全 文 ：第 55 卷 第 2 期
2016 年 3 月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA SCIENTIAＲUM NATUＲALIUM UNIVEＲSITATIS SUNYATSENI
Vol. 55 No. 2
Mar. 2016
DOI:10. 13471 / j. cnki. acta. snus. 2016. 02. 015
大花绿绒蒿内生真菌 Neurospora sp. DHLＲH-F
次级代谢产物研究
*
黄梅香1，胡谷平2，陈 彬3，徐爱国3，普布多吉3，蒋思萍3，王 军1
(1． 中山大学药学院，广东 广州 510006;
2． 中山大学化学与化学工程学院，广东 广州 510275;
3． 西藏自治区高原生物研究所，西藏 拉萨 850001)
摘 要:为了研究藏药大花绿绒蒿内生真菌 Neurospora sp． DHLＲH － F 的次级代谢产物，采用硅胶、C － 18 反
相硅胶、Sephadex LH － 20 等柱色谱及 HPLC技术对其发酵物进行了系统分离;采用波谱分析技术进行化合物结
构鉴定;采用光度法研究所得化合物对 Fe2 +，Fe3 +的络合能力。结果从大花绿绒蒿内生真菌 Neurospora sp． DHL-
ＲH － F的发酵物中分离得到 3 个多羟基化合物，分别鉴定为 2 －氯 － 6 －甲氧基间苯二酚 (1)、6 － epi － 5 － hy-
droxy － mycosporulone (2)、霉酚酸 (3)。本文是首次关于绿绒蒿属植物内生真菌次级代谢产物研究的报道;分
离得到的化合物 1 是新天然产物，有一定的络合 Fe3 +能力。
关键词:大花绿绒蒿;内生真菌;次级代谢;铁离子 (Ⅱ，Ⅲ)络合物
中图分类号:O629. 9 文献标志码:A 文章编号:0529 － 6579 (2016)02 － 0081 － 04
Secondary metabolites of endophytic fungus Neurospora sp．
DHLＲH-F from Meconopsis grandis Prain
HUANG Meixiang1，HU Guping2，CHEN Bin3，XU Aiguo3，PUBU Duoji3，JIANG Siping3，WANG Jun1
(1． School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China;
2． School of Chemistry and Chemical Engineering，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China;
3． Tibet Platesu Institute of Biology，Lhasa 850001，China)
Abstract:To study the secondary metabolites of endophytic fungus Neurospora sp． DHLＲH － F from
Meconopsis grandis Prain from Tibet，its fermentation products were isolated and purified by silica gel，
Sephadex LH －20，ODS －18 column chromatography，and HPLC． The structures of obtained compounds
were identified by NMＲ and MS analysis，and the absorption spectrums of the compounds-iron (Ⅱ)or i-
ron (Ⅲ)were investigated by UV /Vis spectroscopy，respectively． The results showed that three polyphe-
nols were isolated from the fermentation compounds of Neurospora sp． DHLＲH － F． Their structures were
identified as 2 － chloro － 6 － methoxybenzene － 1，4 － diol (1)，6 － epi － 5 － hydroxy-mycosporulone
