全 文 ：　文章编号:1674-148X(2009)02-0103-06
平邑甜茶与 M7 离体叶片不定芽再生的研究
收稿日期:2009-01-15
基金项目:国家现代苹果产业体系项目(加工苹果育种方向);山东省良种产业化项目(苹果育种方向)
作者简介:魏国芹(1983-),女 ,山东济宁人 ,在读硕士 ,研究方向:果树育种。
通讯作者:戴洪义 , E-mail:hydai@qau.edu.cn
魏国芹 ,梁美霞 ,李鼎立 ,孙海峰 ,戴洪义
(青岛农业大学园林园艺学院 ,山东 青岛 266109)
摘要:以苹果砧木平邑甜茶 (MalushupehensisRehd)和 M7 (MaluspumilaVar.ParadisiacaSchneid)的组培苗叶片
为材料 , 研究了暗培养 、接种方式和植物生长调节剂对叶片不定芽再生的影响。结果表明 ,适合二者叶片不定芽再
生的最佳暗培养时间是 14d。平邑甜茶叶片以远轴面向下接触培养基再生效果好 ,叶片接种方式对M7叶片不定芽
再生无显著影响。适合平邑甜茶叶片不定芽再生的最佳培养基是 MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.1mg/L, 再生率达
93.3%。适合 M7叶片不定芽再生的最佳培养基是 MS+6-BA4.0mg/L+IBA0.3mg/L, 再生率达 96.7%。适合平
邑甜茶新梢伸长的最佳培养基是 MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.03mg/L+GA
3
0.5mg/L,适合 M
7
新梢伸长的最佳培
养基是 MS+6-BA0.5 mg/L+IBA0.05mg/L+GA3 1.0mg/L。适合平邑甜茶生根的最佳培养基为 1/2MS+IBA0.1
mg/L, 生根率为 86.7%。适合 M7生根的最佳培养基是 1/2MS+IBA1.0mg/L, 生根率为 93.3%。
关键词:苹果砧木;平邑甜茶;M7;叶片再生;不定芽
中图分类号:Q813.1+2 文献标识码:A
AdventitiousBudRegenerationfromLeavesinvitro
ofMalushupehensisRehdandM7
WEIGuo-qin, LIANGMei-xia, LIDing-li, SUNHai-feng, DAIHong-yi
(CollegeofHorticulture, QAU, Qingdao266109, China)
Abstract:Theefectsofdarktreatment, inoculationmethodsandplantgrowthregulatorsonadventitiousbudregen-
erationfromleavesinvitroofMalushupehensisRehdandM7 (MaluspumilaVar.ParadisiacaSchneid)werestud-
ied.Theresultsindicatedthat14daysofdarktreatmentcouldefectivelystimulatetheadventitiousbudregenera-
tionfromleavesofMalushupehensisRehdandM7.HigherregenerationrateofMalushupehensisRehdwasfound
whentheabaxiallayerofleaveswascontactedwiththemedium.However, inoculationmethodsofleaveshadno
significantefectonadventitiousbudregenerationofM7.Themostsuitablemediumforadventitiousbudregenera-
tionofMalushupehensisRehdandM7 wereMS+6-BA2.0mg/L+IBA0.1mg/LandMS+6-BA4.0mg/L+
IBA0.3mg/Lrespectively.TheregenerationratesofadventitiousbudofMalushupehensisRehdandM7 were93.
3% and96.7% respectively.TheappropriatemediumforplantletelongationofMalushupehensisRehdandM7
wereMS+6-BA0.3mg/L+IBA0.03 mg/L+GA3 0.5mg/LandMS+6-BA0.5 mg/L+IBA0.05 mg/L+
GA3 1.0 mg/Lrespectively.ThebestmediumforrootsinductionofMalushupehensisRehdandM7 were1/2MS+
IBA0.1 mg/Land1/2MS+IBA1.0 mg/Lrespectively, andtherootingratesofMalushupehensisRehdandM7
were86.7% and93.3% respectively.
