全 文 ：兰 州大学学报 ( 自然科学版 )
2 1 ( 生物学择 l+ ) ; 88一 92 , 19 8 5
欧当归 L e v i s t i。 u m o f f i。 i n a l e K o e h
愈伤组织诱导及小植株通过
胚状体途径的再生 ,
张 世 瑜
摘 要
由欧 当 归 L · 。 f f i c in al e K o c h 幼 茎及叶柄诱导 出硫松 的普通 愈伤 组织 , 再用不 同组合 的外源植物激
素和有机附加物 处理 , 使之产生致密的颗杜状胚 性愈伤组织 , 并通 过胚 状体途径发育成小 植株 . 在 无激素
培养墓上胚 状体发育正 常 , 在有激素培养基上胚状体有 再生次级胚状体的现 象。
欧当归 ( L e v i s t i e u m o f f i 。 i n a 一e K o c h ( G a r d e n L 。 v a g e ) 原产欧洲 , 在我 国 北 方
一些省区已引种成功 , 其植株高大 , 枝叶茂盛 。 药用部分为根 , 作为补血药已开始被少量试
用 。 欧当归组织培养未见 到有文献报道 。 我们从 1 9 8 2年夏天开始了欧当归组织培 养研 究 工
作 , 本文报道了欧当归愈伤组织诱导及小植株通过胚状体途径发育生成的研究结果 。
材 料 和 方 法
材料取 自兰州医学院药 圃栽种的欧当归幼茎和幼叶 。 将茎段 、 叶片 、 叶 柄 用。 . 1%升汞
灭菌 10 一 12 分 , 无菌水洗 5 次 。 在无菌条件下将茎和叶柄切成 3一 选毫米切 段 , 叶 片 切 成
4 X 4 毫米切块 , 接种在 诱导培养基上 。 两星期后由茎和叶柄产生愈伤组织 , 经扩大转移培
养后 ,再用不 同的外源植物激素处理 , 使这种愈伤组织诱变成能大量产生胚状体的胚性愈伤组
织 , 并由胚状体发育成小植株 。 培养室温度肠℃ , 光照 1 0 o L u x , 10 时 /天 。 基本培 养基 为
M S ( “ 〕 和尺 。 ( 1〕 , 蔗糖 30克 /升 , 琼脂粉 6 克 /升 , p H S . 6一 6 . 0 , 1 5磅 /时 “ 灭菌 2 0分 。
结 果 和 讨 论
1
. 不同的植物激素组合衬愈伤组 织 的诱导和继代培养的影响 欧当归幼茎切段接种在
诱导培养基上 , 3 天后切段明显增大 , 边缘加厚 , 7 天后从加厚的边缘产生一些愈伤组织 ,
本文 1 9 8 5年 8 月 5 日收 J l 。
△郑国 教授指 子 了本试脸并审阅 了本 丈 , 黄 目拉同志 沈印照片 . 扮此盈考
DOI : 10. 13885 /j . i ssn. 0455 -2059. 1985. s1. 015
生 物学辑刊 欧当归愈伤组织诱导及小植株通过胚状途径 的再生 89
. . . . . . . . . . . . . . . . 叮一 . . . . . . . . .州口 . . . . . . . .- 一- 一一 ~.一一一尸一—一 , r 口 . . . . se一- 侧竺 , ~ 、 为 , 巴 江 . 。一`一别 . . . . . . . . . . . . .2 周后愈伤组织逐渐扩大 以致盖住了整个切段 , 形成一种白色 的疏松型愈伤组织 。 诱导 的结果如表一所示 。 表一表明 , 欧当归茎外植体在 2 . 4一 D 、 N A A 及 K T这几种植物激素 的 几种
组合条件下 , 能高频率地产生愈伤组织 。 其中以M s 。和M s ` 的诱导效果最好 , 只需七天 , `几全
部茎外植体都能产生愈伤组织 。 可见在 N A A 和 K T浓度相同的条 件下 , 2 . 4一 D在 2 血` / l或
s m g 1/ 范围内其诱导愈伤组织的效果基本相同 。 而如M S ,和 M S : 所 示 , 当 2 . 4一 D 浓度 为
。 . s m g l/ 时 , N A A 5 m g l/ 其诱导产生愈伤组织的速度比 3 m g / 1为快 。 一 而在 无 激 素 培 养基
上 , 外植体只表现出体积的增大变粗 , 并不产生愈伤组织 。
表一 不同的植物激素组合对愈伤组织诱导的影响
’
r a b l e 1 T h e e f f e e t s o f d i f f e r e n t p h y t o h o r m o n e e o m b i n a t i o n s o n e a l l u s i n d u e t i o n
组 别
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植物激素
9 r o u p 。
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.