(2) ，and mycophenolic acid (3) ;compound 1 was a new natural product and showed a certain complex-
ation ability for iron (Ⅲ)． We firstly reported about secondary metabolites of endophytic fungus from
Meconopsis Vig． ．
Key words:Meconopsis grandis Prain;endophytic fungus;secondary metabolites;complex iron (Ⅱ，Ⅲ)
* 收稿日期:2015 － 06 － 03
基金项目:西藏自治区科技计划重点资助项目 (毛瓣绿绒蒿等濒危藏药材内生菌次级代谢及其与宿主互惠共存关系
研究 (2011)) ;国家自然科学基金地方科学基金资助项目 (21262033)
作者简介:黄梅香 (1990 年生)，女;研究方向:天然产物化学;通讯作者:蒋思萍，王军;E-mail:tpibjiangsp@
126. com，wjun@ mail. sysu. edu. cn
中山大学学报 (自然科学版) 第 55 卷
大花绿绒蒿 Meconopsis grandis Prain 是罂粟科
绿绒蒿属植物。绿绒蒿属植物适宜的生长环境为高
海拔地区，全属 49 种，除 1 种分布于西欧外，其
余均分布于东亚的喜马拉雅地区和横断山脉［1］。
大花绿绒蒿生长在海拔高度为 3 000 ～ 5 500 m的高
寒地带，是西藏特有植物，素有高原美人之称。大
花绿绒蒿也是重要藏药毛瓣绿绒蒿的代用药，全草
入药，具有清热解毒、利尿、消炎、止痛、镇咳等
功效，用于肺炎、肝炎、咳喘等疾病的治疗。因人
工种植不易，大花绿绒蒿作为毛瓣绿绒蒿的代用药
成为了濒危植物［2 － 3］。为了研究内生真菌在濒危植
物保护中的生态学意义，探讨内生真菌次级代谢产
物对濒危藏药的保护及对濒危藏药次级代谢生物合
成的互惠关系，课题组前期对多种濒危藏药进行了
内生真菌的系统分离研究，从原生态大花绿绒蒿植
株中分离得到了 40 株内生真菌。在此基础上，本
文对具有较好抗菌活性的大花绿绒蒿内生真菌
Neurospora sp． DHLＲH-F的次级代谢产物进行了系
统研究，分离鉴定了 3 个化合物 (图 1)，分别是
2-氯-6-甲氧基间苯二酚 (1)、6-epi-5-hydroxy-my-
cosporulone (2)、霉酚酸 (3)。文献检索证实化合
物 1 是一个新天然产物，进一步研究还发现 1 有较
强的铁离子络合能力。大花绿绒蒿的次级代谢产物
从未被文献报道过，本文是首次关于绿绒蒿属植物
内生真菌次级代谢产物研究的报道。
图 1 化合物 1，2，3 结构
Fig. 1 The chemical structures of compounds 1，2，3
1 仪器与材料
UV-2501 PC 紫外可见分光光度计 (Shzmad-
zu)，Bruker AVANCE 400 型核磁共振谱仪 (Bruk-
er Biospin，Ｒheinstetten，German) ，LCQ-DECA-XP
型液相色谱 －质联用仪 (Thermo)，Essentia SPD －
16 型高效液相色谱仪 (HPLC) (Shzmadzu)。TLC
硅胶 (GF254)、柱层析硅胶 (200 ～ 300 m)均为青
岛海洋化工有限公司产品，Sephadex LH － 20 凝胶
为美国 GE Healthcare 产品，C － 18 反相硅胶 ODS
－ A为日本 Daiso公司产品;色谱纯甲醇为Merck产
品，其他试剂均为分析纯，为广州化学试剂厂产品。
大花绿绒蒿样本于 2010 年 7 月 21 日采自西藏
自治区山南地区错那县那朗村东边山坡上 (E:91°
5608. 52″，N:28°0205. 06″，海拔 4 574 m)。将
大花绿绒蒿活株连土带根挖起放入洁净的花盆中，
3 d内带回实验室，次日进行植株内生真菌分离。
该样本经西藏自治区高原生物研究所李晖研究员鉴
定为大花绿绒蒿 (Meconopsis grandis Prain)。
2 方法与结果
2. 1 内生真菌分离
采用 φ = 0. 2%升汞进行植物表面消毒，培养
基为 PDA 培养基［4］;共分离得到内生真菌 40 株，
其中编号为 DHLＲH － F 的菌株经分子生物学鉴定
为脉胞菌属 Neurospora sp. ，命名为 Neurospora
sp. DHLＲH － F，GenBank 登录号为 KＲ492687;该