Keywords:applerootstock;MalushupehensisRehd;M7;leafregeneration;adventitiousbud
　　平邑甜茶是我国北方地区重要的苹果砧木之
一 ,抗涝 、抗寒 、抗病虫特性很强 [ 1] 。M7是世界上苹
果产区广泛应用的重要半矮化砧木之一 ,属营养系
砧木 ,可以明显提高果实品质 [ 2] 。但是由于平邑甜
青岛农业大学学报(自然科学版)　26(2):103 ～ 108, 2009
JournalofQingdaoAgriculturalUniversity(NaturalScience)
茶抗旱性差 、M7易感病毒病等问题 ,有待于利用转
基因技术对其进行遗传改良。有关苹果品种离体叶
片不定芽再生方面的研究已有一些报导 [ 3 ～ 9] 。然而
前人对平邑甜茶的叶片不定芽再生的研究尚少 ,且
再生率均比较低 [ 10, 11] 。关于 M7叶片不定芽再生方
面的专门报道在国内尚未见报道。本试验旨在进一
步提高平邑甜茶叶片不定芽再生率 ,建立 M7叶片
高频稳定再生体系 ,为平邑甜茶和 M7的遗传转化
和基因改良提供基础 。
1　材料与方法
4月份从田间取平邑甜茶和 M7的枝条 ,用手术
刀剥取芽内约 0.5mm大小的茎尖 ,用蒸馏水冲洗 2
次后置于超净工作台上 。将茎尖先用 75%的酒精
表面消毒 10 ～ 15s,再用 0.1%的升汞溶液灭菌 4
min,最后用蒸馏水冲洗 5 ～ 6次 ,然后将平邑甜茶接
种于 MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L培养基
中 、将 M7 接种于 MS+6 -BA 1.0 mg/L+NAA
0.1mg/L培养基中进行初代培养 。
将初代培养的丛生不定芽分割成单芽或带芽茎
段 ,转接到继代培养基中进行继代培养。平邑甜茶
的继代培养基选用 MS+6 -BA0.3mg/L+IBA
0.03mg/L, M7的继代培养基选用 MS+6 -BA0.5
mg/L+IBA0.05mg/L。本试验所用的试验材料就
是平邑甜茶和 M7继代 20 d的组培苗幼叶(附图 -
A、B)。
1.1　叶片不定芽分化
1.1.1　暗培养时间对叶片不定芽分化的影响
选取平邑甜茶和 M7离体新稍顶部 2 ～ 4片幼
叶 ,用手术刀沿垂直于叶脉方向切割 ,间距约 1mm,
不伤及叶缘保持叶片的完整性 ,远轴面接触培养基
(简称正放),将两种苹果砧木叶片均接种于 MS+6
-BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L不定芽诱导培养基
中 ,并设置 0d、7d、14d、21d、28d5个黑暗处理 ,每处
理 5瓶 ,每瓶 6个外植体 ,接种 40d后观察不同暗处
理时间对叶片不定芽分化的影响。
1.1.2　叶片外植体不同接种方式对叶片不定芽分
化的影响
取按 1.1.1所述方法制备的平邑甜茶和 M7的
叶片 ,按两种不同接种方式置于 MS+6-BA1.0
mg/L+IBA0.01mg/L不定芽诱导培养基中 ,一种
是远轴面向下(正放)接触培养基 ,另一种是近轴面
向下(反放)接触培养基 ,暗培养 14d后置于光下培
养。共 2个处理 ,每处理 6瓶 ,每瓶 10个外植体 ,接
种 40d后观察叶片分化不定芽的情况。
1.1.3　不同植物生长调节剂对叶片不定芽分化的
影响
取按 1.1.1所述方法制备的平邑甜茶和 M7的
叶片 ,远轴面向下接种于添加不同植物生长调节剂
及浓度的 MS分化培养基中 ,暗培养 14d后置于光
下培养。共 16个处理 ,每处理 6瓶 ,每瓶 5个外植
体 ,接种 40d后观察不定芽生长情况。
1.2　新梢的伸长
将由叶片再生得到的平邑甜茶和 M7的不定芽
转接到伸长培养基中 ,培养基分别为平邑甜茶和 M7
