全 文 ：硫酸铜 ,硝酸银和脱落酸对草地早熟禾胚性愈伤
诱导的影响
罗　莉1 ,韩烈保1 ,高彩霞2 ,Klaus K Nielsen2
(1.北京林业大学草坪研究所 ,北京　100083;2.DLF Trifolium A/S ,
Store Heddinge ,Denmark　4660)
　　摘要:试验以草地早熟禾 4个品种的成熟种子为外植体 ,研究了 CuSO 4 、A gNO 3 、脱落酸(ABA)对
草地早熟禾胚性愈伤诱导的影响 ,结果表明 , K3诱导培养基中添加 CuSO4对草地早熟禾胚性愈伤组织
的形成有促进作用 ,除 DP192-10之外的 3个品种都发生了明显的形态上的变化 , DP-LF-300和 2W42-
117在添加 5 μmol/L CuSO 4的培养基上诱导出了乳白色 、致密的胚性愈伤组织 ,2W42-117的胚性愈伤
率高达 40%。在 MS 基本培养基中添加 AgNO 3 、ABA 对草地早熟禾 4个品种的胚性愈伤组织的诱导
没有作用。
　　关键词:草地早熟禾;胚性愈伤组织;A gNO 3 ;ABA;CuSO 4
　　中图分图号:Q 813;S 336　　文献标识码:A　　文章编号:1009-5500(2005)04-0020-05
　　草地早熟禾(Poa pratensis)具有兼性无融合生殖
特性[ 1] ,利用传统育种方式改良品种有一定困难 ,而通
过基因转化手段则可以获得具有优良性状的植株 。一
个完善 、成熟的组织培养体系是基因成功转化的前提
条件[ 2] 。最早对草地早熟禾进行研究的是 1984 年
R E M cdonnell等[ 3] ,此后大都讨论不同品种 、不同外
植体 、不同激素浓度对诱导愈伤组织及再生的影
响[ 4 ～ 17] 。
　　近年来 ,植物激素在组织培养中的作用得到广泛
关注 ,在草坪草的愈伤组织诱导中 ,对于松软无定型 、
呈果冻状或棉絮状的愈伤组织 ,添加ABA可使之转变
为结构致密的胚性愈伤组织[ 18 ～ 20] 。
　　硝酸银(AgNO3)可明显抑止乙烯产生 ,促进器官
发生及体细胞胚胎发生。在硬质小麦组织培养中测试
了 5个浓度的 AgNO3 ,结果表明随着浓度升高 ,胚性
个体显著增加[ 21 , 22 , 23] 。
　　组织培养中常用的另一种化学物质是 CuSO 4 。
　　收稿日期:2005-03-04
　　基金项目:丹麦 DLF-T rifolium 公司科研部资助
　　作者简介:罗莉(1978-), 女 ,新疆吉木萨尔县人 , 该公司在
读硕士。高彩霞为通讯作者。
Chi 等[ 18]证明在草地早熟禾品种 Kenblue 的诱导培养
基中添加 0.1 μmo l/L 的硫酸铜(CuSO 4)能显著提高
诱导率 、生长速率和胚性愈伤率 , 而 5 μmol/ L 的
CuSO 4能提高再生率 。
　　试验初步探讨了脱落酸(ABA), AgNO 3 , CuSO 4
在草地早熟禾胚性愈伤形成过程中的影响。
1　材料和方法
1.1　材料
　　试验采用草地早熟禾品种 DP-LF-300 、2W42-
117 、82-37 、DP192-10的成熟种子作为外植体 ,种子由
DLF-T rifolium 公司提供 。
1.2　方法
1.2.1　种子的表面消毒与无菌接种　适量早熟禾成
熟种子浸入 70%酒精消毒 30 s ,无菌水冲洗 2 ～ 3次 ,
15%的次氯酸钠溶液添加 2滴 tween冰消毒 30 min ,
无菌水冲洗 5 ～ 6次 。
1.2.2　培养基　K3培养基:MS 基本培养基+2 , 4-D
(2 mg/L)+6-BA(0.1 mg/L)+30 g/ L麦芽糖+3.75
g/L gelrite , pH 调至 5.8。
　　试验的 8种培养基为 K3 培养基添加不同浓度的
CuSO 4 , AgNO 3 , ABA ,培养基的组成(表 1)。
20 Grassland and Turf　　(Bimonthly)　　2005　　No.4　　(Sum 　No.111)DOI :10.13817/j.cnki.cyycp.2005.04.004
