全 文 ：蔗糖合成酶 （sucrose synthase， EC2.4.1.13）在
糖的分配和代谢中起着重要作用。 该酶也在淀粉合
成[1]、 细胞壁合成 [2-3]、 果实发育 [4]和抗逆性 [5]等生命
活动中扮演着重要作用。 目前， 国内外学者已成
功克隆了小麦 [5]、 玉米 [6]、 水稻 [7]、 甘蔗 [8]、 甜菜 [9]、
甜高粱 [10]、 莫氏兰 （Mokara Yellow） [11]和铁皮石斛
（Dendrobium officinale）[12]等植物的蔗糖合成酶基因，
但是蝴蝶兰（Phalaenopsis spp.）蔗糖合成酶基因的
热带作物学报 2013， 34（4）： 662-668
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2012-08-27 修回日期 2013-03-10
基金项目 广东省农业科学院院长基金项目（No. 201019）。
作者简介 李冬梅（1980年—）， 女， 博士， 助理研究员； 研究方向： 花卉生物技术。 *通讯作者： 吕复兵， E-mail: lvfub@yahoo.com.cn。
蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的 cDNA
克隆及其表达分析
李冬梅， 朱根发， 操君喜， 孙映波， 王 真， 吕复兵 *
广 东 省 农 业 科 学 院 环 境 园 艺 研 究 所
广东省园林花卉种质创新与利用重点实验室 广东广州 510640
摘 要 利用低夜温诱导的蝴蝶兰花芽的抑制消减杂交文库中分离的蔗糖合成酶基因的 ESTs 片段， 采用 RT-
PCR 和 RACE 技术， 从蝴蝶兰花芽中克隆得到蔗糖合成酶基因的全长 cDNA， 命名为 PhSUS， GenBank 登录号
JX162557。 该基因全长 2 816 bp， 包含 147 bp 的 5′非编码区、 218 bp 的 3′非编码区和一个长度为 2 451 bp 编码
816 个氨基酸的开放阅读框 。 PhSUS 预测的分子量为 93.30 ku， 等电点为 5.95。 蛋白同源性分析结果表明 ，
PhSUS 与兰科植物的文心兰、 石斛兰和莫氏兰（Mokara）等的蔗糖合成酶有很高同源性。 保守结构域分析结果表
明， PhSUS 含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及 4 个 ADP 结合位点。 表达分析结果表明， PhSUS
在检测的组织中都有表达， 但表达丰度不同。 PhSUS 在花蕾发育中后期、 成熟花和花器官的表达量都较营养阶
段根和叶中的表达量高。 PhSUS 的克隆为研究其参与花芽分化和发育的表达调控奠定了重要基础。
关键词 蝴蝶兰； 蔗糖合成酶基因； 基因克隆； 序列分析； 基因表达
中图分类号 S682.31 文献标识码 A
cDNA Cloning and Sequence Analysis of a Sucrose Synthase
Gene From Phalaenopsis Hybrid
LI Dongmei, ZHU Genfa, CAO Junxi, SUN Yingbo, WANG Zhen, Lü Fubing
Guangdong Key Lab of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Environmental Horticulture
Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, Guangdong 510640, China
Abstrcat Based on the sequences of expressed sequence tags (ESTs) of a sucrose synthase gene, which obtained
from a suppression subtractive hybridization (SSH) cDNA library of cool-night temperature induced floral buds of
Phalaenopsis hybrid, gene-specific primers were designed to clone the full-length cDNA of the sucrose synase
gene. By using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends
(RACE), the full-length cDNA of the sucrose synase gene was obtained from the floral buds of P. hybrid, named
PhSUS, GenBank accession number JX162557. Sequence analysis indicated that PhSUS was 2 816 bp in full-length,
containing a 5 -untranslated region ( 5 -UTR) of 147 bp, a 3 -UTR of 218 bp, and an opening reading frame
(ORF) of 2 451 bp encoding a 816 predicted amino acids residues. PhSUS had a calculated molecular mass of
93.30 ku and a theoretical isoelectric point of 5.95. Sequence alignment revealed that PhSUS shared 88%~94%
identities with SUS proteins of the cultivars from Oncidium, Dendrobium and Mokara in Orchidaceae. Protein
conserved domain searching results showed that PhSUS contained a GT1 sucrose synthase domain, a GTB type
superfamily of glycosyltransferase and four putative ADP-binding pockets. Expression analyses revealed that PhSUS
was expressed in all tested tissues, but showed different expression patterns in tissues examined. The transcripts of
PhSUS was higher levels in the middle and later floral bud development stages, mature flowers and floral organs
than in vegetative stage of roots and leaves. The cloning of PhSUS was of great importance for further studies on
the expression and regulation of which was involved in the differentiation and development of floral buds.
