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利用RAPD技术对蒙古韭不同居群的遗传多样性研究



全 文 :2008年 11月 内蒙古大学学报 (自然科学版 ) Nov. 2008第 39卷第 6期 Journal of Inner Mongolia Universi ty Vol. 39 No. 6
  文章编号: 1000- 1638( 2008) 06-0654-06
利用 RAPD技术对蒙古韭不同居群的
遗传多样性研究
恩和巴雅尔 ,秦丽丽 ,哈斯巴根
(内蒙古师范大学生命科学与技术学院 ,呼和浩特 010022)
摘要:采用 RAPD方法分析了内蒙古野生分布的蒙古韭 (Allium mongolicum Regel) 10个不同
居群的遗传多样性、遗传分化和遗传距离等 . 12个随机引物扩增出的多态带占总谱带的
95. 65% ;总的遗传多样性为 0. 2977; 1. 74%的遗传变异存在于居群间 ,而 98. 26%的遗传变异
都存在于居群内部 ;遗传距离在 0. 2177~ 0. 5965之间 ;地理距离与遗传距离不相关 .
关键词: 蒙古韭 ; RAPD分析 ;遗传多样性 ;遗传分化 ;遗传距离
中图分类号: Q948  文献标识码: A
  蒙古韭 ( All ium mongolicum Regel)隶属于百合科 ( Liliaceae)葱属 ( Allium ) .又名沙葱 ,蒙名呼木
乐 .旱生植物 ,生于荒漠草原及荒漠地带的砂地和干旱山坡〔1〕 .分布于我国新疆、青海、甘肃、宁夏、陕
西、内蒙古和辽宁等地〔2〕 .内蒙古境内主要分布于呼伦贝尔市、锡林郭勒盟、乌兰察布市、巴彦淖尔市、
乌海市、鄂尔多斯市、阿拉善盟、包头市等地〔1〕 .
蒙古韭是蒙古族长期食用的野生蔬菜 ,也是牲畜喜食的优等牧草 .目前 ,国内外对蒙古韭的研究
主要涉及到区系地理研究〔 3~ 5〕、分子生物学研究〔 6, 7〕、菌根学研究〔8, 9〕、人工栽培技术的研究〔 10~ 15〕、形
态解剖学研究〔16, 17〕、民族植物学研究〔18, 19〕、化学及药理研究〔20, 21〕等 .可见 ,对于蒙古韭的研究工作开
展的还是很多 ,但目前仍没有关于蒙古韭不同居群之间遗传多样性研究的报道 .
由于大量采摘、生态环境的日益恶化等原因 ,内蒙古境内的蒙古韭资源遭到严重的破坏 ,其遗传
多样性面临着严峻挑战 ,也面临种群退化的危险 .本文采用随机扩增多态性 DNA方法 ,研究和分析了
蒙古韭不同居群间遗传多样性、遗传分化和遗传距离 ,为蒙古韭遗传多样性保护及相关研究提供参考
资料 .
1 实验材料与研究方法
1. 1 实验材料
以内蒙古为大背景 ,选择了蒙古韭自然分布的 10个样点 (见表 1) .
1. 2 方法
1. 2. 1 植物材料的处理和模板 DNA的制备 野外采集的蒙古韭取其根上部分在 CTAB法〔22〕的基
础上稍加改良后 ,提取基因组 DNA,稀释至 20 ng /μL备用 .
1. 2. 2 随机引物选择 随机引物采用美国 Operon公司设计的随机引物 ,通过预备实验 ,选取 12个
引物用于对蒙古韭基因组 DNA的随机扩增 ,引物序列见表 2.
1. 2. 3  PCR反应 反应体积为 20μL: 8. 5μL 2× Taq PCR MasterMix ( 0. 1U Taq Po lymerase /μL、
收稿日期: 2008-06-12
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 30560013)
作者简介: 恩和巴雅尔 ( 1962~ ) ,男 (蒙古族 ) ,内蒙古通辽市人 ,副教授 .
500μmo l /L dN T P each、 20mmol /LTris-HCl pH8. 3 、 100mmol /L KCl)、 8. 5μLddH2O、 1μL引物、 2
μLDNA模板 .
