全 文 ：藏药材大花绿绒蒿内生真菌多样性研究
＊
普布多吉　徐爱国　蒋思萍　陈彬＊＊
（西藏自治区高原生物研究所，西藏　拉萨　８５０００１）
摘　要：大花绿绒蒿为藏药常用药材。本课题研究了大花绿绒蒿活株内生真菌多样性。实验采用ＰＤＡ
培养基分离培养了大花绿绒蒿活株的内生真菌菌株，采用ＩＴＳ－ｒＲＮＡ基因片段测序比对法鉴定了内
生真菌菌株的种属，并采用Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ指数（Ｈ）和均匀度指数（Ｅ），分析了大花绿绒蒿内生真菌
的多样性。结果表明：从大花绿绒蒿活株中分离得到２６株内生真菌，经鉴定为１８属，其中根部为内生
真菌的主要分布部位，毛霉属（Ｍｕｃｏｒｓｐ．）和新丛壳孢属（Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａｓｐ．）是植株根部的优势菌群；Ｈ和
Ｅ指数分别为２．７１５和０．９３９，表明了ＰＤＡ培养基可以较好的分离得到大花绿绒蒿活株的内生真菌。
实验结果能较全面的反映大花绿绒蒿活株内的内生真菌多样性及分布情况。
关键词：藏药材　大花绿绒蒿　内生真菌　多样性
　　大花绿绒蒿（Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｇｒａｎｄｉｓ　Ｐｒａｉｎ）是罂粟科
绿绒蒿属植物。绿绒蒿属植物适宜的生长环境为高海
拔地区，全属４９种，除１种分布于西欧外，其余均分布
于东亚的喜马拉雅地区和横断山脉［１］。大花绿绒蒿生
长在海拔高度为３０００－５５００ｍ的高寒地带，是西藏特
有植物，素有高原美人之称。大花绿绒蒿是重要藏药
毛瓣绿绒蒿的代用药，全草入药，具有清热解毒、利尿、
消炎、止痛、镇咳功效，用于肺炎、肝炎、咳喘等疾病的
治疗。因人工种植不易，大花绿绒蒿作为毛瓣绿绒蒿
代用药成为了濒危植物［２，３］。
为了研究内生真菌在濒危植物保护中的生态学意
义，探讨内生真菌次级代谢产物对濒危藏药的保护及
对濒危藏药次级代谢生物合成的互惠关系，课题组前
期对多种濒危藏药进行了内生真菌的系统分离研究，
从原生态大花绿绒蒿活株中分离得到了２６株内生
真菌。
１　实验部分
１．１　实验材料、试剂、仪器和设备
１．１．１　实验材料。大花绿绒蒿株于２０１３年７月采自
西藏自治区日喀则市错那县县，连土带根挖起放入洁
净的花盆中带回实验室，次日进行活植株内生真菌分
离；该植物经西藏自治区高原生物研究所李晖研究员
鉴定为大花绿绒蒿（Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｇｒａｎｄｉｓ　Ｐｒａｉｎ）。
１．１．２　试剂与仪器。试剂：ＰＤＡ培养基（北京陆桥），
氨苄青霉素（百灵威），Ｔｒｉｓ碱（北京陆桥），醋酸钠（天
津化学试剂厂），冰醋酸（天津化学试剂厂），无水乙醇
（天津化学试剂厂），氯仿（天津化学试剂厂），异戊醇
（天津化学试剂厂），ＥＤＴＡ（北京陆桥），ＣＴＡＢ（北京
陆桥），ｒＴａｑ酶（大连宝生物），ＥＢ染色剂（大连宝生
物），ｄＮＴＰ（大连宝生物），λＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ（５０
次），ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（５０次），Ｔｉａｎｇｅｎ。琼脂糖
（西班牙Ｂｉｏｗｅｓｔ），超纯水（自制）。
仪器设备：超净工作台（苏州苏洁净化），灭菌锅
（上海申安），恒温恒湿培养箱（上海柯林），高速离心机
（ｓｉｇｍａ），ＰＣＲ仪（德国），ＤＮＡ 凝胶电泳仪（北京六
一），凝胶成像系统（北京六一），移液器；ＥＰ管，移液
枪头，一次性平皿。
１．２　实验方法
１．２．１　大花绿绒蒿内生真菌的分离纯化。分离真菌
的培养基：改良ＰＤＡ培养基。配制方法：将２００ｇ的削
皮后的马铃薯切成小块，放到电饭锅中加入１Ｌ去离
子水煮开计时３０分钟，纱布过滤，加入１５ｇ葡萄糖和
３ｇ氯化钠，２０ｇ琼脂，定容至１０００ｍＬ，１２１摄氏度高温
灭菌 ３０ 分钟，取出冷去至 ５０℃，加入 １ｍＬ 含有
１００ｍｇ的超纯水溶解的氨苄青霉素，摇匀，倒平板，冷
