全 文 ：　 　第 38 卷　第 1 期
1999 年　1月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM
UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
　
Vol.38　No.1
Jan.　1999
　
文章编号:0529-6579 (1999)01-0102-106
中药溪黄草及其药用近缘种的 RAPD分析
陈林姣1 , 陈月琴1 , 屈良鹄1 , 叶创兴1 , 赖小平2
(1中山大学生命科学学院 , 广州 510275;2广州中医药大学)
摘　要:运用14个有效的 10 mer-寡核苷酸引物对中药溪黄草原植物线纹香茶菜 Isodon lo-
phanthoides及其药作近缘种基因组 DNA 进行 PCR扩增 , 共检出 194 个位点.其中单态位点 14
个 , 占7.2%;多态位点180个 , 占 92.8%;分类群特有位点 108 个 , 占55.7%.用UPGMA法
对分类群间的 Jaccard 相似性系数和遗传距离进行聚类分析.结果表明 , 狭基线纹香茶菜和细
花线纹香茶菜与溪黄草的亲缘关系较近 , 而溪黄草与线纹香茶菜 、 狭基线纹香茶菜 、 细花线
纹香茶菜之间的亲缘关系远.可用 RAPD技术对中药的正本清源 、 真伪品及质量进行研究.
关键词:中药溪黄草 , 近缘种 , RAPD分析
分类号:Q 949.72 , Q 7　　文献标识码:A
中药溪黄草是民间常用的一种中草药 , 用于治疗湿热泻痢 、跌打瘀肿 、急性黄疸型肝
炎 、 急性胆囊炎等疾病.近年来 , 中药溪黄草在华南各地临床上广为应用 , 并出现了一些
以其为主要原料的保健产品 , 具有较大的开发应用前景.中药溪黄草的原植物为香茶菜属
Isodon 的线纹香茶菜 Isodon lophanthoides (Buch.-Ham.ex D.Don)Hara[ 1] .然而 , 药材的原
植物来源比较复杂 , 品种混乱 , 除线纹香茶菜外 , 还有同属植物狭基线纹香茶菜
I.lophanthoides var.gerardiana(Benth.)H.Hara 、细花线纹香茶菜 I.lophanthoides var.graciliflora
(Benth.)H.Hara、溪黄草 I.serra(Maxim.)Kudo[ 2] .有关中药溪黄草及其伪品的鉴定 , 目前
多局限于对其药材性状及其组织显微特征的比较鉴别[ 3] .分子生物学的发展为生药的正本
清源及其质量监测提供了新的手段和方法.RAPD分析简单易行 , 在属级以下水平的分类
与进化[ 4 , 5]以及栽培品种的分类和识别[ 6] 等研究中有着广泛应用 , 在中药鉴定中也有报
道[ 7] .本文应用 RAPD方法对中药溪黄草的 4种基源植物 (包括变种)进行鉴别 , 并初步
探讨其亲缘关系 , 为进一步明确它们在临床上能否等同入药及寻找相似新药源提供依据.
1　材料与方法
1.1　材　料
线纹香茶菜 、狭基线纹香茶菜 、 细花线纹香茶菜和溪黄草 (表 1), 每个分类群各取
基金项目:国家杰出青年基金 (39525007);国家自然科学基金 (39770058)
收稿日期:1998-10-15　　第一作者简介:陈林姣 , 女 , 27 岁 , 硕士 , 现在厦门大学生物学系工作
10株植物的幼嫩叶片 , 混合提取总 DNA.标本存于广州中医药大学.
表 1　材料的代号 、 名称 、采集地和凭证号1)
Tab.1　Symbols , names , origin and voucher No.of plants
编号 名　称 采集地 采集株数 凭证号
1 溪黄草 Isodon serra 广州华南植物园 10 95081
2 线纹香茶菜 I.lophanthoides 广州华南植物园 10 97072
3
细花线纹香茶菜 I.lophanthoides
var.graciliflora 广州华南植物园 10 50909
4
狭基线纹香茶菜 I.lophanthoides
var.gerardiana 广州华南植物园 10 95076
5
狭基线纹香茶菜 I.lophanthoides
var.gerardiana 广东瑶坪县 10 95078
　　　　1)拉丁学名承蒙昆明植物研究所李锡文教授核定
1.2　方　法
1.2.1　总 DNA的提取与纯化　采用 CTAB法[ 7]提取植物总 DNA , 用 DPS纯化系统 (包括
玻璃粉 、 NaI , 由中山大学真核分子生物学实验室制备)纯化.
