学报:自然科学版 , 2002, 41(1):42-46.
[ 7] 　KongJin, CaoWanhong, ZhangJinsong, etal.TransgenicAnaly-
sisofaSalt-inhibitedOsZFP1GenefromRice[ J] .ActaBotanica
Sinica, 2004, 46(5):573-577.
(上接 12页)效载体 , 近年的研究认为 , Ti质粒同样可以转化
真菌 、裸子植物、单子叶植物 、动物细胞等 [ 10-11] 。通常 ,根癌农
杆菌只能感染植物的损伤部位 ,在植物细胞损伤及修复过程
中 ,植物细胞释放出了一些化学物质 ,其中有些物质(主要是酚
类化合物 、单糖类化合物和氨基酸等)可以诱导 Ti质粒 Vir基
因的表达 [ 12] 。近年的研究表明 , 转化受体是否受到伤害并非
是转化能否成功的必需条件 , 只要存在可以诱导 Vir基因表达
的化学物质即可。王宏芝等 [ 13]将农杆菌液体培养物(添加乙
酰丁香酮)直接加在小麦生长点上 ,结果表明 ,农杆菌的有效侵
染与植物材料的伤害无关 , 转化效率与植株的大小成正比。
Grant[ 14]用无添加物的菌液成功转化辐射松合子胚的子叶。而
本研究没有加 Vir基因活化物质 ,在转化子中也检测到报告基
因 GUS的表达 ,可能的原因是合子胚包含了不同类型的细胞 ,
其内部的营养物质和植物激素比较复杂 [ 15] , 有可能包含诱导Vir表达的化学物质;同时, 处于萌发状态的合子胚具有很强的
分裂能力 ,正处于转化的敏感期 [ 16] ;另外 ,在剥取合子胚的操
作中 ,很可能造成一些微小的创伤。外源基因在植物细胞中的
稳定性和可预见性也是农杆菌介导的遗传转化研究的重要内
容 [ 17] 。本研究得到的转化苗理论上都是嵌合体, 并且木本植
物的生命周期很长 ,外源基因能够在植株体内稳定存在多长时
间并能有效表达 ,有待进一步探讨。
研究中出现的问题 , 如培养基中加入 Kan后成熟胚萌发
但不长根 , 转化后苗生长缓慢 、部分无菌苗子叶扭曲 , 表现出
不同程度的畸形 , 将在下一步研究中解决。另外 , NPTⅡ基因
具有对 Kan、G418和新霉素等抗生素的抗性 , 本研究中只使
用了常用的 Kan作筛选剂 , 另外 2种抗生素的筛选效果 , 转化
子的 PCR检测等内容皆需要进一步研究。
参　考　文　献
[ 1] 　孟梦 ,陈宏伟 ,王达明 , 等.优良的纸浆材树种———思茅松 [ J] .
西南造纸 , 2004, 33(3):13-15.
[ 2] 　张潮巨.思茅松毛虫生物学特性与防治研究 [ J].华东昆虫学
报 , 2002, 11(2):74-78.
[ 3] 　毕嘉勋 ,李付华 ,谢开立 ,等.楚雄市西山公园松小蠹综合法治
理技术示范 [ J] .林业实用技术 , 2006(3):24-26.
[ 4] 　周建 ,李万利 ,罗学刚.木质素生物调控及其对制浆的影响 [ J] .
中华纸业 , 2005, 26(11):60-62.
[ 5] 　陈少瑜 ,陈芳 ,王寅冰 ,等.针叶树种遗传转化研究进展与应用
[ J] .世界林业研究 , 2006, 19(2):12-17.
[ 6] 　江波 ,杨映根 ,郭奕明 ,等.松柏类植物体细胞胚胎发生的研究
进展 [ J] .植物学通报 , 2004, 21(4):495-505.
[ 7] 　魏群.生物工程技术实验指导 [ M] .北京:高等教育出版社 ,
2002.
[ 8] 　ClarkM.S.植物分子生物学实验手册 [ M] .顾红雅, 瞿礼嘉 , 主
译.北京:高等教育出版社 , 1998:332-334.
[ 9] 　贾彩风 ,李悦.华山松胚性愈伤组织诱导与幼胚离体培养 [ J] .
植物学通报 , 2006, 23(2):186-191.
[ 10] 　向阳 ,朱冬雪 ,夏雨 ,等.植物基因工程中Ti质粒的研究与应用
进展 [ J] .生物学通报 , 2003, 38(2):7-9.
[ 11] 　柯海丽 ,谭志琼.根癌农杆菌介导基因转化的研究进展 [ J].广
西热带农业 , 2006(1):49-51.
[ 12] 　王关林 ,方宏筠.植物基因工程原理与技术 [ M] .北京:科学出
版社 , 1998.
[ 13] 　王宏芝 ,魏建华 ,李瑞芬.农杆菌介导的小麦生殖器官的整体
转化 [ J] .中国农业科技导报 , 2004, 6(3):22-26.
[ 14] 　GrantJE, CooperPA, DaleTM.TransgenicPinusradiatefrom
agrobacteriumtumefactionsmediatedtransformationofcotyledons
[ J] .PlantCelReports, 2004, 22:894-902.
[ 15] 　田波 ,许智宏.植物基因工程 [ M] .济南:山东科学技术出版
社 , 1996.
[ 16] 　王关林 ,方宏筠.植物基因工程原理与技术 [ M] .北京:科学出
版社 , 1998.
[ 17] 　谢志兵 ,钟晓红 ,董静洲.农杆菌属介导的植物细胞遗传转化
研究现状 [ J] .生物技术通讯 , 2006, 17(1):101-104.
15第 2期　　　　　　　　　　　　赵　飞等:小菊`类锌指蛋白 基因植物表达载体构建及对烟草的转化