却，备用。
内生菌分离和纯化［４］：将鲜活植株预先冲洗干净，
并用滤纸将表面的水吸干。在无菌操作条件下，使用
０．２％的升汞溶液进行表面消毒，将植株分成根茎叶花
果等几个部分，分别切成碎组织块或匀浆稀释，再将组
５６
《西藏科技》２０１６年６期（总第２７９期）　　　　　　　　　　　　　　　　　　动植物研究
＊
＊＊
西藏自治区科学基金项目（２０１５ＺＲ－１３－５２）
通讯作者
织块扦插或涂布到分离培养基中，封口膜封口，放置在
２５℃恒温培养箱中培养，３天后开始观察菌落生长情
况，并及时转接菌落到纯化培养基上，经纯化后的菌株
转接到冻存管中，待大多数长出孢子是，放入４℃冰箱
保藏。
１．２．２　大花绿绒蒿内生真菌的分子生物学鉴定。
ＤＮＡ的提取：采用ＣＴＡＢ法［５］。将得到的内生菌菌
株分别用１００ｍＬ马铃薯葡萄糖液体培养基培养３～５
天，取新鲜菌丝１００ｍｇ，按ＣＴＡＢ法提取ＤＮＡ。
ＤＮＡ的扩增引物［６］：：真菌ＩＴＳ－ｒＲＮＡ基因引
物ＩＴＳ１Ｆ：５‘－ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ
－３’和ＩＴＳ４：５’－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－
３’（两对引物均为由广州英骏（英潍捷基）生物技术有
限公司合成）。
用ＩＴＳ－ｒＲＮＡ基因引物对对提取的真菌基因组
进行ＰＣＲ扩增，经琼脂糖凝胶电泳，选取特异性良好
的ＰＣＲ产物进行测序（华大基因）。
ＰＣＲ反应体系为：１０×Ｂｕｆｆｅｒ，５μＬ；ｄＮＴＰ，１μＬ；
ｒＴａｑ酶，０．２５？Ｌ；ＩＴＳ上下游引物，各０．５μＬ；ＤＮＡ
模板，２．０μＬ；最后加超纯水至５０μＬ。
反应程序为：Ｓｔｅｐ１，９４℃，５ｍｉｎ；Ｓｔｅｐ２，９４℃，５０ｓ；
Ｓｔｅｐ３，５２℃，５０ｓ；Ｓｔｅｐ４，７２℃，６０ｓ；循 环 Ｓｔｅｐ２ 到
Ｓｔｅｐ４，做３０个循环；Ｓｔｅｐ５，７２℃，１０ｍｉｎ；Ｓｔｅｐ６，反应
终止，取出样品。
得到测序结果后，在 ＮＣＢＩ网站上使用在线搜索
比对软件进行序列相似性比对，找出与目标序列最相
似的序列的所在种属，进一步确定菌株的种属。
１．２．３　大花绿绒蒿内生真菌的多样性分析。定义
ＩＴＳ－ｒＤＮＡ序列同源性大于９７％作为同一分类单
元［７］，采用Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ指数（Ｈ），均匀度指数
（Ｅ），计算多样性［８］。
Ｈ＝Σ
ｓ
ｉ＝１
ＰｉＩｎＰｉ （１）
Ｅ＝Ｈ／ＩｎＳ （２）
式中Ｓ为分类单元，Ｐｉ是第ｉ种的多度比例，可以
用Ｐｉ＝ｎｉ／Ｎ求出。ｎｉ是第ｉ个分类单元的菌株数，Ｎ
＝∑ｎｉ，Ｎ是所以菌株数总和。
２　实验结果与分析
２．１　大花绿绒蒿内生真菌的分离与鉴定
从大花绿绒蒿的根茎叶三个部位共分离得到２６
株内生真菌，经分子生物学鉴定到属１８属。其中根部
１３属１８株，茎部３属３株，叶部４属５株（见表１）。
　　表１ 大花绿绒蒿内生真菌分布于鉴定结果
序号 菌属名称
分离部位及数量／株
根部／株 茎部／株 叶部／株
１ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｐ． ０　 ０　 １
２ Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍｓｐ． ０　 １　 ０
３ Ｂｅａｕｖｅｒｉａｓｐ． ２　 ０　 ０
４ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｓｐ． １　 ０　 ０
５ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ． １　 ０　 ０
６ Ｇｅｏｍｙｃｅｓｓｐ． １　 ０　 ０
７ Ｇｉｂｂｅｒｅｌａｓｐ． １　 ０　 ０
８ Ｈｙｐｏｃｒｅａｓｐ． ０　 ０　 １
９ Ｌｅｐｔｏｄｏｎｔｉｄｉｕｍｓｐ． １　 ０　 ０
１０ Ｍｕｃｏｒｓｐ． ３　 ０　 ２
１１ Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａｓｐ． ３　 ０　 ０