的继代培养基 +不同浓度的 GA3 , 40d后统计新梢
长度 。
1.3　生根培养
将伸长后的新梢切割成 2.5cm长的茎段进行
生根培养 ,以 1/2MS为基本培养基 ,生长素 NAA、
IBA、IAA分别采用 4种不同的浓度处理(0.1mg/L、
0.5mg/L、 1.0mg/L、 2.0mg/L),各处理 5瓶 ,每瓶 6
个外植体 ,培养 40d后统计生根率 。
1.4　培养条件
所有诱导培养基均附加蔗糖 30g/L, 琼脂
0.65%, pH5.8。培养温度为 26℃,光照强度为 1500
～ 2000Lx,光照时间为 16h/d。暗培养采用黑暗恒
温(26℃)培养箱 。
1.5　统计方法
叶片接种 40d后按下列公式计算叶片再生率和
再生叶片平均再生芽数:
再生率 =再生不定芽叶片数接种叶片数 ×100%
再生叶片平均再生芽数 =再生不定芽总数再生不定芽叶片数 ×
100%
茎段接种 40d后用下列公式计算生根率:
生根率 =生根茎段数接种茎段数 ×100%
2　结果与分析
2.1　叶片不定芽分化
2.1.1　暗培养时间对不定芽分化的影响
由表 1可以看出 ,暗培养时间对苹果砧木叶片
不定芽分化有重要影响 。在无暗培养处理时 ,平邑
甜茶和 M7叶片再生率均为 0,当暗培养时间为 14d
104　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　青岛农业大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　26卷　
时 ,二者不定芽的分化率达到最高 ,分别为 66.7%
和 46.7%。随着暗培养时间的增加 ,叶片不定芽的
分化率和再生叶片平均再生芽数均下降。当暗培养
时间为 28d时 ,形成的不定芽出现白化现象 ,生长细
弱(附图 -C)。试验还发现 ,对于同一试验材料 ,采
用不同的黑暗处理 ,叶片开始分化的时间基本一致。
平邑甜茶叶片接种后 19 ～ 20d开始分化不定芽 ,而
M7叶片开始分化不定芽的时间相对要早些 ,一般为
表 1　不同暗培养时间对平邑甜茶和 M7离体叶片再生不定芽的影响
暗处理时间
(d)
平邑甜茶 M7
开始分化
时间(d)
再生率
(%)
再生叶片平均
再生芽数(个)
开始分化
时间(d)
再生率
(%)
再生叶片平均
再生芽数(个)
0 — 0±0c 0±0d — 0±0c 0±0a
7 20 33.3±0.11b 3.87±0.83 c 17 20.0±0.03 b 2.70±0.20ab
14 19 66.7±0.11a 8.36±0.06 a 16 46.7±0.06a 3.50±0.05b
21 19 60.0±0.14a 7.55±0.13 a 16 40.0±0.08a 3.17±0.11b
28 20 56.7±0.09a 5.56±0.18b 16 23.3±0.04 b 2.90±0.33c
　　注:表中小写字母为邓肯新复极差法显著性分析 ,显著水平为 0.05。下同。
接种后 16 ～ 17d。
2.1.2　叶片不同接种方式对不定芽分化的影响
将不同接种方式的叶片暗培养 14d后 ,置于光
照培养室中进行培养 。结果表明 ,以平邑甜茶叶片
为外植体 , 远轴面向下和近轴面向下接触培养基时
叶片再生率和再生芽数差异显著;以 M7叶片为外
植体 , 远轴面向下和近轴面向下接触培养基时再生
率和再生芽数差异不显著 。说明叶片不同接种方式
对平邑甜茶叶片不定芽分化影响较大 ,对 M7叶片
不定芽分化无明显影响 。
2.1.3　不同植物生长调节剂对不定芽分化的影响
将平邑甜茶和 M7组培苗幼叶远轴面向下接触
培养基 ,暗培养 10d后 ,叶片明显增大呈卷曲状 ,叶
脉附近切口处形成少量浅黄色愈伤组织 。暗培养
14d后置于光下 , 5 ～ 7d后切口处行成绿色芽点继而
长成不定芽 ,有的不定芽起源于愈伤组织 ,有的直接