表 1　各培养基的具体成分
培养基编号 成分
D M S 基本培养基+2 , 4-D(2 mg/ L)+6-BA(0.1 mg/ L)+30 g/ L麦芽糖+3.75 g/ Lgelrite +0.1μmo l/ L CuSO 4 · 5H 2O
DBC2 M S 基本培养基+2 , 4-D(2 mg/ L)+6-BA(0.1 mg/ L)+30 g/ L麦芽糖+3.75 g/ L gelrite +5μmo l/ L CuSO 4 · 5H2O
DBC3 MS 基本培养基+2 , 4-D(1 mg/ L)+6-BA(0.5 mg/ L)+30 g/ L 麦芽糖+3.75 g/ Lgelrite+5 μmol/ L CuSO4 · 5H2O
K3A2 MS 基本培养基+2 , 4-D(2 mg/ L)+6-BA(0.1 mg/ L)+30 g/ L 麦芽糖+3.75 g/ L gelrite +2 mg/ L ABA
K3A4 MS 基本培养基+2 , 4-D(2 mg/ L)+6-BA(0.1 mg/ L)+30 g/ L 麦芽糖+3.75 g/ L gelrite +4 mg/ L ABA
K3A5 MS 基本培养基+2 , 4-D(2 mg/ L)+6-BA(0.1 mg/ L)+30 g/ L 麦芽糖+3.75 g/ L gelrite +5 mg/ L ABA
K3Ag0.1 MS 基本培养基+2 , 4-D(2 mg/ L)+6-BA(0.1 mg/ L)+30 g/ L 麦芽糖+3.75 g/ L gelrite +0.1 mg/ L AgNO 3
K3Ag1 MS 基本培养基+2 , 4-D(2 mg/ L)+6-BA(0.1 mg/ L)+30 g/ L 麦芽糖+3.75 g/ L gelrite +1 mg/ L AgNO 3
　注:所有培养基 pH 为 5.8 ,再生培养基 M 1g:MS 基本培养基+激动素(0.2 mg/ L)+30 g/ L 蔗糖+3 g/ L gelrite , pH 为 5.8
1.2.3　试验方法　消毒后的种子在无菌条件下接种
至 K3诱导培养基上 , 25 ℃黑暗培养 ,此后每 14 d 在
K3培养基上继代 1 次。56 d 后分别选取 4 个品种诱
导的愈伤组织继代到添加不同浓度 、不同添加物的 8
种试验培养基上 ,每 14 d在同样的试验培养基上继代
1次 ,继代 3次后观察并记录试验结果 。同时选取愈伤
组织继代到再生培养基 M1g 上 , 16 h 光照/8 h 黑暗 ,
25 ℃再生 ,42 d后纪录再生率 。发育良好的再生植株
移入温室 。
　　再生率=再生出植株的愈伤数/愈伤总数×100%
　　胚性愈伤率=胚性愈伤数/愈伤总数×100%
　　褐化率=褐化愈伤数/愈伤总数×100%
　　毛状根率 =长出毛状根的愈伤数/愈伤总数 ×
100%
2　结果与分析
2.1　不同品种对愈伤组织诱导的影响
　　草地早熟禾 4个品种的成熟种子接种于 K3诱导
培养基 25 ℃暗培养 , 20 d后 4个品种均能诱导出乳白
色 、表面湿润的愈伤组织。但不同品种在愈伤生长速
度 、愈伤形态上存在明显差异 。DP-LF-300能较快的
诱导出愈伤组织 ,并且愈伤组织生长迅速 ,14 d后可在
显微镜下观察到颗粒状结构 ,继代 2 ～ 3次后愈伤组织
由白色浆状转为黄色或半透明 、干燥的愈伤组织;
DP192-10诱导愈伤组织较慢 ,并且生长缓慢 ,在 K3诱
导培养基上生长 56 d后 ,只能形成白色或半透明浆状
愈伤组织(表 2)。
表 2　不同品种对愈伤组织诱导的影响
品种 愈伤形态
82-37 愈伤生长速度中等 ,水分含量高 , 较软 ,没有结
构 ,透明或半透明
DP-LF-300 愈伤生长迅速 ,有颗粒状结构出现 , 干燥 ,半透
明或者黄色
2W42-117 愈伤生长迅速 ,有颗粒状结构出现 , 干燥 ,半透
明或者黄色
DP192-10 愈伤生长缓慢 ,水分含量高 , 没有结构 ,半透明
或白色浆状
2.2　CuSO4对胚性愈伤诱导的影响