Key words Phalaenopsis orchid; Sucrose synthase gene; Gene cloning; Sequence analysis; Gene expression
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2013.04.014
第 4 期 李冬梅等： 蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的 cDNA克隆及其表达分析
图 1 蝴蝶兰研究材料
40 mm bud Fs1 Fs2 Fs3 Fs4 Fs5
Fs6
克隆及其功能研究还未见相关报道。
蝴蝶兰属兰科（Orchidaceae）蝴蝶兰属（Phalaenopsis）
植物， 其体态轻盈， 花色艳丽， 色泽丰富， 具有极
高的观赏和经济价值。 由于大部分蝴蝶兰品种的花
期在 3～5 月份， 为提高商品价值， 必须调节蝴蝶
兰的花期， 使其达到全年开花， 特别是应中国传统
节日春节开花。 目前， 多采用低温处理[13]来调节蝴
蝶兰的花期以应对消费者在不同时间的需求。 低温
对蝴蝶兰叶片和腋芽产生一系列生理生化的变化，
如低温处理 2～3 周后， 蝴蝶兰叶中的蔗糖含量增
加， 且叶中的蔗糖含量与低温处理使其花梗出现的
天数呈显著正相关 [14]。 然而， 关于蔗糖代谢中的关
键酶基因蔗糖合成酶基因在低温诱导蝴蝶兰花芽分
化与发育过程中的分子作用机理尚不清楚。
前期研究， 本实验室用一个需低温处理才能花
芽分化与发育的蝴蝶兰杂交种 P. hybrid Fortune
Saltzman， 采用抑制消减杂交技术（SSH）， 构建了
以该品种经低夜温诱导的花梗芽与其不经低夜温处
理的顶端生长组织为材料的 SSH cDNA 文库， 获
得两个不重叠的蔗糖合成酶基因片段（GenBank登录
号 JK720478 和 JK720585）。 本研究从低夜温诱导
的蝴蝶兰花梗芽中克隆蔗糖合成酶基因的全长
cDNA 序列， 利用生物信息学方法分析了其核酸及
其推导的氨基酸序列， 并用半定量 RT-PCR 检测
了其在营养阶段的根和顶叶、 低温诱导的不同发育
阶段的花蕾、 成熟花及花器官中的表达水平， 以期
为蔗糖合成酶基因在蝴蝶兰花芽分化和发育中的作
用机理和抗逆性等功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 蝴蝶兰杂交种为 P. hybrid Fortune
Saltzman， 种植于广东省农业科学院环境园艺研究
所温室。 将至少有 5片成熟叶的未开花植株置于温
室 [昼 （28±2）℃， 湿度 70％～95％ /夜 （21±1.5）℃ ，
湿度 100％]中进行低夜温处理。 研究涉及的材料：
（1）低夜温诱导的花梗芽 40 mm； （2）5个不同发育
阶段的花蕾 Fs1～Fs5； （3）开花 2 d 内的花 Fs6 及花
器官如子房、 萼片、 花瓣、 唇瓣和蕊柱； （4）未经
低夜温处理植株的营养阶段顶叶和根（图 1）。 以上
材料用液氮速冻， -70℃保存备用。
1.1.2 菌株与试剂 Escherichia coli DH5α购自鼎
国公司， LA Taq、 rTaq、 pMD-18T vector、 DNase
Ⅰ（RNase free）和 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA
Synthesis Kit 购自 TaKaRa 公司， 胶回收试剂盒购
自 TIANGEN 公司， SMARTTM PCR cDNA Synthesis
Kit 购自 Clontech 公司， DL2000 DNA Marker 购自
普博欣公司， 其它常规试剂为国产分析纯试剂。 引
物合成和 DNA测序由 Invitrogen公司完成。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA的提取与基因克隆模板 cDNA的合成
蝴蝶兰 40 mm 花梗芽总 RNA 提取参照前述方法[15]。
取 1.0 μg 花梗芽的总 RNA 为反转录模板 ， 按
SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit 操作步骤， 先
合成第一链cDNA（ss cDNA）， 然后扩增全长双链
cDNA（ds cDNA）。 -20 ℃保存用于蝴蝶兰蔗糖合
成酶基因的 cDNA克隆。
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第 34 卷热 带 作 物 学 报
蝴蝶兰蔗糖合成酶基因中间片段和 3′RACE 的