  反应程序为 94℃预变性 3 min;然后 94℃
30 s, 37℃ 45 s, 72℃ 60 s, 45个循环 ;最后 72
℃延伸 10 min〔 7〕 . 扩 增用 PCR仪为德国
Biometra公司 T1型热循环仪 .
PCR产物经 1. 4%琼脂糖凝胶电泳分离并
经溴化乙锭染色 ,利用天能凝胶成像系统进行
图像采集 .
1. 2. 4 数据分析  10个样品 12个引物扩增的
结果进行统计分析 .每条 DNA谱带作为 1个单
位 ,有带记为 1,没带记为 0.利用 Popgen32软件
对上述数据进行遗传多样性的一系列指标分
析 .利用 S PSS统计软件对蒙古韭不同居群遗传
距离和地理距离作相关分析 .
表 1 采样地点
Table 1  Sample sites
编号 来源 简称
1 阿拉善左旗锡力高勒苏木诺干桃力嘎查 AZ
2 西鄂尔多斯国家级自然保护区 W H
3 鄂尔多斯市鄂托克旗棋盘井镇工业园区 QP
4 鄂尔多斯市伊金霍洛旗城陵附近 Y J
5 巴彦淖尔市乌拉特前旗乌梁素海八分场 BQ
6 巴彦淖尔市乌拉特后旗赛乌苏镇 BH
7 锡林郭勒市苏尼特右旗赛汗塔拉镇 SH
8 锡林郭勒市苏尼特左旗满都拉图镇 DS
9 锡林郭勒市阿巴嘎旗新浩特镇 AB
10 锡林郭勒市西乌珠穆沁旗迪彦林场 XW
2 结果与分析
2. 1  DNA多态性分析
12个随机引物共扩增出 138条 DNA谱带 ,其中多态带 132条 ,占扩增总带数的 95. 65% .每个引
物扩增的带数在 6~ 17条之间 (见图 1) ,平均为 11. 5条 .其中扩增带数最多的为 H15引物 ,具 17条扩
增带 ;最少的为 H5和 W17引物 ,都仅具有 6条带 (见表 2) .在扩增出的 138条带中 ,有 4条为部分供试
材料所共有 ( W 5-5, W8-5, W15-8, W19-6) ,这在一定程度上表明了各居群之间的同源性 (表 2):表 2
谱带统计的结果表明: 不同引物扩增出的带数不同 ;同一引物不同供试材料间的扩增带数也不同 ;这
充分表现了蒙古韭各个居群之间遗传背景的复杂性和 DNA的多态性 .
图 1 蒙古韭不同居群的 RAPD扩增结果
Fig . 1  RAPD amplifica tion results o f different populations of Allium .mongolicum
  从表 2中可以看出 ,多态位点比率从 83. 33%~ 100% .其中 5个引物的多态位点比率都是 100% ,
引物 W17、 H5的多态位点比率最低 ,为 83. 33% ,蒙古韭多态位点比率高低依次为 W2= H4= H15=
H17= H19> W19> W8> W5> W15> W3> W17= H5.
655第 6期 恩和巴雅尔等 利用 RAPD技术对蒙古韭不同居群的遗传多样性研究
2. 2 多样性指数分析
  从表 3中可以看出 , Shannon指数 ( I)计算的多样性在 0. 2140~ 0. 3680范围之间 ,平均值为
0. 2903,物种水平上为 0. 2977.其中引物W2的遗传多样性最高 ( 0. 3680) ,引物W17的最低 ( 0. 2140) ,
与多态位点比率基本一致 . Nei基因多样性指数 ( H)计算的结果与 Shannon指数计算的结果基本一
致 , 各引物基因多样性在 0. 3510~ 0. 5518范围之间 ,平均值为 0. 4525,物种水平上为 0. 4605.两种多
样性指标表明 ,各居群在引物 W2与引物 W19的扩增结果具有相对较高的遗传多样性 .