　　诱导 56 d 的愈伤组织转移到添加不同浓度的
CuSO 4的培养基 D ,DBC2和 DBC3 上 , 42 d 后记录胚
性愈伤率(表 3)。
　　除 DP192-10之外的其他 3 个品种的愈伤组织都
发生了明显的形态变化(表 3)。2W42-117和 DP-LF-
300在添加 CuSO 4的培养基上 ,愈伤组织从没有结构 、
含水量高转为表面干燥 、具有颗粒状结构 ,并且出现了
白色 、紧密的胚性愈伤组织 。对不同品种来说 ,在添加
5 μmo l/L CuSO 4的培养基上获得了较好的愈伤 ,胚性
愈伤组织的诱导率也是最高的。3个品种之间的差异
主要表现在胚性愈伤组织的诱导率上 , DP-LF-300在
添加 5μmol/L CuSO 4的培养基上表现最好 ,最快诱导
出胚性愈伤组织 ,并且愈伤组织的质量比较高 ,白色 、
紧密的颗粒状 , 生长迅速 。 2W42-117 在添加 5
μmol/ L CuSO4的培养基上胚性愈伤诱导率高达 40%,
21草原与草坪　　2005年　　第 4期　　总第 111期
但愈伤组织生长不均 。
表 3　CuSO4对胚性愈伤组织诱导的影响
　 品种 愈伤 胚性愈 胚性愈伤 毛状根
总数 伤数 率 / %率 / %
K3 82-37 45 0 0 0
　 DP-LF-300 45 6 13.3 11.1
　 2W42-117 45 0 0 0
DP192-10 45 0 0 0
D 82-37 45 0 0 0
DP-LF-300 45 8 17.8 0.44
　 2W42-117 45 0 0 42.2
DP192-10 45 0 0 0
DBC2 82-37 45 0 0 0
DP-LF-300 45 5 11.1 11.1
2W42-117 45 13 28.9 0
DP192-10 45 0 0 0
DBC3 82-37 45 0 0 2.2
DP-LF-300 45 10 22.2 26.7
2W42-117 45 18 40 0
DP192-10 45 0 0 0
2.3　ABA对愈伤组织的影响
　　将在 K3诱导培养基上诱导 2 个月的愈伤组织分
别转入含有不同浓度 ABA 的培养基上 ,暗培养 7 d愈
伤组织开始表现出不同的反应(表 4), ABA 明显增加
了 82-37 愈伤组织上毛状根的生成 ,并且随着浓度的
增加 ,生成的毛状根也不断增多。对 DP-LF-300 和
2W42-117而言 ,随着 ABA 浓度增加 ,愈伤褐化的情况
也随之严重。A BA 的添加对 DP192-10的愈伤组织形
态没有改变。
　　ABA 对胚性愈伤组织的形成均没有作用 , 4个诱
导品种在添加 ABA 的培养基上都没有形成胚性愈伤
(表 4)。
2.4　AgNO3对愈伤组织影响
　　愈伤组织继代到添加 A gNO 3的培养基 K3Ag0.1
和K3Ag1上后 ,少数愈伤组织在7 d后生长迅速 ,但是
大多数愈伤组织在 42 d内形态上并没有明显的变化。
除 DP192-10之外 ,其余的 3个品种的愈伤组织在添加
了AgNO3的 2种培养基上都有毛状根的生成 。
2.5　不同品种再生率的比较
　　在 K3诱导培养基上培养 2 个月的愈伤组织转入
M1 g 再生培养基中再生 。愈伤组织可以分为 2类 ,一
类是水状 、透明没有任何结构的愈伤组织 ,生长缓慢;
另一类是干燥 、半透明 、具有颗粒状结构的愈伤组织 ,
生长迅速。试验结果表明 ,干燥且具颗粒状结构的愈
伤组织较易再生出绿色植株 ,而水状没有结构的愈伤
组织则较易再生出毛状根 。
　　在光照下再生4 2d后统计绿苗的数目 ,计算再
生率(表 5)。
表 4　ABA对愈伤组织的影响
ABA 浓度
/ mg · L-1 品种
外植体 褐化愈 褐化 毛状根 毛状根
数目 伤数 率 / %愈伤数 率 / %
0 82-37 45 0 0 0 0
DP-LF-300 45 3 6.7 5 11.1
2W42-117 45 5 11.1 0 0
DP192-10 45 0 0 0 0