扩增程序均为： 94℃ 4 min； 94℃ 30 s， 59℃ 30 s，
72 ℃ 1.5 min， 31 个循环； 72 ℃ 7 min。 该基因 5′
RACE 先用 UPM 和 FS322.R 进行第 1 次 PCR； 第
一次 PCR 产物稀释 20 倍取 1.0 μL 作为第 2 次
PCR的模板； 用 NUP和 FS322.R进行第 2 次 PCR；
反应程序为 94 ℃ 4 min； 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，
72 ℃ 1.5 min， 31 个循环； 72 ℃ 7 min。 PCR 反应
体系为 25 μL， 包含 10×LA Buffer（Mg2+）2.5 μL，
dNTP Mix（10 mmol/L each）1.0 μL， LA taq（5 U/μL）
0.2 μL， 去离子水 18.3 μL， 10 μmol/L 正反向引物
各 1.0 μL， 稀释的 ds cDNA 1.0 μL。
PCR 产物用 1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后，
胶回收试剂盒回收目的片段。 将回收产物连接到
pMD-18T载体， 转化 E. coli DH5α感受态细胞。 蓝
白斑筛选阳性菌落， 菌液 PCR鉴定后送公司测序。
1.2.3 序列的生物信息学分析 测序结果用
Clustal X 1.8 软件进行拼接成全长 cDNA[16]； 用
BioXM 2.0 软件进行蝴蝶兰蔗糖合成酶基因 cDNA
的翻译； 用 NCBI 的 BLAST[17]和Expasy（http://www.
expasy.org）进行序列分析、 蛋白分子量和等电点预
测， 以及保守结构域分析； 在 NCBI 搜索各物种的
蔗糖合成酶同源蛋白序列， 用 Clustal X 1.8进行多
重序列比对， 用 Mega 4.0软件构建分子系统树[18]。
1.2.4 PhSUS 基因表达研究 分别提取营养阶段
顶叶和根、 低温诱导的不同发育阶段的花蕾、 成熟花
及各花器官样品的总 RNA， 用 DNaseⅠ（RNase free）
消化后分别取 1.0 μg， 按 PrimeScriptTM 1st Strand
cDNA Synthesis Kit 的说明反转录成 ss cDNA，
-20 ℃保存用于 PhSUS 基因的表达分析 。 利用
PhSUS 基因的特异性引物 PhSUS F 和 PhSUS R（表
1）进行半定量 RT-PCR， 分析 PhSUS 基因在不同
组织的表达特性。 选用蝴蝶兰 actin（AY134752）为
内参基因， 设计引物 Phactin F 和 Phactin R（表1），
在相同条件下扩增。
半定量 RT-PCR反应体系 25μL， 包括 10×Buffer
（Mg2+）2.5 μL， dNTP Mix（10 mmol/L each）1.0 μL，
r Taq（5 U/μL）0.2 μL, 去离子水 17.3 μL， 10 μmol/L
正反向引物各 1.0μL， 稀释 20倍的 ss cDNA 2.0μL；
扩增程序为 94 ℃ 4 min； 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s，
72℃ 1 min， 31个循环； 72℃ 7 min。 PCR产物用
1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。
5′RACE adapter-primer Phalaenopsis hybrid sucrose synthase cDNA 3′RACE adapter-primer
JK720478 JK720585
FS322.R FS322.F FS564.R FS564.F 3′RACE PNUP
ATG TGA
图 2 蝴蝶兰蔗糖合成酶基因 cDNA 的克隆图解
1.2.2 蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的 cDNA克隆 根据
SSH文库分离的 EST片段 （JK720478和JK720585），
采用 Primer premier 5.0 软件设计扩增蝴蝶兰蔗
糖合成酶基因 cDNA 的中间片段、 5′RACE 和 3′
RACE 片段的引物。 具体克隆策略见图 2， 引物序
列见表 1。
PCR 引物名称和序列（5′→3′） PCR产物大小/bp
FS322.R： GATACAGGCTTTCCTTGTCATAG
