全 文 ：月见草种子的无菌萌发条件
徐永清 1 ,李海燕 2 ,王光海 3 ,胡宝忠3＊　
(1.东北农业大学成栋学院 ,黑龙江哈尔滨 150030;2.东北农业大学大豆研究所 ,黑龙江哈尔滨 150030;3.东北农业大学 ,黑龙江哈尔滨 150030)
摘要　[目的]为月见草的组织培养提供无菌外植体。 [方法]以月见草种子为材料 ,经过不同的表面除菌方法处理后 ,接种于不同的培
养基上 ,培养 10d后统计种苗的污染率、发芽率。 [结果]经 70℃热处理 48h后 ,用 70%乙醇(40s)+0.1%HgCl2(10min)+吐温 80进
行表面除菌效果最好 ,污染率最低;在VW+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.05%AC培养基中培养 ,月见草种子的萌发率最高 ,达到
93%,萌发后幼苗的生长状况最优。 [结论 ]该试验建立了优质 、高效的月见草种子无菌萌发体系 ,为月见草资源的持续利用奠定了
基础。
关键词　月见草;无菌萌发;发芽率
中图分类号　Q949.95　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)33-18832-03
AsepticGerminationConditionofOenotherabiennisL.Seed
XUYong-qingetal　(ChengdongCollege, NortheastAgriculturalUniversity, Harbin, Heilongjiang150030)
Abstract　[ Objective] ThestudyaimedtoprovideaxenicexplantsfortissuecultureofOenotherabiennisL.[Method] OenotherabiennisL.seeds
wereinoculatedwithdifferentculturemediumafterbeingdegermedwithdifferentmethods, andthecontaminationrateandgerminationratewere
calculated10 dayslater.[ Result]Thedegermingefectof70%ethanol(40s)+ 0.1%HgCl2(10min)+Tween80onthesurfaceofexplantsafterbeingheatedat70 ℃for48hwasthebestandthemediumwithVW+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.05%ACinwastheoptimum
culturemedium, culturedinwhichthegerminationrateofOenotherabiennisL.seedreached93%andthegrowthconditionofseedlingwasthe
best.[ Conclusion] Thegoodandefectiveasepticgerminationsystemwasestablishedinthisstudy, whichwouldprovidebasisforthepersistentu-
tilizationofOenotherabiennisL..
KeywordsOenotherabiennisL.;Asepticgermination;Germinationefficiency
作者简介　徐永清(1977-),女 ,黑龙江鹤岗人 ,博士 , 讲师 ,从事植物
生殖生物学与分子生物学方面的研究, ＊通讯作者 ,教授 ,
博导, E-mail:yuti8227@yahoo.com.cn。
收稿日期　2010-08-05
　　月见草(OenotherabiennisL.)为柳叶菜科月见草属植
物 ,原产于南北美洲 ,约 200种。成熟干燥的月见草种子极
小(约 2 800 μg/颗),呈黑褐色 ,形状不规则 ,表面有尖 [ 1] 。
月见草种子富含 γ-亚麻酸(GLA),对心脑血管病 、糖尿病 、关
节炎 、肝炎及癌症等疾病的治疗效果已为医学实践证实 ,随
着医学研究的深入 ,对其药理作用的拓展日趋增多 ,是非常
有价值的药用植物 [ 1-3] 。
月见草野生习性强 ,其种子发芽能力低 ,存在次生休眠
和种皮不透水性休眠 ,对长日和光周期要求严格 ,影响了发
芽率和人工种植速度 ,制约其大规模的推广 ,目前仅在东北
部分地区有一定面积的栽培。因此 ,仅依靠月见草野生资源
远远不能满足市场需求 ,过度地开发必然造成生态环境的极
大破坏 ,这也是药用植物开发过程中普遍存在的矛盾 。前人
先后采用高压静电技术处理等手段提高月见草种子的萌发
率 ,取得了一定的效果 [ 4-5] ,但仍需提高其培育效率。鉴于
此 ,笔者在无菌条件下 ,用月见草种子培养植株 ,以期为月见
草的组织培养提供良好的外植体 ,同时研究月见草种子的发
育特性 ,以期为更好的持续利用该药物资源 ,改善我国月见
草生产水平和栽培方式提供参考。