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瑟瓜蕊沂蔚汗.箭褚漏一…石藻燕羲…
N A A K T {
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2 7
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愈伤组织的继代培养可在附加有 l m g / 1 2 . 4一 D和 o . Zm g / 1 6 一 B A 的 M S 培 养 基上很好
地进行 。 本试验中观察到 , 酵母浸膏 ( Y E ) 可使愈伤组织增强经受 28 一 30 ℃ 相对高温 的 能
力 。 我们在上述继代用的培养基中增加 10 0 0 m g / 1的 Y E , 则在 28 一 30 ℃条件下愈饰组织仍为
白色 , 生长正常 , 而在不加 Y E的继代培养基上生长的愈伤组织 , 颜色逐渐变褐 , 生长 受 到
抑制 以致死亡 。
2
. 不同外植体 与愈伤组 织产生 的关 系 外植体来源不同 , 产生愈伤组织的 能 力 也 不
同 , 试验结果如表二所示 :
表二
T a b l e Z
不同外植物在 M S : 培养基上产生愈伤组织的频率
T h e f r e q u e n e y o f e a ]
」
l u s
,
i n d u e t i o n f r o rn d i f f e r e n t e x p l a n t s o n t五e
M S . m e d i u m
.
外 植 体
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茎 s te m
叶柄 p e t i o l e
叶 l e a f
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二三生二—由表二可 以看出 , 来 自欧当归幼茎的外植体 , 产生愈伤组织 的频率为 1 0 % ; 由叶 柄 产
生愈伤组织的诱导率为 80 % ; . 而叶片切块不产生愈伤组织 。 这可能是幼茎的维管束较叶柄发
达 , 细胞起动分裂活跃所致 , 而叶片由于叶脉细弱 , 叶肉细胞起动分裂困难 , 因而不产生愈
兰 州 大 学 学 报 1 98 5年 1 2月
伤组织 。
3
. 胚性愈伤组织 诱导 由幼茎切块诱导而得的愈伤组织呈疏松而无定形状态 , 细胞长
而不规则 。 这种愈伤组织在无激素培养基上不能分化产生出小植株 , 我们称之为普通愈伤组
织 (图 1 ) 。 这种普通愈伤组织经过继代培养以后 , 用不同的植物激素及有机附加物处理 ,
可被诱导产生胚性愈伤组织 。 其特点是细胞小而 园形 , 愈伤组织外表呈致密的颗粒状态 (图
2 )
, 并可在无激素培养基上产生大量胚状体苗 。
诱导胚性愈伤组织的基本培养基为M S和 N 。 , 激素组合及结果如表三 。 处理与统计的愈
伤组织数是以小堆数计算 。 从表三可以看出 , 胚性愈伤组织的诱导在第 工 、 3 、 5 号培养基
上效果最好 , 诱导率可达 82 ~ 71 % , 时间约为 30 天 , 在 2 、 4 培养基上 , 诱导率分别为60 % 、
52 %
, 所需时间长达 45 到 5 天 。 而在第 6 号培养基上诱导率为零 。 由上可见 , 适当浓度的 6
一
B A对诱导胚性愈伤组织产生是有利的 。 2 . 4一 D 浓度为 1一 2 m g / 1则不能诱导产生 胚性愈
伤组织 , 降低 2 . 4一 D浓度 ( 。 . 04 m g l/ ) 或取除2 . 4一 D , 也对诱导胚 性 愈 伤 组 织是 必要
的 。
衰三
T a b l e
植物激素和有机附加物对诱导胚性愈伤组织的影响
T h e e f f e e t s o f p h犷 t o h o r 皿 o n e s a n d o r g a n i e a d d i t i o n s o n t h e
e m b r y o g e n i e e a l l u s i n d u e t i o n
培 养 基 ( m g 1/ ) 普通愈伤组织数 胚性愈伤组织数 诱 导 率 ( 肠 ) 天 数
m e d i u m e o m m o n e a l l i e m b r y o g e n i e e a l l i f r e q u e n e y d a y s
M S + 6一 B A I 30 2 5 82 30
M S + K T Z 30 18 60 4 5
M S + N A A O
。
5一 2 30 24 77 30
+ 6一 B人 0 . 4 30 16 52 55
N 6+ K T O
。
2 30 2 1 71 30
N 6+ 2
.