表 2 扩增引物序列及位点数
Table 2  Sequence and local of primers
引物 序列 扩增带数 多态带数 多态带的百分率 (% )
O PW2 TCGGACGTGA 15 15 100
O PW3 GTCCGGAGTG 9 8 88. 89
O PW5 GGCGGATAAG 11 10 90. 91
O PW8 GACTGCC TC T 13 12 92. 31
OPW15 ACACCGGAAC 10 9 90. 00
OPW17 GTCCTGGGTT 6 5 83. 33
OPW19 CAAAGCGCTC 15 14 93. 33
O PH4 GGAAGTCGCC 13 13 100
O PH5 AGTCGTCCCC 6 5 83. 33
OPH15 AATGGCGCAG 17 17 100
OPH17 CACTCTCCTC 16 16 100
OPH19 C TGACCAGCC 7 7 100
  由 Shannon指数计算的居群内和居群间的遗
传变异见表 4,在总的遗传多样性中 ,居群内的遗
传多样性占 97. 51% ,居群间的遗传多样性占
2. 49% .根据 Nei基因多样性指数计算的居群遗
传分化结果 10个居群的总的基因多样性为 Ht=
0. 4605,居群内基因多样性为 Hs= 0. 4525,居群
间遗传分化系数 Gst为 0. 0174(见表 4) .即 1. 74%
的遗传变异存在于居群间 ,而 98. 26%的遗传变异
都存在于居群内部 .结果表明 ,遗传变异大部分都
来自居群内部 ,主要来自居群内的不同个体的遗
传变异 ;而只有极少数的变异来自居群间 .基于遗
传分化计算出的基因流 Nm> 1,说明不同居群间
具有基因流 ,防止了由于遗传漂变导致的居群间
的遗传分化 .
表 3 蒙古韭不同居群的遗传多样性
Table 3  Genetic diversity analysis
of 12 populat ions of Allium .mongolicum
引物 Shannon指数 Nei基因多样性
O PW2 0. 3680 0. 5461
O PW3 0. 2511 0. 3983
O PW5 0. 2745 0. 4288
O PW8 0. 2538 0. 4041
OPW15 0. 2720 0. 4261
OPW17 0. 2140 0. 3510
OPW19 0. 3520 0. 5518
O PH4 0. 2831 0. 4498
O PH5 0. 3367 0. 5109
OPH15 0. 3224 0. 4959
OPH17 0. 3200 0. 4901
OPH19 0. 2257 0. 3777
M EAN 0. 2903 0. 4525
TO TAL 0. 2977 0. 4605
表 4 蒙古韭不同居群的遗传分化
Table 4  Genet ic dif ferentiation of All ium.mongolicum
Shannon指数 Nei指数
居群内遗传多样性 0. 2903 居群内基因多样性 0. 4525
居群总的遗传多样性 0. 2977 居群总的基因多样性 0. 4605
居群内总的遗传多样性比率 0. 9751 居群内基因多样性比率 0. 9826
居群间遗传多样性比率 0. 0249 遗传分化系数 0. 0174
基因流 28. 235
656 内蒙古大学学报 (自然科学版 ) 2008年
2. 3 遗传关系分析
通过软件分析得出了遗传距离 D及遗传一致度 I , I= 1- D ,见表 5.
  从表 5可以看出 ,各居群之间的遗传距离在 0. 2177~ 0. 5965之间 ,而遗传一致度则在 0. 5507~
0. 8043之间 .居群 1( AZ)和居群 7( SH)的遗传距离最大 ,为 0. 5965,它们之间的遗传一致度最低 ,为
0. 5507.居群 9( AB)和居群 10( XW )之间的遗传距离最小 ,为 0. 2177,而遗传一致度是最大为 0. 8043.
  遗传聚类图 (图 2)显示 , 10个居群虽然聚集有先后 ,但最后都聚在了一起 .阿巴嘎旗 ( AB)和西乌
旗 ( XW )的两个居群首先聚集 ,然后和伊金霍洛旗 ( YJ)的居群聚在了一起 ,再与棋盘井 ( QP)居群聚
在一起 .乌拉特前旗 ( BQ)的居群与赛汗塔拉 ( S H)的居群是第二个聚在一起的 ,后又与乌拉特后旗
( BH)的居群聚在了一起 ,再与乌海 (W H)的居群聚集 .上述的两个分支在距离 21. 64的时候聚集在了
一起 ,这一大群再与苏尼特左旗 ( DS)的居群聚在了一起 ,最后与阿左旗 ( AZ)的居群聚在了一起 .