1.2.2　RAPA反应　总体积 15μL , 其中含 2.0 mmol/LMgCl2;100μmol/L 的dNTP (dATP ,
dCTP , dGTP 和 dTTP)(华美);Operon公司指定的引物浓度 (加 1/10体积的引物), 约 10
～ 15 ng 总 DNA;16.67×10-9 mol/ s Taq 酶 (Promega 公司产品);对照用双蒸水代替总
DNA.整个扩增程序为:94 ℃5 min , 1个循环;94 ℃, 1 min;35 ℃, 1 min;72 ℃, 2
min , 45个循环 , 最后 72 ℃, 延伸 7 min.扩增产物在 w=1.4%的琼脂糖凝胶中电泳 , 经
EB染色 , 紫外灯下观察结果 , 照相.
1.2.3　扩增产物的分析方法　在相片上量出相对分子质量标记物各带和扩增产物各带的
迁移率 M , 采用最小二乘法回归 , 求出 x =1/M , Y =lg L (L 为相对分子质量)的线性
函数 (1/M=alg L +b), 编制程序 , 算出各扩增产物相对分子质量大小.每一带在某一
种存在记作1 , 缺乏记作0 , 强带和弱带的赋值均为 1 , 仅那些可重复的带才被用于数据分
析.
分类群间的 Jaccard相似性系数用公式 SJ =a/(a+b+c)计算 , 其中 , a 为 2种共有
带数 、 b为 B种有而C 种没有的带数 、 c为 C种有而 B种没有的带数;距离系数采用公式
1-F 进行计算 , 其中F =2a/(2a +b+c).用 UPGMA法对分类群彼此间的相似性系数和
距离系数进行聚类分析 , 运用程序[ 8] (稍有改动)在计算机上计算.
2　实验结果与讨论
2.1　随机引物的筛选
对76个 10个核苷酸长的随机引物 (Operon 公司)进行筛选.只有那些能得到清晰
的 、 可重复的扩增产物的引物才用于 RAPD分析 , 共选出了 14个有效引物 (表2).
2.2　DNA多态性分析
不同引物扩增出的 DNA片段数从 4 ～ 28个不等 , 片段大小为 360 ～ 3 000碱基对 , 包
含有丰富的 DNA多态信息 (图 1a ～ f).有的引物对狭基线纹香茶菜 2个不同产地的种也
检出多态位点 (图 1a , d).14个有效引物共检出 194 个位点 , 其中单态位点 14个 , 占
103第 1 期　　　　　　　　陈林姣等:中药溪黄草及其药用近缘种的 RAPD分析
7.2%;多态位点 180个 , 占92.8%;种特有位点 108个 , 占 55.7% (表 2).特异性带可
作为区别种以及变种的遗传标记 , 而比较保守的单态带则可用于较高水平的分类.
表 2　引物及序列
Tab.2　Primers used for RAPD amplification
OPA-04AATCGGGCTG OPC-02GTGAGGCGTC OPC-16 CACACTCCAG OPD-02GGACCCAACC
OPD-03GTGGCCGTCA OPD-07TTGGCACGGG OPD-08GTGTGCCCCA OPD-18GAGAGCCAAC
OPD-20ACCCGGTCAC OPG-03GAGCCCTCCA OPG-10AGGGCCGTCT OPG-13CTCTCCGACA
OPG-17ACGACCGACA OPG-19GTCAGGGCAA
对14个有效引物的 RAPD反应各进行至少 1次的重复试验.结果表明:在反应条件
严格一致的情况下 , 绝大部分引物的重复性均很好 , 个别引物扩增出来的强带稳定性好 ,
而个别弱带不稳定.因此 , 记录重复性好的带 , 不能重复出现的弱带不作记录.
图 1　扩增 DNA 指纹图谱
Fig.1　PAPD profiles generated by primer
引物:(a)A-04;(b)D-03;(c)D-07;(d)D-20;(e)G-19;(f)C-20
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2.3　分类群间亲缘关系
采用 UPGMA法对 Jaccard相似性系数 (表 3)和遗传距离系数 (表 4)进行聚类分析 ,
得到树状图 (图 2 , 3).