4一 D 0 . 04+ K T O . 4 30 0 0 55
+ C H 8 00 + Y E 1 00 0
M S + 2
。
4一 D l 一 2
4
. 胚状体的 发育及影响 的因素 由胚性愈伤组织产生的胚状体 , 可在适当的试验条件
下进一步发育成为小植株 ( 图 3 一 6 ) 。 在无激素培养基上胚状体能正常发育并可在 45 天左
右产生小植株 , 这个结果与绝大多数报道胚状体发育的结果一致 。 而在本试验中植物激素浓
度影响着胚状体的发育进程 。 在 M S + N A A O . o s m g l/ + BI A O . l m g l/ 的培养基 上 , 胚 状 体
可在 35 天发育成小植株 , 但在胚状体上有产生次级胚状体的现象 (图 3 箭头所指 ) 。 A m m -
i r a ot
,
P
.
V
.
( 1 9 7 4 ) (2 〕在黄篙叶柄的细胞培养中 , 发现有次生胚状体形成 , 并 认为是属
于不正常的胚状体发育情况 , 用 1犷 7一1 -0 ” M的脱落酸 ( A B A ) 可对此加以 抑 制。 但是 ,
不论从生产实践 中的快速繁殖 , 或从细胞全能性的理论研究出发 , 次生胚状体的发生机制和
意义尚有必要进一步研究 。 因为次生胚状体产生的现象在石 龙 茵 ( R . N . K o n a r 等 1 9 6 5 )
( s 〕 、 首楷 ( D o S S a , 、 t o s , A . V . P等 2 9 5 3 ) ( 3〕等植物的组织培养中也有出现 。 另 外 , 如
将胚性愈伤组织转移到附加 2 . 4一 D l 一 2 m g l/ 的培养基上 , 则胚状体不能发育成长为 小 植
生物学辑刊 欧当归愈伤组织诱导及小植株通过胚状途径的再生 9 1
目口 .
株 , 而将这种培养基上生长的胚性愈伤组织再转移到无激素培养基上 , 亦不见小 植 株 的产
生 。 可见细胞增殖过程中的激素环境对以后器官的分化有明显的影响。 这与 H a lP e r in ( 1 97 0)
〔幻 用胡萝 卜叶柄愈伤组织研究胚状体的分化发育所得的结论相同 。
温度对胚状体的进一步发育有较大影响 , 本试验在相对低温 ( 20 ℃ ) 条件下 , 由胚状体
发育为小植株所需的时间较长 ( 50 天 ) , 小植株生长较慢 , 但根粗壮 , 叶片较大 。 而温度较
高 (2 6℃ ) 条件下 , 虽然发育成小植株的时间较短 ( 35 天 ) , 小植株生长较 快 , 但 根 叶 纤
细 。
参
〔 1 〕朱至清 、 王敬驹 、 孙敬三 、 徐振 、
考 资 料
朱之垠 、 尹少初 、 毕风云 1 9 7 5 通过氮源比较试
验建立一种较好的水稻花药培养基 中国科学 、 5 ) : 4 84 一 49 0
. 卜~ 〔 2 〕A m m i r a t o . P 。 V . 1 9 7 4 : T h e e f f e e t s o f a b s e i s i e a e i d o n t h e d e v e l o P -
In e n t
B o t
。
0 f s o m a t i c e m b r y o s f r o m e e l l s o f e a r a w a y ( C
a r “ m e a r y 玄 L . )
G a z
。
1 3 5 , 3 2 8一 3 3 7 .
白 .
〔 3 〕D o s s a n t o s , A . V . P . , E l i : a b e t h G . , a n d M . R . D a v e y , 1 9 8 3 : O r i g i n
a n d d e v e l o p m e n t o f s o m a t i e e m b r y o s i n M e d i e a g o s a t i v a 工 . ( A l f a l f a ) .
P r o t o p l a s m a
, 1 1 7 , 1 0 7一 1 1 5 .
〔 4 〕H a l p e r i n , w . 1 9 7 0 : E m d r y o s f r o m s o m a t i e p l a n t e e l l s . I n C o n t r o l
M e e h a n i s m s o f C e l l u l a r P h e n o t y p e s , ( H
.
A
.
P a d y k u l a
, e d
.
)
.
S y m
.
I n t
.
S o e
.
C e l l B i o l
. v o l
.