从切口处细胞上长出 , 之后不定芽发生频率迅速增
加 ,形成簇生芽(附图 -C、E)。
表 2　叶片接种方式对平邑甜茶和 M7离体叶片再生不定芽的影响
接种方式 平邑甜茶
M7
调查叶片数 再生频率 再生芽数 调查叶片数 再生频率 再生芽数
正放 60 68.3±0.08a 6.15±0.17a 60 45.0±0.11a 3.31±0.05a
反放 60 45.0±0.10b 5.43±0.23b 60 43.3±0.12a 3.23±0.15a
　　从表 3看出 , 不同植物生长调节剂种类 、浓度
及配比对苹果叶片不定芽分化的有重要影响 。 6-
BA2.0mg/L和 IBA0.1mg/L的组合最适于平邑甜
茶叶片不定芽分化 , 6-BA4.0mg/L和 IBA0.3mg/
L的组合最适于 M7叶片不定芽分化。 6-BA与
IBA组合对平邑甜茶不定芽的诱导效果要好于 6-
BA与 NAA的组合 , M7则正好相反 。使用 6-BA
与 IBA组合时 , 平邑甜茶以较低浓度的 6-BA与
低浓度的 IBA组合再生效果好 , 当 6-BA浓度高
于 3.0 mg/L时平邑甜茶不定芽出现玻璃化现象
(附图 -D);M7则以高浓度的 6-BA和较低浓度
的 IBA组合再生效果好 ,且 M7不定芽未出现玻
璃化现象 。从浓度配比来看 , 6 -BA/IBA浓度
比值在 10 ～ 20范围内有利于二者叶片不定芽的
再生 。
2.1.4　不定芽在叶片上再生的位置
分别对平邑甜茶和 M7的不定芽在叶片上的再
生位置进行了调查 。调查结果为平邑甜茶的不定芽
19.50%再生于叶尖部 , 34.50%再生于叶中部 ,
46.02%再生于叶柄部;M7的不定芽 19.17%再生
于叶尖部 , 39.17%再生于叶中部 , 41.46%再生于叶
柄部 。结果表明叶柄部最容易分化出不定芽 ,同时
也观察到叶柄部分化出不定芽的时间要比叶尖部早
2 ～ 3d。
105　2期　　　　　　　　　　　　魏国芹 , 等:平邑甜茶与 M7离体叶片不定芽再生的研究　　　　　　　　　　　　
表 3　植物生长调节剂对平邑甜茶和 M7离体叶片再生不定芽的影响
生长调节剂 (mg/L) 平邑甜茶 M7
6-BA IBA NAA 再生率(%) 再生芽数 再生率(%) 再生芽数
1.0 0.1 — 66.7±0.10bcd 6.29±0.14de 46.7±0.10def 3.00±0.26i
0.3 — 56.7±0.15bcdef 5.35±0.37fgh 40.0±0.18ef 3.33±0.31hi
0.5 — 46.7±0.21def 5.43±0.23fg 36.7±0.15f 2.94±0.29i
— 0.1 50.0±0.21cdef 4.79±0.23ghi 50.0±0.11def 3.39±0.28hi
2.0 0.1 — 93.3±0.24a 8.30±0.08a 70.0±0.11bc 4.82±0.31def
0.3 — 80.0±0.18ab 7.47±0.08ab 60.0±0.13cd 3.89±0.19gh
0.5 — 73.33±0.16abc 6.79±0.14cd 53.3±0.10de 3.06±0.16i
— 0.1 76.7±0.23ab 7.77±0.06ab 73.3±0.16bc 4.30±0.22fg
3.0 0.1 — 76.7±0.20ab 5.47±0.06fg 80.0±0.13ab 5.51±0.07cd
0.3 — 80.0±0.18ab 6.45±0.06de 86.7±0.10ab 5.12±0.23cde
0.5 66.7±0.21bcd 5.49±0.81fg 70.0±0.11bc 4.78±0.12ef
— 0.1 63.3±0.20bcde 5.75±0.08ef 83.3±0.15ab 5.81±0.45c
