全 文 ：藏药大花绿绒蒿内生真菌次级代谢抗
肿瘤细胞活性初步研究
普布多吉１　蒋思萍１　徐爱国１　刘岚２　陈彬１　普布卓玛３
１．西藏自治区高原生物研究所，西藏　拉萨　８５０００１；
２．中山大学海洋学院，广东　广州５１０２７５
３．西藏自治区山南市浪卡则县人民医院，西藏　山南　８５１１００
摘　要：大花绿绒蒿是藏药中的一味常用药，药材活株中内生真菌丰富，文章研究了４０株来自大花绿绒
蒿的内生真菌的次级代谢产物抗肿瘤细胞的活性。实验采取了固态发酵方法，并通过乙酸乙酯－甲醇
－氯仿混合溶剂提取了内生真菌的次级代谢产物，采用 ＭＴＴ法研究了内生真菌次级代谢产物对乳腺
癌肿瘤细胞株 ＭＤＡ－ＭＢ－４３５进行了抑制活性试验。结果表明：抑制率大于８０％内生菌菌株有１７
株，抑制率介于５０％～８０％之间的内生菌菌株１３株，抑制率小于５０％的内生菌菌株有１０株；抑制率大
于８０％内生真菌菌株有９个种属。实验表明，大多数大花绿绒蒿内生真菌具有良好的抗乳腺癌肿瘤
活性。
关键词：大花绿绒蒿，内生真菌，次级代谢，抗肿瘤活性
　　植物内生真菌作为能够通过次级代谢而产出与宿
主相似、相同的药用成分，最广为学术界所知的是上世
纪９０年代从短叶红豆杉分离的内生真菌能产生紫杉
醇的事件。紫杉醇为二萜类化合物，在世界上每一种
红豆杉中都有发现。１９９３年，美国蒙大拿州立大学的
植物病理学家Ｓｔｒｏｂｅｌ和化学家Ｓｔｉｅｒｌｅ在短叶红豆杉
的韧皮部中发现了一种内生真菌，它能够自主产生紫
杉醇，在这种真菌的培养液中，通过质谱的推断及标
记，均证明了紫杉醇的存在，为紫杉醇的生产提供了一
条新的途径。随后的几年里，人们陆续从不同植物的
内生真菌中均发现能产紫杉醇的内生真菌，证实了能
够产生紫杉醇的内生真菌分布于全球，并且不只局限
于红豆杉的内生菌中。从此，国内外掀起了从植物内
生真菌发现新的药物先导化合物的热潮［１－７］。
大花绿绒蒿是重要藏药毛瓣绿绒蒿的代用药，具
有清热解毒、利尿、消炎、止痛、镇咳功效，用于肺炎、肝
炎、咳喘等疾病的治疗。因人工种植不易，大花绿绒蒿
作为毛瓣绿绒蒿代用药成为了濒危植物［８，９］。我们研
究了大花绿绒蒿的内生真菌，并得到了丰富的不同种
属的菌株。本文研究了４０株内生真菌的次级代谢产
物抗肿瘤细胞株 ＭＤＡ－ＭＢ－４３５的活性。
１　实验部分
１．１　实验材料、试剂、仪器和耗材
１．１．１　待试菌株。分离自大花绿绒蒿活株的４０株内
生真菌，保藏在西藏自治区高原生物研究所种质资源
中心真菌资源库。
１．１．２　肿瘤细胞株。乳腺癌肿瘤细胞株 ＭＤＡ－ＭＢ
－４３５为中山大学医学院袁洁教授课题组提供，保藏
于中山大学医学院肿瘤中心。
１．１．３　实验仪器、试剂和耗材。实验仪器：二氧化碳
培养箱（美国热电），酶标仪（ＭｉｋｓＣａｎ　３Ｋ，美国热
电），高压灭菌锅（上海申安），超净工作台（苏州苏洁净
化）。
实验试剂和耗材：普通大米（市售），氯化钠（天津
化学试剂厂，分析纯），小牛血清（Ｓｉｇｍａ），超纯水（自
制）。９６孔板（广州康龙生物），移液器（Ｅｐｅｎｄｏｒｆ），枪
头，三角瓶。
１．２　实验方法
１．２．１　菌株的发酵。发酵培养基：采用大米固体发酵
培养基，制作方法：称取５０ｇ大米放置在１Ｌ的三角
瓶中，加入８０ｍＬ的０．３％的 ＮａＣｌ溶液，加上棉塞，
放置在灭菌锅中１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。冷却备用。
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《西藏科技》２０１６年７期（总第２８０期）　　　　　　　　　　　　　　　　　　动植物研究
发酵方法：静置发酵。在无菌操作条件下，往大米
固体培养基中加入５～１０ｍＬ种子培养液。放置在恒
温培养箱中２５℃下培养２８天，加入甲醇－氯仿－乙
酸乙酯混合溶液（ｖ／ｖ／ｖ＝１∶１∶１）２００ｍＬ，终止
发酵。
１．２．２　菌株次级代谢产物的提取。继续加入甲醇－
氯仿－乙酸乙酯混合溶液（体积比１∶１∶１），浸提３～
４次，４０℃下旋转蒸发仪浓缩至只剩下水和浸膏，合并
所有浓缩液，使用乙酸乙酯等体积萃取３～４遍，分别
浓缩得到每株内生真菌的乙酸乙酯萃取的提取物。
１．２．３　ＭＴＴ法测定内生真菌次级代谢产物的抗肿