１２ Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ．ｓｐ　 ０　 １　 ０
１３ Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓｓｐ． １　 ０　 ０
１４ Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ． １　 ０　 ０
１５ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓｓｐ． ０　 １　 ０
１６ Ｐｌｅｎｏｄｏｍｕｓｓｐ． １　 ０　 ０
１７ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐ． １　 ０　 １
１８ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｆｕｎｇｕｓ　 １　 ０　 ０
２．２　大花绿绒蒿内生真菌的植株内分布情况分析
分析大花绿绒蒿植株中内生真菌分布情况（见图
１），可知，根部分离得到的内生真菌最多，多样性最丰
富，茎部和叶部内生真菌的多样性显著减少。究其原
因，可能是大花绿绒蒿的根部粗大，并且形成了菌根，
根部髓中有褐花部分，这些地方是内生真菌多样性丰
富的地方；而茎中空壁薄，叶片也很薄，难于聚集共生
更多种类的真菌。
６６
动植物研究　　　　　　　　　　　　　　　　　　《西藏科技》２０１６年６期（总第２７９期）
图１　大花绿绒蒿活株不同部位内生
真菌的种属分布情况
分析１８属内生真菌在大花绿绒蒿活株中的分布
情况（见图２），发现毛霉属（Ｍｕｃｏｒｓｐ．）和新丛壳孢属
（Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａｓｐ．）是大花绿绒蒿活株中的优势菌属。
毛霉属是常见的土壤真菌，由于侵染大花绿绒蒿的根
部，因此形成大花绿绒蒿的共生菌；新丛壳孢菌属是可
以分布抗肿瘤、抗菌活性物质一种真菌［９－１０］，在与大
花绿绒蒿活株的共同生长和进化中，可以增强宿主的
抗病能力，从而增强了野生植株的抗逆性和生存能力。
图２　大花绿绒蒿活株不同种属内生真菌的分布情况
２．３　大花绿绒蒿内生真菌多样性的分析
采用Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ指数（Ｈ）和均匀度指数
（Ｅ）分析了大花绿绒蒿内生真菌的多样性（见表２）。
显然 Ｈ和Ｅ指数数值都比较大，说明了，我们采用的
分离方法可以很好的分离出大花绿绒蒿活株的内生真
菌，能较全面的反映大花绿绒蒿活株内的内生真菌多
样性及分布情况。
表２ 大花绿绒蒿内生真菌多样性分析
序号 宿主 种属数量Ｓ　 Ｈ　 Ｅ
１ 大花绿绒蒿 １８　 ２．７１５　 ０．９３９
３　讨论
大花绿绒蒿是一种常用藏药，研究其活株内生真
菌多样性和分布情况，既可以寻找有益的共生真菌，为
它的人工栽培做有益尝试；又可以寻找具有生产药效
成分的药物先导化合物的菌株，开发利用内生菌资源。
本研究中的大花绿绒蒿已列入西藏濒危的藏药材名
录，植株在野外已经很难寻找。植物内生真菌的多样
性与植株的种属性和生长环境有密切关联，因此，如果
进一步研究清楚大花绿绒蒿内生真菌的多样性和特
点，需要扩大大花绿绒蒿植株的采集范围。这样对大
花绿绒蒿的人工栽培更能提供全面的有益的信息。
致谢：该项目得到西藏自治区自然科学基金项目
资助（基金号：２０１５ＺＲ－１３－５２）的，在此表示感谢；大
花绿绒蒿活株的鉴定工作是由西藏自治区高原生物研
究所李晖研究员完成的，在此表示衷心的感谢。
参考文献
〔１〕　杜军华，张文静，李继荣，李颖．青藏高原特色植
物资源绿绒蒿属植物的开发和利用［Ｊ］．青海师范大学
学报（自然科学版），２０１１，４：５２－５７．
〔２〕　中国科学院青藏高原综合科学考察队．西藏植物
志［Ｓ］．第二卷上册，北京：科学出版社，１９８５：ｐｐ２３０．
〔３〕　倪志诚．西藏经济植物［Ｓ］．北京：北京科学技术
出版社，１９９０：ｐｐ２３４．
〔４〕　王利娟，贺新生．植物内生真菌的分离培养的研
究方法［Ｊ］．微生物学杂，２００６，２６（４）：５５－６０．