表3　分类群间的 Jaccard相似性系数
Tab.3　 Similarity between species according
to the Jaccards coefficeient of similarity
1 2 3 4 5
1 1
2 0.131 1
3 0.092 0.504 1
4 0.104 0.482 0.671 1
5 0.106 0.495 0.677 0.840 1
　1
　2
　3
　5
　4
　
0.1 0.5 1.0
图 2　用 Jaccard相似性系数 、UPGMA法聚类分析产生的树状图
Fig.2　Phenogram constructed by UPGMA cluster
analysis of Jaccard s coefficient
表 4　各分类群间的距离系数
Tab.4　Matrix of 1-F values
between species
1 2 3 4 5
1 0
2 0.768 0
3 0.831 0.329 0
4 0.812 0.350 0.195 0
5 0.808 0.338 0.192 0.087 0
　1
　2
　3
　5
　4
　
0.8 0.4 0.1
图 3　用距离系数 、UPGMA 法聚类分析产生的树状图
Fig.3　Phenogram constructed by UPGMA cluster
analysis of genetic distance
　　从聚类分析的结果 (图 2 , 3)可以估计各分类群间的亲缘关系.溪黄草与线纹香茶
菜 、 狭基线纹香茶菜 、细花线纹香茶菜之间的相似性系数 (最大为 0.131)远远小于线纹
香茶菜 、 狭基线纹香茶菜 、细花线纹香茶菜三者中任意两者之间的相似性系数 , 其距离系
数 (最小为0.768)则大于后三者中任意两者间的距离系数 , 这说明溪黄草与线纹香茶
菜 、 狭基线纹香茶菜之间的亲缘关系远.在传统分类学上 , 溪黄草与线纹香茶菜 、 狭基线
纹香茶菜 、 细花线纹香茶菜同属于香茶菜属 Isodon , 但分属于香茶菜组 (Sect.Amethstoides
Benth.)和皱叶香茶菜组 (Sect.Isodon).RAPD分析结果与它们所处的传统分类学位置相
符合.线纹香茶菜与狭基线纹香茶菜 、 细花线纹香茶菜的 Jaccard 相似性系数分别为
0.482 , 0.504 , 遗传距离分别为 0.350 , 0.329 , 狭基线纹香茶菜与细花线纹香茶菜的 Jac-
card相似性系数为 0.674 , 遗传距离为 0.195 , 这表明线纹香茶菜跟狭基线纹香茶菜和细花
线纹香茶菜的亲缘关系较近 , 狭基线纹香茶菜与细花线纹香茶菜的亲缘关系最近.RAPD
分析结果与对线纹香茶菜 、狭基线纹香茶菜 、细花线纹香茶菜三者的叶表皮结构[ 8] 、茎和
叶的解剖特征 (待发表)和花粉形态特征 (待发表)研究所得结果基本吻合.
RAPD分析结果还表明 , 两个不同产地的狭基线纹香茶菜的相似性系数非常大 , 但在
某些引物的扩增物上存在小的差异.因此 , RAPD分析可为地道药材的研究和种群间的遗
传变异提供分子生物学方面的依据.此外 , 从它们已知的化学成分来看 , 溪黄草主要药理
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活性成分萜类为对映贝壳松烯型[ 3] ;而线纹香茶菜 、 狭基线纹香茶菜所含萜类为松香烯
型[ 9 ,10] , 这提示该属植物亲缘关系越近 , 所含化学成分越相似 , 因而 RAPD分析也可为寻
找相似药效的新资源提供线索.
　　昆明植物研究所李锡文教授审核了有关植物标本的鉴别 , 特此致谢.
参考文献:
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RAPD Analysis on Chinese Medicine Xihuangcao and Its Related Species
CHEN Linjiao
, CHEN Yueqin , QU Lianghu , YE Chuangxing , LAI Xiaoping
Abstract:Four original plants of Chinese Medicine Xihuangcao were analysed using random amplified
polymorphicDNA(RAPD).Fourteen primers were selected from 76 primers.A total of 194 bands
were scored reproducibly by 14 primers.92.8% of the total bands were polymorphic and 55.7% of
the total bands were unique.The unique bands could be used as molecular markers for identification.
RAPD markers were analyzed using similarity and genetic distance.Phenograms were constructed by
using UPGMA method.Based on the results of the analysis and on a review of morphological character-
istic , Isodon.lophanthoides var.gerardiana and I.lophanthoides var.graciliflora could be used as
Chinese Medicine Xihuangcao.However , it needed to make a further study on potential medicinal us-
age of I.serra.The results showed that RAPD was feasible as a molecular marker for identification in
ChineseMedicine , and it was also potenial for studying evolution and relationships between specific
and infraspecific taxa.
Keywords:Xihuangcao (Isodon), original plants , RAPD analysis
106 中山大学学报 (自然科学版)　　　　　　　　　　　　　第 38 卷
School of Life Sciences , Zhongshan University , Guangzhou 510275 , China