1　材料与方法
1.1　材料　月见草种子 , 2009年 7月采自黑龙江省尚志市
帽儿山 ,经东北农业大学桂明珠教授鉴定。
1.2　方法
1.2.1　除菌方法筛选。选取籽粒饱满种子 ,先用自来水冲洗
10 min或经干热 70℃处理 48h,冷却后再冲洗 ,超净工作台
无菌条件下用 70%酒精浸泡 40 s,再用无菌水冲洗 1次后 ,
加入表面除菌剂(表 1),震荡除菌时间 10min,用无菌水冲洗
4次后接种 ,接种培养基为:MS+3%蔗糖 +0.8%琼脂 , pH
值为 5.8。每瓶接种 20粒 ,每处理每次接种 5瓶 ,重复 2次。
采用光照培养 ,每天光照 12 h,光照强度为 2 000 lx,温度为
(25±2)℃。观察除菌效果 ,主要调查指标为污染率。污染
率(%)=播种 10d污染种子数 /播种数 ×100
1.2.2　种子萌发条件的筛选。以基本培养基 、生长素和细
胞分裂素为因素 ,设计正交试验 ,其中基本培养基为 MS、
1/2MS、VW,生长素为 NAA,细胞分裂素为 6-BA,各成分浓度
组合见表 2。
培养基其他条件为:3%蔗糖 , 0.8%琼脂 , 0.05%活性
炭 , pH值为 5.8。每瓶接种 60粒 ,每处理每次接种 5瓶。
此外 ,还考察不同活性炭浓度对种子萌发的影响。活性
炭浓度分别为 0、0.01%、0.05%、0.10%,每瓶 50粒 ,重复
2次。
采用光照培养 ,每天光照 12 h,光照强度 2 000 lx,温度
(25±2)℃,主要调查指标为发芽率。
发芽率(%)=播种 10 d发芽粒数 /播种数 ×100
2　结果与分析
2.1　除菌效果观察　经 10 d培养后统计各除菌组合的污染
率(表 3),结果表明 ,未经热处理的各组合 ,种子污染率极
高 ,均达到 85%以上;经热处理后污染率很低 ,可见热处理起
到除菌作用 。除菌效果最好的为处理 7,即 70℃热处理 48 h
+70%乙醇 +0.1%HgCl2 +吐温 80(数滴)。成熟的月见草
种子形状各异 ,大部分为楔形 ,通过对月见草种子进行扫描
电镜观察(图 1、2),发现月见草种皮表面致密光滑 ,种子萌
发时的高污染率可能是种子内部有真菌感染导致的。
2.2　基本培养基和植物生长调节剂(PGR)对种子萌发的影
响　采用 La正交表 ,探讨了培养基(A)、细胞分裂素(B)和
生长素(C)3个因素对月见草种子萌发的影响(表 4)。以反
责任编辑　刘群燕　责任校对　况玲玲安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(33):18832-18834
映种子萌发情况的发芽率为指标 ,可知 2号培养基最适于种
子的萌发 ,即 VW培养基添加 1.0 mg/L6-BA和 0.5 mg/L
NAA,在此条件下月见草种子发芽率达到 93.7%。 3种因素
对种子萌发的影响为细胞分裂素(B)>培养基(A)>生长
素(C)。
图 1　月见草种子表皮(A)、表皮细胞(B)特征
Fig.1　Characteristicofepiderm(A)andepidermcel(B)ofOenotherabiennisL.seed
表 1　除菌剂组合
Table1　Formulaofthegermifuge
编号
No.
处理组合
Treatmentcombination
1 70%乙醇+10%NaClO
2 70%乙醇+10%NaClO+吐温 80
3 70%乙醇+0.1%HgCl2
4 70%乙醇+0.1%HgCl2 +吐温 80
5 70%乙醇+20%H2O2
6 70℃热处理 +70%乙醇+10%NaClO+吐温 80
7 70℃热处理 +70%乙醇+0.1%HgCl2 +吐温 80
表 2　正交试验设计
Table2　Designoftheorthogonaltest
水平
Level
基本培养
Medium
细胞分裂素∥mg/L
Cytokinin
生长素∥mg/L
Auxin
1 VW 0 0.0
2
1
2
MS 1.0 0.5
3 MS 1.5 1.0
表 3　不同除菌条件除菌效果
Table3　Sterilizingefectofdiferentdisposalcondifionns
编号
No.
接种数
Inoculationamount
污染率∥%
Contaimationrate
1 200 95.0
2 200 92.5
3 200 93.0
4 200 85.0
5 200 96.0
6 200 12.5
7 200 0.0
2.3　不同活性炭浓度对种子萌芽的影响　以 VW+1.0mg/L
6-BA+0.5mg/LNAA为基本培养基 ,考察活性炭的添加对
种子萌发的作用的影响(表 5)。由表 5可知 ,不同浓度活性
炭对种子的萌发影响十分明显 ,在 0.05%浓度条件下 ,种子
的发芽势和发芽率明显高于其他浓度条件 ,尤其是发芽势的
水平。从种苗的生长情况看 , 0.05%活性炭处理最优 ,因此
月见草种子萌发的最佳的活性炭浓度为 0.05%。
表 4　正交试验结果
Table4　Resultsoftheorthogonaltest
处理号
Treatmernt
No.