9 , p p 、 1 6 9一 1 9 1 . A e a d e m i e P r e s s , N e w Y o r k
a n d L o n d o n
。
〔 5 〕K o n a r , R . N . a n d K . N a t a r a j a , 1 9 6 5 : E x p e r im e n t a l : t云d i e : i n R a 玲 u雌 -
哪不“ 5 s c e不e r a 才u s L . D e v e l o pm e n t o f e m b r y o s f r o m t h e s t e m e p id e r -
m i s
.
P h y t
o m o r p h o l o g y 1 5 : 1 3 2一 1 3 7 . `
〔 6 〕M u r a s h i g e , T . a n d F ` S K o o g , 1 9 6 2 : A r e v i s e d m e d i u m f o r r a p i d
g r o w t h a n d b i o a s s a y s w i t h t o b a e e o t i s s u e e u l t u r e
.
P h y s i o l
.
P l a n t
. ,
1 5 : 4 7 3一 4 9 7 。
(下转 8 1 页 )
口.
仑2 遗 州 大 学 学 报 1 9 85年12 月
图版 说明
图 1
图 2
图 3
蔬松 的普通愈伤组织
颗粒状胚性愈伤组 织
子叶期胚状体 , 箭头指次生胚 状体
图 4 、 5 、 6 不同发育阶段的 小植株
E x P l a n a t i o n o f P l a t e
F 19
.
1 L o o s e e o m m o n e a l l u s F i g
.
2 G r a n u l a r e m b r y o g e r l i e e a l l u s
F 19
.
3 C o t y l e d o n a r y s t a g e e m b r y o i d s
, a r r o w s p o i n t t o s e e o n d a r y e m b r y -
o i d :
F 19
,
4
,
5
,
6 P 1a n t l e t s a t d i f f o r e n t s t a g e s o f d e v e l o pm e n t
生物学辑刊 六月雪蛋白水解酶的研究 8 1
S t u d y o n P r o t e o l y t i c E n z y m e o f E u p h o r b i a
M a r g i n a l a P u r s h
开 . T h e In h i b f t i o n E f f e e t O n B a e t e r i a a n d C a n e e r
L u Y云u g九u a W u Y in w e n E h o u G u a派 h u a
C a刀
T h e P r o t e o l y t i e e n z y m e i s o l a t e d f r o m t h e l a t e x o f E u p h o r b i a M a r g i n a l a
in h ib i t t h e g r o w t h o f b a e t e r i a
, 百s p e e i l l y G r a m s P o s i t i v e b a e t e r i a . T h i s
e n Z y m e
t u m o r
。
e a r l a l s o i n h i b i t t h e r a t 士u m 0 r e e 11 5一 1 8 0 a n d E h r l i e h a s e i t e s
. 门
(上接 9 2 页 )
I n V i t r o C a l l u s In d u e t i o
、
n A n d P l a n t l e t R e g e n e r a t i o n
O f L e v i
s t i e u m O f f i e i n a l e K o e h T h r o u g h E m b r y o i d P a t h w a y
Z 孔a n g S h i y “
A b s t r a e t
T 卜e e a l l u s d e r i v e d f r o m y o u n g s t e m s a n d p e t i o l e o f L . o f了玄e亡件 a 乙e
. .
w e r e t r o a t e d w 注t h e x o g e n o u s P h y t o h o r m o n e s a n d o r g a n i e
e e g r a n u l a r e m b r y o g e n i e e a l l u s
.
T h e p l a n t l e t s d e v e l o P e d
a d d i t i o n s
t h r o u g h
·
t 0
K O C孔
i n d u 一
T a t h w a y
.
T h e e m b r y o i d s o n t h e m e d i u m w i t h o u t P h y t o h o r m o n e
e m b r y o i d
d e v e l o p e d
n o r m a l l y
,
。 s e e o n d a r y
O n t h e rn e d i u m w i t h p h y t o h o r m o n e s t h e e m b r y o i d s m a y p r o d u e
e m b r y o i d
.
A b b r a v i a t i o n s
2 , 4 一 D Z , 4 一 d i e h l o r o p h e n o x y a e e t i c a e i d ,
k i n e t i n
,
I B A i n d 。 一e b u笼y r i c a 。 i d , ’ C H
a l e n e a e e t i e a c i d
,
Y E y e a s t e x t r a e t
.
C a s e l n
6 一 B A 6 一 b e n z y l a d e n i n e , K T
h y d r o l y s a t e
,
N A A a 一 n a Ph t n -
日卜
矛