682UPM： CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCTAATACGACTCACTATAGGGC
PhSUS
Middle
FS322.F： GCAGTTTCTGAATCGCCATCTTT
1 490
FS564.F： ATCTGGCGTTTATGGTTTCTGG
375
3′RACE P： AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT（30）N-1N（N=A, C, G, 或 T； N-1=A, G, 或 C）
PhSUS
RT-PCR
PhSUS F： CCTGTATCCGCTGCTCAAT
554
Phactin
RT-PCR
Phactin F： TGGAAACTGCCAAGACG
586
Phactin R： GCAGCGAAGATTCAAAA
NUP： AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
FS564.R： CGCCATTGCGGACTCTGTTCATC
PhSUS R： GCTCAGTCCCAATAACCTTC
PhSUS
3′RACE
PhSUS
5′RACE
表 1 PCR 引物
664- -
第 4 期 李冬梅等： 蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的 cDNA克隆及其表达分析
2 结果与分析
2.1 蝴蝶兰蔗糖合成酶基因全长 cDNA的克隆
为克隆蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的全长 cDNA， 笔
者根据低夜温诱导的蝴蝶兰花梗芽的 cDNA-SSH文
库中的 2个不重叠的蔗糖合成酶基因片段（JK720478
和JK720585）（图 2）， 扩增该基因的中间片段、 5′
和 3′端， 分别得到约 1 500、 720、 400 bp 的 DNA
片段（图 3）， 测序后证实为目的序列。 将 JK720478、
JK720585、 中间片段、 5′和 3′端序列进行拼接， 得到
全长 cDNA序列为2 816 bp， 命名为 PhSUS， GenBank
登录号 JX162557。
2.2 PhSUS基因及其推导的氨基酸序列的生物信息
学分析
PhSUS的 cDNA序列在 147 bp处有起始密码子
ATG， 在2 595 bp处有终止密码子 TGA， 在2 788 bp
处有 polyA 附加信号， 该序列的开放阅读框编码一
个包含 816 个氨基酸的多肽（图 4）。 tBlastx 分析显
示， PhSUS 的 cDNA 序列与 O. hybrid（JF416946）、
2 000
500
bp
1 M 2 M 3 M
M. DL 2 000； 泳道 1~3 分别为蝴蝶兰蔗糖合成酶
基因的中间片段、 5′RACE 和 3′RACE PCR 产物。
图 3 蝴蝶兰蔗糖合成酶基因 cDNA 的克隆
ATG为起始密码子， TGA为终止密码子。
图 4 蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的 cDNA 序列和推导的氨基酸序列
665- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
O. Goldiana（AF530567）、 铁皮石斛 （D. officinale）
（HQ856835）和莫氏兰（M. Yellow）（AF530568）的蔗
糖合成酶基因具有很高同源性， 分别为 93％、 92％、
89％和 88％。
BlastP 分析结果表明 ， PhSUS 与 O. hybrid
（AEA76429）、 O. Goldiana（AAM95943）、 铁皮石斛
（D. officinale）（ADY02961）和莫氏兰 （M. Yellow）
（AAM95944）的蔗糖合成酶同源性分别为 94％、 93％、
89％和 88％。 PhSUS预测的分子量为 93.30 ku， 等
电点为 5.95。 保守结构域分析结果表明， 此蛋白含
有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及 4
个 ADP结合位点（图 5）。
系统进化分析结果表明， 蔗糖合成酶可分成两
大类 ClassⅠ和Ⅱ， 其分别来自单子叶和双子叶植
物（图 6）。 ClassⅠ又分为三组： GroupⅠ、 Ⅱ和Ⅲ。
PhSUS 位于 GroupⅠ， 其与 GroupⅠ的蔗糖合成酶
同源性为 84％～94％， 与 GroupⅡ和Ⅲ的蔗糖合成
酶同源性为 79％～81％。 PhSUS 与 GroupⅠ中的 O.