2 82-37 45 2 4.4 2 4.4
DP-LF-300 45 22 48.9 0 0
2W42-117 45 39 86.7 0 0
DP192-10 45 0 0 0 0
4 82-37 45 0 0 5 11.1
DP-LF-300 45 35 77.8 1 2.2
2W42-117 45 44 97.8 0 0
DP192-10 45 0 0 0 0
5 82-37 45 0 0 40 88.9
DP-LF-300 45 45 100 0 0
2W42-117 45 45 100 0 0
DP192-10 45 0 0 0 0
　　在 M1 g 培养基上 , 2W42-117和 DP-LF-300均在
9 d后发现芽原基 , 部分芽原基发展成完整的植株 。
82-37分化大多只能形成毛状根。DP192-10非常难于
再生 ,在 2个月的再生试验中 ,没有再生出任何植株 。
再生植株中没有发现白化苗。
22 Grassland and Turf　　(Bimonthly)　　2005　　No.4　　(Sum 　No.111)
表 5　再生率
品种 外植体数目 再生愈伤数 再生率 / %
82-37 45 7 15.6
DP-LF-300 45 10 24.5
2W42-117 45 13 28.9
DP192-10 60 0 0
3　结论
　　试验中 ,DP-LF-300和 2W42-117在添加了CuSO 4
的培养基上都诱导出了胚性愈伤 ,且具有较快的生长
速度 ,与 Chi不同的是 ,在添加 5 μmo l/L CuSO 4的培
养基上胚性愈伤率和生长速率最高 ,2W42-117在添加
了5 μmo l/L的 CuSO 4的培养基上胚性诱导率高达
40%。同时 ,CuSO 4的添加也促进了植株的再生 , DP-
LF-300 和 2W42-117 在添加 0.1 μmo l/L CuSO 4和
5μmo l/L CuSO 4的培养基上均再生出绿芽(数据未
示),而对照则没有。试验初步探讨了 CuSO4对草地早
熟禾 4个品种的胚性愈伤诱导率的影响 ,获得了初步
的成果 ,建议在今后的工作中开展相关方面的研究 。
　　ABA 在草坪草的组织培养中的作用已见报
道[ 22 ～ 24] , ABA 能够促进体细胞胚胎发生 ,在愈伤组织
诱导中 , 添加 ABA 有助于体胚的成熟 。低浓度的
ABA 对保持愈伤组织的致密 、稳定 、结构 、提高愈伤组
织的胚性具有重要作用 。试验中 ,测试了 0 、2 、4 、5
mg/L 4个浓度 ,对 4个品种的愈伤组织的胚性诱导均
没有作用 ,而褐化愈伤和毛状根的生长明显增多。
　　近年来对 AgNO 3在单 、双子叶植物离体培养中的
作用已有研究[ 18 ～ 20] ,证明 AgNO 3可明显抑止乙烯产
生 ,促进器官发生及体细胞胚胎发生 ,还可防止愈伤组
织的褐化 。试验测试了 0 、0.1和 1 mg/L 浓度的 Ag-
NO 3对胚性愈伤诱导的影响 ,结果证明 AgNO3对草地
早熟禾 4个品种的愈伤组织没有作用。
　　试验所选择的 4个品种在再生率上有明显差异 ,
DP192-10在试验中没有得到再生植株 , 2W42-117 再
生率最高为 28.9%。成熟种子诱导的愈伤再生率比
较低 ,P Van等[ 4] 用成熟种子做外植体再生率最高是
Baron 只有 3%,而用未成熟胚做外植体再生率高达
40%。因此 ,在建立植物组织培养体系时 ,品种和外植
体的选择非常重要。
参考文献:
[ 1] 　Albertini E , Barcaccia G , Porceddu A , et al .Mode o f re-
production is detected by Par th1 and Sex1 SCAR markers
in a wide range of facultativ e apomictic Kentucky blue-
g ra ss va rietie s[ J] .M olecula r Breeding , 2001 , (7):293 ～
300.