瘤活性。采用 ＭＴＴ法［１０］测定内生真菌次级代谢产
物对乳腺癌肿瘤细胞株 ＭＤＡ－ＭＢ－４３５的抑制活
性。每个内生真菌次级代谢产物的样品浓度均配置为
１００ｕｇ／ｍＬ。
２．实验结果与分析
２．１　抗肿瘤活性的结果
抗乳腺癌肿瘤细胞株 ＭＤＡ－ＭＢ－４３５的实验表
明，大花绿绒蒿内生真菌具有较高比例的抑制乳腺癌细
胞株 ＭＤＡ－ＭＢ－４３５的菌株（见表１），有多达１７株内
生真菌粗提物对乳腺癌细胞株 ＭＤＡ－ＭＢ－４３５抑制
率超过８０％，占所有待试菌株的４２．５％（见图１）。
　　表１ 大花绿绒蒿内生真菌次级代谢粗提物对乳腺癌细胞株 ＭＤＡ－ＭＢ－４３５的抑制率
序号 菌株编号 平均抑制率（％） 标准差（％）
１ ＤＨ１　 ７３．３６％ ７．４８％
２ ＤＨ２　 ４９．５０％ ４．１２％
３ ＤＨ３　 １２．０５％ ８．２６％
４ ＤＨ４　 ８８．２５％ １．８７％
５ ＤＨ５　 ８３．０４％ ３．７８％
６ ＤＨ６　 ６０．４３％ ３．５８％
７ ＤＨ７　 ８６．０６％ ２．７０％
８ ＤＨ８　 ７８．８０％ ４．９７％
９ ＤＨ９　 ３４．０７％ １１．９６％
１０ ＤＨ１０　 ８０．７６％ ３．３８％
１１ ＤＨ１１　 ６９．４９％ ２．５０％
１２ ＤＨ１２　 ４１．３８％ １．９６％
１３ ＤＨ１３　 ３２．１６％ ８．７５％
１４ ＤＨ１４　 ８７．５９％ ０．１６％
１５ ＤＨ１５　 ５１．６０％ ８．１１％
１６ ＤＨ１６　 ５６．１４％ ２．４０％
１７ ＤＨ１７　 ８８．２９％ ０．８９％
１８ ＤＨ１８　 ７４．４７％ ２．３１％
１９ ＤＨ１９　 ８８．７９％ ０．４３％
２０ ＤＨ２０　 ３９．５９％ ２．３８％
２１ ＤＨ２１　 ８８．６７％ ０．７９％
２２ ＤＨ２２　 ４５．５２％ １０．２３％
２３ ＤＨ２３　 ８９．４９％ １．０７％
２４ ＤＨ２４　 ８６．５７％ １．５１％
２５ ＤＨ２５　 ７１．１３％ １．９８％
２６ ＤＨ２６　 ６９．０１％ １．９７％
２７ ＤＨ２７　 ８３．５１％ ４．４９％
２８ ＤＨ２８　 ２３．２６％ ４．５８％
２９ ＤＨ２９　 ８７．０２％ ０．８６％
３０ ＤＨ３０　 ８５．５３％ ２．０９％
３１ ＤＨ３１　 ８８．３６％ ０．９１％
３２ ＤＨ３２　 ８６．２７％ ２．１２％
３３ ＤＨ３３　 ７７．２９％ ３．７６％
３４ ＤＨ３４　 ７２．０８％ １．４３％
３５ ＤＨ３５　 ２４．１４％ ４．０８％
３６ ＤＨ３６　 ８９．４２％ ０．８８％
３７ ＤＨ３７　 ７１．７７％ １．５５％
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３８ ＤＨ３８　 ７８．０９％ ４．７７％
３９ ＤＨ３９　 ８０．７５％ ３．７４％
４０ ＤＨ４０　 ２７．３２％ ６．５９％
　　此外，抑制率超过５０％的菌株数量多达３０株，占
所有待试菌株的７５％。可见，内生真菌与宿主在长期
的协同进化过程中，大多数具有分泌可以抑制肿瘤细
胞活性的化学物质。
图１　大花绿绒蒿内生真菌次级代谢产物
抗肿瘤的活性结果
２．２　抗肿瘤活性菌株的分析
我们对鉴定到种属的２２株内生真菌进行了分析，
发现不同种属的内生真菌表现为各异的抑制乳腺癌肿
瘤细胞的活性（表２）。２２株内生真菌分属于１５个种
属，其中抑制率大于８０％的种属为９个属，占所有种
属的６０％；抑制率介于７０％～８０％之间的种属有２个
属；介于５０％～６０％之间的种属有１个属；没有明显
活性的种属有３个属。
表２ 大花绿绒蒿不同种属内生真菌次级代谢抑制乳腺癌细胞株 ＭＤＡ－ＭＢ－４３５的活性分析
序号 种属 抑制活性（％）
１ Ｍｕｃｏｒ　ｓｐ． ＞８０
２ Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ　ｓｐ． ＞８０
３ Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓ　ｓｐ． ＞８０
４ Ｇｉｂｂｅｒｅｌａ　ｓｐ． ＞８０
５ Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｐ． ＞８０
６ Ｌｅｐｔｏｄｏｎｔｉｄｉｕｍ　ｓｐ． ＞８０
７ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｕｎｇｕｓ ＞８０
８ Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ　ｓｐ． ＞８０
９ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ　ｓｐ． ＞８０
１０ Ｂｅａｕｖｅｒｉａｓｐ． ＞７０
１１ Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ． ＞７０
１２ Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｓｐ． ＞５０
１３ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ　ｓｐ． ＜３０
１４ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｐ． ＜３０
１５ Ｇｅｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ． ＜３０
３　讨论与结论
通过查阅文献，分析比较大花绿绒蒿１５个属的内
生真菌，发现，赤霉菌属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌａ　ｓｐ．）、镰刀菌属
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｐ．）、青霉菌属（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ　ｓｐ．）和白僵菌
属（Ｂｅａｕｖｅｒｉａｓｐ．）这四种菌属通常都能分泌具有细胞
毒活性的次级代谢产物，而另外的７个种属则没有报
导能分泌明显的具有细胞毒活性的次级代谢产物。可
能是这些内生真菌与宿主大花绿绒蒿在长期的协同进
化过程中，获取了或激活了能分泌细胞毒活性次级代
谢产物的代谢通路（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｐａｔｈｗａｙｓ）。
初步的研究表明，大多数大花绿绒蒿内生真菌的
次级代谢产物具有良好的抑制乳腺癌肿瘤细胞株
ＭＤＡ－ＭＢ－４３５的活性，为了更好的利用和发掘大
花绿绒蒿内生真菌的价值，我们将要进一步研究他们
次级代谢产物对抑菌、心血管疾病、抗肺结核等方面的
活性，并针对具有较强的抗乳腺癌细胞株活性的非常
见的内生真菌菌株，进一步研究其次级代谢产物，寻找
新的药物先导化合物。
参考文献
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ｂｏｓｔｒｙｃｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ａ－
ｇａｉｎｓｔ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｓ．Ｍａｒｉｎｅ　Ｄｒｕｇｓ ，２０１２，１０：９３２
－９５２．
编校　
檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱
洛桑次仁
（上接６４页）Ｐ（ｒ）／ｒ曲线上斜率（微分信号ｄＰ／ｄｒ）的
突然增大处。基本上所有噪声起伏也符合这个特征，
同样的条件被有近距离的大气强散射和气溶胶团所满
足，因此，需要找到云回波有别于噪声脉冲和大气气溶
胶散射的其它特征，才有可能正确识别云信号。从图
２、图３、图４中看到云回波的一个共同点：一是单峰或
多峰脉冲信号；二是相对幅度高；三是斜率梯度大，上
升时间短；四是具有时间相关性；五是脉冲宽度介于气
溶胶散射峰和噪声脉冲二者之间；六是云越高，回波幅
度越小，噪声起伏越大。
３　小结
３．１　利用小波变换的方法对原信号降噪后，原信号没
有任何的变化，还是保留了原始的信号。
３．２　小波降噪求得斜率、拟合后，可以分辨出云顶、云
底的高度以及云层数。
３．３　对比分析激光雷达以及毫米波雷达测云情况，结
果表明激光雷达和毫米波雷达都能探测到云，但毫米
波只能探测弱云。
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