4.0 0.1 — 40.0±0.13ef 4.39±0.15i 83.3±0.15ab 6.90±0.29b
0.3 — 46.7±0.16def 4.56±0.10hi 96.7±0.08a 8.43±0.07a
0.5 — 33.3±0.16f 3.38±0.15j 93.3±0.10a 5.54±0.07cd
0.1 40.0±0.18ef 4.92±0.30fghi 90.0±0.11a 5.53±0.11cd
2.2　GA3对不定芽伸长的影响
平邑甜茶和 M7经叶片再生获得的新梢在伸长
培养基中培养 3 ～ 4d开始伸长。由表 4可见适合平
邑甜茶新梢伸长的 GA3浓度为 0.5mg/L,适合 M7
新梢伸长的 GA3的浓度为 1.0mg/L。新梢在不添
加 GA3的培养基中的平均高度与添加 0.5mg/L、
1.0mg/L、1.5mg/LGA3的培养基中的平均高度差
异显著 ,与添加 2.0mg/LGA3的培养基中的平均高
度无明显差异 ,说明低浓度的 GA3能促进不定芽的
伸长 ,高浓的 GA3则抑制定芽的伸长。因此适合平
邑甜茶新梢伸长的最佳培养基是 MS+6 -BA
0.3mg/L+IBA0.03mg/L+GA3 0.5mg/L,适合 M7
新梢伸长的最佳培养基是 MS+6-BA0.5mg/L+
IBA0.05mg/L+GA3 1.0mg/L。
表 4　GA3对平邑甜茶和 M7离体新梢伸长的影响
GA3
(mg/L)
平邑甜茶 M7
接种数 平均株高(cm) 生长情况 接种数 平均株高(cm) 生长情况
0 30 3.02±0.07d 正常　　　　 30 2.92±0.95d 正常　　　　
0.5 30 5.94±0.07a 节间最长 　　 30 4.37±1.21 bc 节间较长 　　
1.0 30 5.26±0.07b 节间较长 　　 30 6.02±1.52a 节间最长 　　
1.5 30 4.20±0.07c 苗细弱　　　 30 4.87±0.63 ab 苗细弱　　　
2.0 30 3.08±0.21d 苗细弱 ,叶稍黄 30 3.25±0.87 cd 苗细弱 ,叶稍黄
2.3　生根培养
从表 5可见 ,生长调节剂能明显促进茎段不定
根的形成 ,茎段在未添加任何生长调节剂的培养基
中无根的形成。平邑甜茶在添加 IBA的培养基中
生根最早 ,接种后 11d基部开始形成不定根 , 15d根
长约 0.5 ～ 1cm;M7在添加 NAA的培养基中生根最
早 ,培养 9d基部开始形成不定根 ,两者均在添加
IAA的培养基中生根最晚 。 IAA诱导平邑甜茶和
M7的生根率均低于 75%。NAA浓度从 0.1mg/L上
升到 1.5mg/L, 生根率先增大后减小;IBA浓度从
0.1mg/L上升到 1.5mg/L, 平邑甜茶的生根率逐渐
降低 , M7生根率先增大后减小;IAA浓度从 0.1
mg/L上升到 1.5mg/L,二者的生根率先增大后减
小。另外试验发现 , M7在添加 NAA的培养基中根
106　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　青岛农业大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　26卷　
附图　平移甜茶和 M7的叶片再生情况
表 5　不同生长调剂对平邑甜茶和 M7离体新梢生根的影响
植物生长调节剂
(mg/L)
平邑甜茶 M7
生根率(%) 平均根数 生根率(%) 平均根数
无 0±0h 0±0g 0.0±0i 0±0f
NAA 0.1 70.0±0.14abcd 5.78±0.19c 26.7±0.15h 1.87±0.43e
0.5 83.3±0.17ab 8.46±0.17a 83.3±0.12abc 5.18±0.21c
1.0 63.3±0.07cd 5.53±0.09c 86.7±0.14ab 7.13±0.29b