[ 2] 　王关林 ,方宏筠.植物基因工程原理与技术[ M] .北京:科
学出版社 , 1998.185 ～ 189.
[ 3] 　McDonnell R E , Conger B V.Callus induction and plant-
let fo rma tion from mature embryo explants o f Kentucky
blueg ra ss [ J] .Crop Science , 1984 , 24:573 ～ 578.
[ 4] 　Vander P , Valk M A , Zaal C M J , et al.Regene ration of
albino plantle t f rom suspension culture derived pro toplasts
of Poa pratensis L.(Kentucky Blueg rass)[ M ] .Euphy ti-
ca , 1988.169～ 176.
[ 5] 　Boyd L L A , Dale P J.Callus P roduc tion and P lant Re-
genera tion from Mature Embryo s of Poa pratensis[ J] .
P lant Breeding , 1986 , 97:246～ 254.
[ 6] 　朱根发 ,余毓君.草地早熟禾的组织培养条件和分化能力
研究[ J] .华中农业大学学报 , 1994 , 13(2):199 ～ 203.
[ 7] 　Valk P V , Zeal M A.Creemer s-M olenaar [ J] .Somatic
embryogenesis and plant reg ener ation in inflo rescence and
seed deriv ed callus cultur es o f(Kentucky blueg rass)[ J] .
P lant Cell Repo rt , 1989 , (7):644～ 647.
[ 8] 　Kirsten A N , Else L E.Regene ration o f pro toplast-de-
rived g reen plants o f Kentucky blueg rass (Poa pratensis
L.)[ J] .P lant Cell Repo rt , 1993 , (12):537 ～ 540.
[ 9] 　Valk P V , Ruis A M , Te ttelaar S , et al.Optimizing plant
reg ene ration f rom seed-de rived callus cultur es of Kentucky
bluegr ass[ J] .Plant Cell , T issue and O rgan Cultur e,
1995 , 40:101 ～ 103.
[ 10] 　Jeff rey D , Griffin , Margaret S , et a l.High-frequency
plant reg ener ation from seed-derived callus cultures of
Kentucky bluegr ass(Poa pratensis L.)[ J] .P lant Cell
Repor ts , 1995 , 14:721 ～ 724.
[ 11] 　Shan Q K , Chiw on W L.Plant regeneration in Kentucky
blueg rass(Poa pratensis L.)via co leoptile tissue culture
[ J] .P lant Cell Repo r t.1996 , 15:882 ～ 887.
[ 12] 　Kirsten A N , Elisabeth K.Regene ration o f G reen Plants
f rom Embryogenic Suspension Cultures of Kentucky Blue
G rass(Poa pratensis L.)[ J] .J.P lant Phy siol , 141:589
～ 595.
[ 13] 　Piepe r M A , Smith M A.Who le P lant M icroculture Se-
lection Sy stem for Kentucky Blueg rass[ J] .Crop Science,
1988 , 28:611～ 614.