〔５〕　Ｓｔｅｗａｒｔ　ＣＮ　Ｊｒ，Ｖｉａ　ＬＥ．Ａ　ｒａｐｉｄ　ＣＴＡＢ　ＤＮＡ　ｉ－
ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　ＲＡＰＤｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ　ａｎｄ
ｏｔｈｅｒ　ＰＣＲ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９３，１４，
７４８–７４９．
〔６〕　Ｇａｒｄｅｓ　Ｍ，Ｂｒｕｎｓ　ＴＤ．ＩＴＳ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ｅｎ－
ｈａｎｃｅｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｆｏｒ　ｂａｃｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ－ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ
ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｅ　ａｎｄ　ｒｕｓｔｓ［Ｊ］．Ｍｏ－
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，１９９３，２（２）：１１３－１１８．
〔７〕　ＭｃＣａｉｇ　ＡＥ，Ｇｌｏｖｅｒ　ＬＡ，Ｐｒｏｓｓｅｒ　ＪＩ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｄｉｖｅｒｓｉ－
ｔｙ　ｉｎ　ｕｎｉｍｐｒｏｖｅｄ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｕｐｌａｎｄ　ｇｒａｓｓ　ｐａｓｔｕｒｅｓ
［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｙ，１９９９，６５
（４）：１７２１－１７３０．
〔８〕　陈梦．对生态系统及生物多样性等理论问题的
探讨［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学版），２００３，２７
（５）：３０？３４．
〔９〕　Ｈｅ　ＨＹ，ＹａｎｇＨＹ，Ｒａｍｕｎａｓ　Ｂ，Ｅｒｉｃ　ＨＳ，Ｍｉ－
ｃｈａｅｌ　Ｇ，Ｇｕｙ　ＴＣ．Ｐｙｒｒｏｃｉｄｉｎｅｓ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ，ｎｅｗ　ａｎｔｉｂｉ－
ｏｔｉｃｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　ｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．Ｔｅｔｒａｈｅｄ－
ｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００２，４３：１６３３－１６３６．
〔１０〕　Ｓｈｉｏｎｏ　Ｙ，Ｓｈｉｍａｎｕｋｉ　Ｋ，Ｈｉｒａｍａｔｓｕ　Ｆ，Ｋｏｓｅ－
ｋｉ　Ｔ，Ｔｅｔｓｕｙａ　Ｍ，Ｆｕｊｉｓａｗａ　Ｎ，Ｋｉｍｕｒａ　Ｋ．Ｐｙｒｒｏｓｐｉ－
ｒｏｎｅｓ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｒｓ　ｉｎ　ＨＬ－６０ｃｅｌｓ，
ｆｒｏｍ　ａｎ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｕｓ，Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａｒａｍｕｌａｒｉａｅ－
Ｗｏｌｅｎｗ　ＫＳ－２４６［Ｊ］．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００８，１８（２３）：６０５０－６０５３．
编校　土登达杰
７６
《西藏科技》２０１６年６期（总第２７９期）　　　　　　　　　　　　　　　　　　动植物研究