1.5 23.3±0.15g 2.60±0.66f 66.7±0.12cde 4.18±0.24d
IBA 0.1 86.7±0.14a 7.15±0.40b 30.0±0.14gh 2.17±0.11e
0.5 80.0±0.14abc 6.72±0.56b 80.0±0.07abcd 7.95±0.43ab
1.0 33.3±0.12fg 4.37±0.10d 93.3±0.09a 8.67±0.39a
1.5 26.7±0.15fg 2.87±0.34ef 63.3±0.14def 3.91±0.23d
IAA 0.1 26.7±0.10fg 2.80±0.12f 30.0±0.0.14gh 2.30±0.20e
0.5 56.7±0.10de 3.98±0.16d 60.0±0.15 ef 4.54±0.41cd
1.0 66.7±0.12bcd 6.31±0.05bc 73.3±0.09bcde 5.32±0.06c
1.5 43.3±0.19ef 3.73±0.26de 46.7±0.21 fg 4.20± 0.61d
107　2期　　　　　　　　　　　　魏国芹 , 等:平邑甜茶与 M7离体叶片不定芽再生的研究　　　　　　　　　　　　
部形成大量愈伤(附图 -F),不利于小苗移栽成活 ,
说明 IBA比 NAA更适合 M7诱导不定根。可见适
合平邑甜茶生根的最佳培养基为 1 /2 MS+IBA
0.1mg/L,适合 M7生根的最佳培养基是 1 /2 MS+
IBA1.0mg/L(附图 -G、H)。
2.4　小苗移栽
选取生长健壮的小苗进行移栽 ,移栽前要逐渐
打开组培瓶瓶盖进行炼苗 ,炼苗 5 ～ 6d后将小苗移
植到灭过菌的蛭石基质中 ,遮荫 ,防风 ,相对湿度保
持在 80%左右 ,平邑甜茶移栽成活率可达 90%以
上 , M7移栽成活率可达 80%以上 。
3　讨　　论
1)外植体再生困难是导致遗传转化研究中转
化频率低的主要原因之一 ,因此提高离体叶片的再
生率是提高苹果遗传转化频率的关键 。本试验得到
的平邑甜茶的再生率达 93.3%,比张军科 [ 7]报道的
结果提高了近 6倍 ,比韩小娇 [ 8]报道的结果提高了
近 1 /3倍。这可能与培养条件 、所取试验材料所处
的地理条件和生长状态的不同有关。本试验还首次
建立了 M7叶片再生体系 ,再生率达 96.7%,为以后
的遗传转化奠定了基础。
2)暗培养是影响不定芽分化的一个重要因素 。
吴雅琴 [ 9]等报道昌红苹果叶片不定芽再生须进行
13 ～ 16d的暗培养处理 ,徐凌峰 [ 13]报道梨叶片再生
不定芽须进行 20d的暗培养处理 ,与本试验结果一
致 。需要指出的是本试验暗培养比较试验所获得的
不定芽再生率不够高 ,其原因是当时所用的培养基
非最佳培养基。
3)叶片接种方式对再生不定芽的影响因植物
种类和品种的不同而异 ,昌红苹果叶片接种时远轴
面向下接触培养基再生效果好 [ 12] ,丁霞等[ 14] 、赵凌
泉等[ 15]报道发现 ,叶片接种方式对胡杨和山新杨再
生不定芽无显著影响 。本试验发现平邑甜茶以叶片
远轴面向下接触培养基好 ,叶片接种方式对 M7叶
片再生无显著影响 ,其原因有待于进一步研究 。
4)生长调节剂是诱导外植体再生的关键因素 ,
不同品种叶片对同一生长调节剂组合诱导不定芽的
反应不同。叶片再生率不仅与生长调节剂的种类及
组合有关 ,还与浓度配比有关 ,本试验发现 6-BA
与 IBA的浓度比值为 10 ～ 20左右时最有利于不定
芽的再生 ,这与达克东 [ 16]报道的结果相一致。
5)苹果无性系砧木育苗比较困难 [ 17, 18] 。本试
验建立的平邑甜茶和 M7的高效再生体系亦可以用
于这两种苹果砧木的工厂化育苗 。
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