23草原与草坪　　2005年　　第 4期　　总第 111期
[ 14] 　Van H F , Zaal M A , C reeme rs-Molenaar J , et al.Im-
provement of the tissue culture response of seed-deriv ed
callus culture s of Poa pratensis L.Effect of gelling agent
and abscisic acid[ J] .Plant Cell , tissue and O rgan Cul-
ture , 1991 , 27:275-～ 80.
[ 15] 　马忠华 ,张云芳 , 徐传祥 ,等.早熟禾的组织培养和基因枪
介导的基因转化体系的初步建立[ J] .复旦学报(自然科
学版), 1999 , (10):540～ 544.
[ 16] 　皮伟 ,李名扬 , 郑丽.草地早熟禾组织培养研究[ J] .西南
农业学报 , 2004 , 17:267～ 270.
[ 17] 　信金娜 ,韩烈保 , 刘君 ,等.草地早熟禾愈伤组织诱导及植
株再生[ J] .中国草地 , 2004 , 26:46 ～ 50.
[ 18] 　Chi D H , Peggy G , Lemaux , et al .Stable tr ansfo rmation
o f a recalcitrant Kentuckyblueg rass(Poa p ratensis L.)
cultiva r using ma ture seed-de riv ed highly reg ener ative
tissues[ J] .Vitr o Biology , 2001 , 37(1):6 ～ 17.
[ 19] 　于晓红 ,朱祯 , 付志明 ,等.提高小麦愈伤组织分化频率的
因素[ J] .植物生理学报 , 1999 , 25(4):388～ 394.
[ 20] 　马生健 , 曾富华 ,余炳生 , 等.高羊茅愈伤组织的诱导与内
源激素含量研究[ J] .湛江师范学院学报 , 2002 , 23(6):53
～ 56.
[ 21] 　Bidding N L.Silv er nitr ate increase embryo production in
anther culture o f Brussels sprouts[ J] .Ann Bo t., 1988 ,
62:181.
[ 22] 　Palmer E E.Enhanced shoo t regenera tion f rom Brassica
campestris by silver nitrate[ J] .Plant Cell Rep., 1992 ,
11:541.
[ 23] 　Sophie F , Nicole M , M arc C.The embryogenic response
o f immature embryo cultures o f durum w hea t(T riticum
durum Desf.):histolog y and improvement by AgNO3
[ J] .Plant G rowth Regulation , 1999 , 28:147 ～ 155.
[ 24] 　胡张华 , 陈火庆 ,吴关庭 , 等.高羊茅悬浮细胞系的建立及
绿色植株的高频再生[ J] .草业学报 , 2001 , 16(2):136 ～
138.
Effect of CuSO4 , AgNO3 and ABA on inducing of
embryogenic callus of Kentucky Bluegrass
LUO Li1 , HAN Lie-bao1 ,GAO Cai-xia2 , Klaus K Nielsen2
(1.Bei j ing Forestry Univ ersity , Bei j ing 100083 , China;2.DLF Tri f ol ium , research division ,
S tore Hed dinge 4660 , Denmark)
　　Abstract:The ef fect of CuSO 4 , AgNO 3and ABA on embryogenic callus inducing to 4 varieties of Kentucky
bluegrass(Poa pratensis L.)was investig ated based on explant derived f rom mature seeds.The resul ts show ed
that K3 induction medium supplemented w ith CuSO4 improved the formation of embryogenic callus.DP-LF-300
and 2W42-117 produced white to y ellow , compact and friable embryogenic callus on K3 medium supplemented
wi th 5 mo l/L CuSO 4 .High efficiency of embryogenic callus w as obtained up to 40%in 2W42-117.While addi-
tionally supplemented AgNO 3 and ABA in M S based medium show ed inef fective on embryogenic callus fo rma-
tion.
　　Key words:Kentucky Bluegrass;embryogenic callus;AgNO3 ;ABA;CuSO 4
24 Grassland and Turf　　(Bimonthly)　　2005　　No.4　　(Sum 　No.111)