表 5 蒙古韭不同居群间的遗传一致度及遗传距离
Table 5  Genetic identity and distance between dif ferent populat ions of Allium .mongolicum
Pop AZ W H QP Y J BQ BH SH DS AB XW
AZ 00000 0. 6522 0. 5870 0. 6014 0. 6594 0. 6159 0. 5507 0. 6014 0. 6739 0. 6812
W H 0. 4274 00000 0. 6594 0. 6304 0. 6739 0. 6739 0. 6667 0. 6449 0. 7029 0. 6377
QP 0. 5328 0. 4164 00000 0. 6812 0. 6232 0. 6087 0. 6159 0. 5652 0. 7101 0. 6594
YJ 0. 5084 0. 4613 0. 3840 00000 0. 6522 0. 6377 0. 6594 0. 6522 0. 7101 0. 6739
BQ 0. 4164 0. 3947 0. 4729 0. 4274 00000 0. 6957 0. 7174 0. 6667 0. 6812 0. 6594
BH 0. 4846 0. 3947 0. 4964 0. 4499 0. 3629 00000 0. 6884 0. 6522 0. 7246 0. 6304
SH 0. 5965 0. 4055 0. 4846 0. 4164 0. 3321 0. 3734 00000 0. 6304 0. 6739 0. 5942
AB 0. 5084 0. 4386 0. 5705 0. 4274 0. 4055 0. 4274 0. 4613 00000 0. 7101 0. 6739
DS 0. 3947 0. 3525 0. 3423 0. 3423 0. 3840 0. 3221 0. 3947 0. 3423 00000 0. 8043
XW 0. 3840 0. 4499 0. 4164 0. 3947 0. 4164 0. 4613 0. 5205 0. 3947 0. 2177 00000
  注: 上三角为遗传一致度 ,下三角为遗传距离
图 2 蒙古韭 10个不同居群的 U PGM A聚类图
Fig. 2  The U PGM A dendrog ram o f Allium .mongolicum
应用 SPSS统计软件对蒙古韭的 10个不同居群间的地理距离与遗传距离作了相关性分析 ,结果P
= 0. 285> 0. 05,表明地理距离与遗传距离之间并没有直接的相关性 ,地理距离的远近并不能说明遗
传距离的远近 .
3 讨 论
3. 1 蒙古韭的遗传多样性及遗传分化
从 Shannon指数的结果中可以看出 ,蒙古韭不同居群的总的遗传多样性 (即物种水平上 )为
657第 6期 恩和巴雅尔等 利用 RAPD技术对蒙古韭不同居群的遗传多样性研究
0. 2977,平均为 0. 2903,这远远高于 35种异交植物通过 RAPD检测得到的平均值 0. 193,这充分说明
了蒙古韭保持着较高的遗传多样性 .
Shannon指数计算的居群内和居群间的遗传变异又表明 ,在总的遗传多样性中 ,居群内的遗传多
样性占 97. 51% ,居群间的遗传多样性只占 2. 49% .这说明蒙古韭的大部分遗传多样性都存在于居群
内部 ,而极少数的多样性存在于居群间 .根据 Nei基因多样性指数计算的居群遗传分化结果也显示 ,
10个居群的总的基因多样性为 Ht= 0. 4605,居群内基因多样性为 Hs= 0. 4525,居群间遗传分化系数
Gst为 0. 0174.即 1. 74%的遗传变异存在于居群间 ,而 98. 26%的遗传变异都存在于居群内部 .这说明
了遗传变异大部分都来自居群内部 ,即主要来自居群内的不同个体的遗传变异 ;而只有极少数的变异
来自居群间 .
植物的遗传分化在很多程度上取决于物种本身的特性 ,这些特性中包括物种的生活史、种子散播
和传粉机制、交配系统、生殖模式、突变率和突变机制等〔23〕 .而在居群水平上 ,影响遗传分化的几个因
素的重要性为: 繁育系统、分布范围、生活型、分类地位、种子散播机制等 .可以看出 ,繁育系统对影响
居群水平的遗传分化起着至关重要的地位 .对蒙古韭而言 ,它是异交的虫媒植物 ,从传粉的角度讲 ,昆
虫的飞行能力有限 ,在一定的居群范围内 ,可以把带有遗传信息的一个个体的花粉带到另一个个体的
花柱上 ,让其有充分的基因交流 .而对相隔偏远的不同居群而言 ,昆虫传粉的可能性就非常渺小 ,所
以 ,传粉方式是蒙古韭不同居群间遗传分化较小的一个主要原因 .