hybrid（AEA76429）和O. Goldiana（AAM95943）的亲
缘关系最近 （图 6）。
图 5 蝴蝶兰蔗糖合成酶 PhSUS 蛋白的保守结构域
AEA76429-Oncidium hybrid
AAM95943-Oncidium Goldiana
PhSUS-Phalaenopsis hybrid
AAM95944-Mokara Yellow
ADY02961-Dendrobium officinale
CAA65640-Tulipa gesneriana
AEO09338-Musa acuminata AAA Group
AAA68209-Zea mays
AAC41682-Oryza sativa Japonica Group
CAA49551-Hordeum vulgare subsp. vulgare
CAA03935-Triticum aestivum
BAE79815-Lolium perenne
AEX98033-Sorghum bicolor
AAM68126-Saccharum officinarum
NP_001237525-Glycine max
BAH56282-Vigna angularis
ADW80558-Populus tomentosa
AEV40460-Gossypium arboreum
BAA89049-Citrus unshiu
ClassⅡ
GroupⅢ
GroupⅡ
ClassⅠ
GroupⅠ
0.02
100
100
100
100
97
63
93
100
97
100
89
78
100
100
100
100
刻度代表遗传距离为 0.02； 各节点处数字表示重复 1 000 次分析的 bootstrap 值。 蝴蝶兰 PhSUS 用●标记。
图 6 不同物种蔗糖合成酶的系统进化分析
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第 4 期 李冬梅等： 蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的 cDNA克隆及其表达分析
3 讨论与结论
本研究克隆到蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的全
长 cDNA， 命名为 PhSUS。 PhSUS 的 cDNA 全长
2 816 bp， 编码 816 个氨基酸。 PhSUS 蛋白含有蔗
糖合成酶、 葡糖基转移酶两个保守功能域及 4 个
ADP 结合位点。 系统进化分析结果表明， PhSUS
与单子叶文心兰属植物的蔗糖合成酶的亲缘关系最
近。 这些结果表明， PhSUS可能是蝴蝶兰蔗糖合成
酶基因的同源基因。
蝴蝶兰花芽的分化和发育是其生长发育的重要
阶段， 是其花的品质形成与调控的生物学基础， 对
其进行研究具有十分重要的理论与实践意义。 低温
处理后的蝴蝶兰叶片中的蔗糖含量与低温处理使其
花梗出现的天数呈显著正相关[14]， 表明蔗糖与低温
诱导蝴蝶兰花芽分化和发育有着密切关系。 因此，
研究蔗糖代谢的关键酶基因蔗糖合成酶基因与蝴蝶
兰花芽分化和发育的关系显得极为重要。 本研究采
用半定量 RT-PCR 分析结果表明， PhSUS 在低夜
温诱导的不同发育时期的花蕾、 成熟花和不同花器
官中都有不同程度的表达。 这与甜菜的蔗糖合成酶
基因 （SBSS2）的研究结果相同 ， 而与兰科莫氏兰
（M. Yellow）的蔗糖合成酶基因（Msus1）的研究结果
不同。 SBSS2 在甜菜花芽中有高水平的表达 [9]， 而
Msus1 在莫氏兰（M. Yellow）花中的表达量几乎检
测不到[11]。 蔗糖合成酶基因主要参与调控植物储存
组织的生长， 如玉米的淀粉合成 [1]和细胞壁合成 [2]
等， 其也参与调控苹果果实的发育 [4]和小麦的抗逆
性 [5]等。 上述结果表明， 植物的蔗糖合成酶基因除
主要参与储存组织的生长外， 其也参与植物的抗逆
性、 果实的发育及花芽的分化和发育等生命活动。
PhSUS 基因的克隆为蝴蝶兰糖代谢和分配在花芽
发育中的表达调控机理、 抗逆性等方面的功能研
究奠定了基础。 笔者将对该基因的功能做进一步的
研究。
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2.3 PhSUS基因的表达分析
PhSUS在营养阶段顶叶、 根、 低温诱导的不同
发育阶段的花蕾、 成熟花及花器官萼片、 花瓣、 唇
瓣、 蕊柱和子房中的表达情况见图 7。 由图 7 可看
出， PhSUS在检测的组织中都有表达， 但表达量不
同。 在花蕾发育早期（Fs1和Fs2）同营养阶段根和
叶中的表达量相当， 随着花蕾的发育（Fs3~Fs5），
PhSUS 的表达量先上升（Fs3）并至最高（Fs4）， 后略
有下降（Fs5）。 在成熟花（Fs6）、 萼片和唇瓣中的
表达量同花蕾发育期 Fs4 的表达量相当， 在花瓣、
蕊柱和子房中的表达量同花蕾发育期 Fs3 的表达量
相当。
M 表示 DL 2 000 DNA Marker； Fs1～Fs5 表示花蕾发育的 5 个不同阶段； Fs6、 SE、 PE、 LIP、
CO、 OV、 R和 L 分别代表成熟花、 萼片、 花瓣、 唇瓣、 蕊柱、 子房、 营养阶段根和顶叶。
图 7 半定量 RT-PCR 分析 PhSUS 基因在不同组织中的表达
M Fs1 Fs2 Fs3 Fs4 Fs5 Fs6 SE PE LIP CO OV R L
PhSUS
Phactin
500
bp
500
RNA
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责任编辑： 沈德发
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