A B C
发芽率∥%
Germination
rate
1 1 1 1 23.33
2 1 2 2 93.67
3 1 3 3 75.67
4 2 1 2 40.67
5 2 2 3 55.00
6 2 3 1 61.33
7 3 1 3 45.33
8 3 2 1 81.00
9 3 3 2 66.00
K1 192.67 109.33 165.66
K2 157.00 229.67 200.34
K3 192.67 137.00 176.00
R 35.67 120.34 34.68
　注:接种数为 300。
　Note:Inoculationamountis300.
表 5　活性炭对月见草种子萌发的影响
Talbe5　Theefectofactivecarbononseedgermination
活性炭浓度∥%
Concentration
ofacive
carbon
发芽势∥%
Germination
potential
发芽率∥%
Germination
rate
种苗生长状况
Growth
conditionof
seedling
0.00 34 68 胚轴浅红,细弱
0.01 48 74 胚轴浅绿,健壮
0.05 79 93 胚轴浅绿,健壮
0.10 55 82 胚轴深绿,矮小
　注:接种数为 100。
　Note:Inoculationamountis100.
3　结论与讨论
在最初的种子萌发试验中 ,依据其他植物的发芽试验经
验 ,采用 MS培养基 ,不添加任何植物生长调节物质 ,结果种
1883338卷 33期　　　　　　　　　　　　　　　　徐永清等　月见草种子的无菌萌发条件
子的发芽率低于 20%。在排除种子质量问题造成发芽率较
低后 ,对培养基 、生长调节物质和活性炭浓度等影响因素进
行筛选 ,结果发现 ,适量的盐浓度和植物生长调节剂对种子
萌发起到一定的促进作用 ,而活性碳的含量对种子的萌发状
态起决定性作用。
活性炭在月见草种子萌发过程中的作用可能有 3点:①
在种子萌发时分泌有害的物质抑制萌发 ,有害物被活性碳吸
附 ,从而提高发芽势和发芽率。添加不同量的活性炭 ,种子
的发芽势和发芽率都有不同水平的提高 ,可以证实这一点。
此外 ,未加活性炭的试验组 ,幼苗胚轴出现不同程度的浅红
色 ,而正常的幼苗胚轴应为浅绿色 ,这一现象同时也出现在
其他诱导试验中 ,可以初步认为 ,颜色的改变是对不良条件
的 1种应激反应;②使培养基的大量元素与微量元素的含量
得以平衡 。在对基本培养基 N、P、K水平比较发现 , VW培养
基的 P水平要高于 MS,但其中微量元素的水平要低于 MS。
活性炭对 P有一定的吸附作用 [ 6] ,活性炭释放到培养基中的
某些杂质平衡了大量元素与微量元素的比例 ,从而对对培养
体发生影响 [ 7] ,因而一定量的活性炭的加入可补上微量元素
的不足 ,而高浓度的活性炭则显出其吸附作用的负作用 ,使
萌发率有所降低;③活性炭加到培养基中 ,使培养基颜色变
暗 ,从而更接近于自然土壤的黑暗条件。
无菌条件下种子发育形成的植株 ,可以为植物的体外组
织培养提供良好的外植体 ,还可以用其研究月见草种子的发
育特性 ,这为月见草药物资源更好的持续利用奠定了理论与
实践基础。
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(上接第 18831页)
各种养料的源泉之一 ,也是土壤资源利用的核心问题 。土壤
中的氮 、磷营养元素在土壤中的存在形态 ,尤其是氮元素 ,大
部分都是与土壤有机质结合的。此外土壤有机质还是土壤
吸附缓冲作用的基础之一 ,可以改善土壤的物理性质 ,对土
壤保水 、保肥也有着重要的意义。但是 ,从叶赫近年来土壤
资源利用的情况看 ,土壤有机质含量逐年减少 ,土壤潜在肥
力低。叶赫从 1992年开始 ,在农户中推广测土配方施肥技
术。测土配方施肥是以土壤测试和肥料田间试验为基础 ,根
据作物需肥规律 、土壤供肥性能和肥料效应 ,在合理施用有
机肥料的基础上 ,提出氮 、磷 、钾及中 、微量元素等肥料的施
用数量 、施肥时期和施用方法。这种技术的广泛推广 ,必须
要从当地土壤资源的基本特点入手 ,提出合理的施肥方法。
根据叶赫土壤资源利用中存在的问题 ,今后可以采取多种措
施 ,如增施有机肥 ,保持 、恢复和提高土壤肥力 ,这是发展当
地农业生产的当务之急。
4　结语　
叶赫镇土壤类型比较单一 ,受气温和降水的影响 ,区内
土壤大多呈中性或微酸性 ,因此在农业生产中适宜玉米 、高
粱 、大豆的生长。种植业应以粮食为主 ,适当多种一些大豆 ,
具体种植比例可以考虑:玉米 、高粱占 65%,大豆占 20%,谷
子占 10%,其他占 5%。另外 ,由于土壤有机质的减少 ,在农
业生产中应该合理施用化肥农药 ,推广测土配方施肥技术 ,
促进叶赫农业生产的发展。
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18834 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年