就分布范围的角度讲 ,本研究采样地最东部为锡盟西乌旗 ,而最西部为阿拉善盟左旗 ,范围跨度
很大:从锡盟的西乌旗、阿巴嘎旗、苏尼特左旗、苏尼特右旗 ,中间跨过乌兰察布市、呼市、包头地区没
有涉及 ,再到鄂尔多斯市、巴彦淖尔市、乌海和阿盟 .这相当于内蒙古的东西部地区用呼和浩特地区分
隔成两支一样 ,蒙古韭的取样地点也用呼和浩特地区分隔成了两支 .东部区的四个居群与西部区的六
个居群之间已被分隔 ,而东部区的四个居群相互之间 ,西部区的六个居群相互之间并没有被完全分隔
掉 ,存在着一定的基因交流 .所以从总的趋势看 ,居群与居群之间没有完全被分隔 ,存在着很小
( 1. 74% )的遗传分化 .这在某种程度上防止了由于遗传漂变导致的居群间的遗传分化 .
当然 ,除了上述的两个原因以外 ,引起蒙古韭不同居群的遗传分化也有很多其它原因:比如生活
型 .蒙古韭除了种子繁殖还要靠鳞茎繁殖 ,这也有可能是其很小部分遗传分化在居群间的一个因素 .
3. 2 蒙古韭不同居群的遗传关系
从 U PGM A聚类图中可以得出:在距离 20时 , 10个居群被分为 4个大类:阿左旗 ( AZ)和苏尼特
左旗 ( DS)的两个居群分别分成一大类 ,而乌海 ( WH)、乌拉特前旗 ( BQ)、赛汗塔拉 ( SH)和乌拉特后
旗 ( BH)的四个居群又成为第三大类 ,最后 ,棋盘井 ( Q P)、伊金霍洛旗 ( YJ)、阿巴嘎旗 ( AB) )和西乌旗
(XW )的四个居群分成了第四大类 .从图 2中可以看出 ,东部区的四个居群 ( S H、 DS、 AB、XW)相互之
间并没有聚在一起 ,同样 ,西部区的六个居群 ( AZ、WH、 Q P、 YJ、 BQ、 BH)也没有聚到一起 .由此可见 ,
地理距离与遗传距离之间并无相关关系 .
4 蒙古韭的遗传多样性保护
  种内的遗传多样性越丰富 ,物种对环境变化的适应能力就越大〔10〕 .蒙古韭不同居群间保持着相
当高的遗传多样性 ( 0. 2977) ,意味着蒙古韭的进化潜力很大 .但是 ,对于这个具有食用、饲用、药用等
多用途的资源植物来说 ,目前正处于一种没有任何管理状态下的盲目开采阶段 ,所以在很大程度上 ,
不仅破坏了野生蒙古韭的资源 ,而且对蒙古韭群体的演化扩展带来了严峻的考验 .因此 ,保护现存自
然资源以保护尽可能多的遗传多样性是近期的保护措施 .从长远看 ,最适宜的保护措施就是限定人为
的开采量 ,有利于居群的长期生存和发展 .
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(责任编委 杨 持 )
An Analysis for Genetic Div ersity in Different Populations
of Allium mongolicum Regel by RAPD
Enhebayaer, QIN Li-li , Hasbagen
(College of B iology and Technology Science,
Inner Mongol ia Normal University , Hohhot 010022,China)
  Abstract: Random amplified po lymo rphic DN A ( RAPD) markers w ere used to measure genetic
div ersity, g enetic dif ferentiation and genetic distance fo r 10 Allium mongolicum Regel wi ld
popula tions in Inner Mongo lia. 12 random primers w ere used and the percentag e of polymo rphic
bands w as 95. 65% . The to tal g enetic div ersi ty was 0. 2977, and genetic va riation among populations
w as 1. 74% , while wi thin populations was 98. 26% . The genetic distance w as among the range of 0.
2177 to 0. 5965. Geog raphic distances w ere no t co rrela ted to g enetic distances.
Key words: All ium mongolicum Regel; RAPD analy sis; genetic div ersi ty; g enetic di fferentiation;
g enetic distance
659第 6期 恩和巴雅尔等 利用 RAPD技术对蒙古韭不同居群的遗传多样性研究