全 文 ： 收稿日期：2007-04-03
基金项目：福建省重大科技计划项目（99-I-1）、（2000I001）资助
作者简介：章宁（1964-），男，安徽枞阳人，副研究员，学士，从事植物遗传育种研究。

应用 RAPD 技术辅助蝴蝶兰辐射育种
章 宁，苏明华，徐夙侠，林清洪
(福建省亚热带植物研究所，福建 厦门 361006)

摘 要：应用 RAPD技术对蝴蝶兰辐射诱变苗进行分析。结果表明，对蝴蝶兰 5种不同形态的诱变苗和对照
苗进行 PCR扩增，13个引物所产生的 RAPD谱带大小为 200～3 000bp，共扩增 77条带，多态性带 61条，多
态率 79.22%。13个引物平均扩增的带数为 5.92，引物 S0036最多，为 9条带。比较诱变苗与对照苗谱带，两
者有差异，表明诱变苗是由基因突变引起。
关健词：蝴蝶兰；RAPD分析；辐射诱变
中图分类号：S603.6 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2007)03-0019-04
Radioactive Breeding of Phalaenopsis spp. Using RAPD Method
ZHANG Ning, SU Ming-hua, XU Su-xia, LIN Qing-hong
(Fujian Institute of Subtropical Botany, Xiamen 361006, Fujian China)

Abstract: Using RAPD method, radiation-induced mutant seedlings of Phalaenopsis were studied.
Five mutant seedlings of different formation and the control were amplified by PCR method, 13
arbitrary primers amplified 77 bands ranging from 200bp to 3000bp with an average of 5.92 bands
per primer, among them 61 bands were polymerbhic and the percentage was 79.22%. The most
bands were obtained from primer S0036. Compared the bands of mutant seedlings with those of
control, there were differences among them and the results indicated that mutant seedlings were
caused by gene mutation.
Key words: Phalaenopsis spp.; RAPD analysis; radioactive breeding

蝴蝶兰形态优美、色彩艳丽、花期持久，在热带兰中素有“兰花皇后”之美称。目前蝴蝶兰育种
主要采用杂交方法，辐射育种少有报道，仅见强继业等[1,2]采用 60Co-γ射线对蝴蝶兰进行试验。我们通
过辐射育种方法，已培育出诱变苗 203株，但尚未进行鉴定。
近年来，分子标记辅助育种取得了较大进展。随机引物扩增 DNA多态性技术（RAPD）因具有灵
敏度高、速度快、可对整个基因组合进行标记，且费用和技术难度较低而得到日益广泛的应用。突变
体是基因组少数位点发生突变的结果，通过形态观察和同工酶分析很难完全鉴定突变体[3]。利用 RAPD
技术检测辐射育种已有报道，如百合[4,5]、香粳稻[6]、番木瓜[7]、小麦[8]等。RAPD技术已成功地应用于
蝴蝶兰遗传多样性分析[9,10]，但未见有应用于辐射遗传育种的报道。本文通过 RAPD 技术对蝴蝶兰诱
变苗进行鉴定，旨在探明诱变苗是否由基因突变引起。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试蝴蝶兰（Phalaenopsis spp.）为白花品种，取 5株辐射诱变苗，并设对照。试材取自福建省亚
热带植物研究所组培室。

2007,36(3):19-22.
Subtropical Plant Science
第 36卷

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1.2 方法
1.2.1 DNA提取 蝴蝶兰 DNA提取采用十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法。取 0.5g叶片冰冻，用液
氮研磨成粉，加入 65℃预热 CTAB 1ml 提取液，再加入 1.5%硫基乙醇，混匀后 65℃水浴 1h，然后
10 000r/min 离心 10min；取上清液，加入氯仿﹕异戊醇（24﹕1）抽提 10min，然后 12 000r/min 离心
10min，重复 1次；取上清液至新的 Eppendorf管中，加入 1.2体积异丙醇，－20℃冰箱放置 10min后，
12 000r/min离心 10min，弃上清液，沉淀为 DNA；将沉淀 DNA先后用 75%、100%乙醇洗涤一次，40～
50℃干燥，用 50ml去离子水溶解，4℃保存。琼脂糖凝胶电泳检测 DNA。
1.2.2 PCR反应条件 25ml反应液中含：Tag(5U/µl) 0.4µl，10×Baffer（含 Tris-HCI 100mM pH8.3，
KCl 500mM，MgCl2 15mM）2.5µl，dNTP(2.5mM)2µl，引物（20µM）1µl，模板 DNA 1.5µl，ddH2O 17.6µl。
扩增反应程序为 94℃预变性 3min；然后经如下 45次循环：94℃变性 45s，38℃退火 1min，72℃
延伸 1.5min，最后 72℃延伸 10min。
1.2.3 PCR反应产物电泳 琼脂糖凝胶配制：25ml 0.5×TBE电液缓冲液，含 1%琼脂糖，经加热溶解
后，再加入 5µl EB(0.5µl/ml)。点样 20µl反应液 + 5µl GLB（甘油上样缓冲液），电压 100V，电泳约 45min。
1.3 数据分析
据 Nei等的相似率计算公式进行分析，以 PCR产物电泳后在凝胶的某一多态位置上有 DNA条带
为“1”，无条带为“0”。采用 RAPD软件计算样品间的遗传距离，根据 Neighbor joining遗传距离矩阵
构建系统聚类文件，用 treeview软件根据系统聚类软件绘制系统聚类图。
有关计算公式如下：（1）遗传距离（GD）= 1－GS；（2）相似系数（GS）= 2Nxy/(Nx＋Ny)×100%。
其中，Nx为样品 x具有的 DNA扩增条带数，Ny为样品 y具有的 DNA扩增条带数，Nxy为样品 x和样
品 y共有的扩增条带数。
2 结果与分析
2.1 扩增结果
根据明凤等[10]所采用的引物，取 13种引
物对蝴蝶兰诱变苗进行扩增。所产生的 RAPD
谱带大小为 200～3 000bp，共扩增 77条谱带
（图版Ⅰ，1～13），多态性带 61条，多态率
为 79.22%；13个引物平均扩增的带数为 5.92，
引物 S0036最多，为 9条带（表 1）。
比较诱变苗与对照苗的谱带，可以发现其
间存在差异，其突变可分为 3种类型：（1）突
变苗的条带比亲本少（图版Ⅰ-1）；（2）突变
苗的条带比亲本多（图版Ⅰ-4、-6）；（3）突
变苗比亲本原有的条带少，但又多出了亲本没
有的条带（图版Ⅰ-5）。表明诱变苗的变异是基因突变引起。
2.2 遗传距离
根据 RAPD带的统计结果，计算各诱变苗
和对照苗之间的遗传距离（表 2）。结果表明，
对照苗及 5 种诱变苗间遗传距离在 0.2513～
1.0186之间。其中，对照与诱变苗 6号的遗传
距离最小，为 0.2513；对照与诱变苗 1号次之，
为 0.4055；诱变苗中 2号与 5号的遗传距离最
表 1 随机引物及其扩增带数
序号 引物名称 序列(5`-3`) 扩增带数 具多态性的带
1 S0008 GTCCACACGG 8 5
2 S0010 CTGATGGGAC 7 6
3 S0013 TTCCCCCGCT 7 7
4 S0016 TTTGCCCGGA 6 5
5 S0022 TGCCGAGCTG 7 4
6 S0028 GTGACGTAAG 6 6
7 S0029 GGGTAACGCC 6 5
8 S0030 GTGATCGCAG 2 0
9 S0031 CAATCGCCGT 5 5
10 S0036 AGCCAGCGAA 9 7
11 S0037 CACCGCTTGT 5 3
12 S0038 AGGTGACCGA 5 3
13 S0039 CAAACGTCGG 4 4
合计 77 61
表 2 5种诱变苗和对照苗间的遗传距离及遗传相似度
pop ID 1 2 3 4 5 6
1 **** 0.4722 0.6667 0.5278 0.6667 0.7222
2 0.7503 **** 0.4722 0.6667 0.3611 0.4722
3 0.4055 0.7503 **** 0.5833 0.6111 0.7778
4 0.6391 0.4055 0.5390 **** 0.4167 0.5278
5 0.4055 1.0186 0.4925 0.8755 **** 0.4444
6 0.3254 0.7503 0.2513 0.6391 0.8109 ****
注：左下部分为遗传距离，右上部分为相似度。3为对照苗。
第 3期 章宁,等：应用 RAPD技术辅助蝴蝶兰辐射育种

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远，为 1.0186。
2.3 聚类分析
聚类分析结果表明（图 1），
对照苗和 5种诱变苗分为 2类，
诱变苗 5自成一类，其它 4个诱
变苗和对照聚为一类。后者又有
两分支，一支由诱变苗 1、6 和
对照苗组成，其中对照苗和诱变
苗 6呈姊妹关系；另一分支由诱
变苗 2、4 组成，两者呈姊妹关
系。对照苗 3与诱变苗 6遗传距
离最小，说明诱变苗 6变异程度
小，诱变苗 1次之；再次之为诱
变苗 2、4，两者呈姊妹关系，说
明变异程度类似；诱变苗 5最远，呈另一大分支，说明变异程度最大。
3 讨 论
辐射诱变苗的鉴定多采用常规的形态观察与同工酶分析，但两种方法有其局限性，因为表型不同
并不一定由基因突变引起，而可能是其它原因。由于表型检测受辐射的后效应（环境及基因型的互作）
影响，其结果往往不可靠；同样，同工酶分析也会因酶种、实验材料、环境条件及分析方法等方面的
限制，使分析结果产生偏差。众所周知，RAPD 技术灵敏度高，速度快，可对整个基因组进行标记。
其所用的引物为不同系列，但对于任一特定引物，同基因组系列有特定位点，如果特定位点区域 DNA
发生片段插入、缺失或碱基突变，将导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使 PCR产生增加、
减少或分子量的改变。通过对 PCR产物的检测，即可检测出基因组 DNA的多态型。因此，利用 RAPD
分析方法，可准确测定突变苗是否为突变体。
我们曾利用过氧化物酶和可溶性蛋白对蝴蝶兰诱变苗进行鉴定，发现对照苗和诱变苗有差异，诱
变苗间有谱带相同，但也存在差异。由于过氧化物酶和可溶性蛋白的谱带有限，且有的变异不表现在
同工酶上，很难确定是否为诱变苗。利用 RAPD技术可对整个基因组进行标记，因此，可确定诱变苗
是否为真正的诱变苗，且通过数据分析，可确定诱变苗与对照的变异程度，以及诱变苗之间的基因差
异，从中选择基因变异程度高的作为新品种的选育目标。
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图 1 5种诱变苗和对照苗的聚类分析
相似系数
第 36卷

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图版Ⅰ 不同引物扩增 DNA谱带
注：谱带序号与表 1随机引物的序号相同；M为 DNA ladder 分子量标记；3号带为对照苗。