菌种保存于西藏自治区高原生物研究所。
2. 2 发酵与提取
将菌种种子接种到盛有大米培养基的 1 L三角
瓶中，共接种 50 瓶［5］，常温发酵培养 28 d。发酵
物采用甲醇 － 氯仿 － 乙酸乙酯混合溶液 (V (甲
醇) /V (氯仿) /V (乙酸乙酯) = 1 /1 /1)提取
浸泡，300 mL /瓶，过滤，回收有机溶剂，剩余的
水用乙酸乙酯等体积萃取 3 次，浓缩乙酸乙酯萃取
液，得浸膏 60 g。
2. 3 分离纯化
将提取物浸膏悬浮于 1. 5 L 水中，分别用石油
醚，乙酸乙酯，正丁醇等体积萃取 2 次，分别减压
蒸干有机溶剂，得石油醚部位浸膏 20 g，乙酸乙酯
部位浸膏 15 g，正丁醇部位浸膏 5 g。乙酸乙酯部
位浸膏经 C18 反相硅胶柱纯化，水 －甲醇溶液梯
度洗脱，收集水 －甲醇 (V (水) /V (甲醇) =
90 /10)洗脱液得馏分 Fr － 1，水 －甲醇 (V (水) /
V (甲醇) = 40 /60)洗脱液得馏分 Fr － 2。Fr － 1
经 LH －20 凝胶柱纯化，甲醇洗脱，再经 HPLC 分
离，水 －甲醇 (V (水) /V (甲醇) = 40 /60)溶
液洗脱，得到化合物 1 (60 mg)。Fr － 2 经硅胶柱
分离，石油醚 －乙酸乙酯 (V (石油醚) /V (乙酸
乙酯) = 100 /0 ～ 0 /100)溶液洗脱，得到 2 个馏分
Sr － 1，Sr － 2;Sr － 1 经 Sephadex LH －20 凝胶柱多
次纯化，甲醇洗脱，得到化合物 3 (400 mg);Sr
－ 2 经 HPLC 分离，水 － 甲醇 (V (水) /V (甲
醇) = 50 /50)溶液洗脱，得到化合物 2 (59 mg)。
2. 4 Fe2 +，Fe3 +络合实验
分别精密称取化合物 1、2、3、FeCl2 及 FeCl3
28
第 2 期 黄梅香等:大花绿绒蒿内生真菌 Neurospora sp. DHLＲH-F次级代谢产物研究
溶于甲醇中，配成浓度为 10 mmol /L 的溶液。测量
时将各化合物溶液与铁离子溶液按比例混合，置于 1
cm的石英比色皿中，在 190 ～500 nm波长范围进行吸
光度扫描，记录光谱数据;计算时扣除试剂空白。
化合物 1 与 Fe3 +络合实验方法参考文献 ［8］。
3 化合物波谱数据
化合物 1:浅棕红色固体，易溶于甲醇，丙
酮，氯仿;ESI － MS m/z:173［M － H］－(100)，175
［M － H］－(30);分子式为 C7H7ClO3。
1H NMＲ(400
MHz，C2D6CO)δ:6. 73(d，1H，2. 8 Hz，H － 3)，6. 78
(d，1H，2. 8 Hz，H － 5) ，4. 70(s，3H，H － 7) ;13C
NMＲ(100 MHz，C2D6CO)δ:131. 0(s，C －1)，120. 9
(s，C －2) ，115. 0(d，C － 3) ，151. 2(s，C － 4) ，114. 0
(d，C －5) ，144. 3(s，C －6) ，61. 6(CH3 － 6)。
化合物 2:白色固体，易溶于丙酮，甲醇;ESI
－ MS m/z:223． 1 ［M － H］－1;分子式 C11 H12 O5;
1H NMＲ (400 MHz，C2D6CO)δ:4． 35 (m，1H，H
－2)，6． 05 (dd，1H，10． 4，3． 2 Hz，H － 4) ，
6． 66 (dd，1H，10． 4，2． 4 Hz，H － 5) ，3． 41 (m，
1H，H －6) ，5． 40 (m，1H，H －5) ，4． 76 (t，1H，
2． 4 Hz，H － 6α) ，4． 66 (t，1H，2． 4 Hz，H － 6
β) ，1． 21 (d，3H，7． 2 Hz，CH3 － 6)，5． 81 (br，
OH －9) ;13C NMＲ (100 MHz，C2D6CO)δ:61． 1
(s，C － 1)，73． 1 (d，C － 2) ，197． 3 (s，C － 3) ，
126 (d，C － 4) ，152． 2 (d，C － 5) ，34． 1(d，C －
6) ，172． 5 (s，C － 2) ，159． 9 (s，C － 4) ，69． 5
(d，C －5) ，87． 8 (t，6) ，16． 7 (CH3 － 6)。化合
物 2 的立体构型由 NOE 谱推导。2 的所有波谱数
据与文献 ［6］报道的 6 － epi － 5 － hydroxy － myco-
sporulone吻合。
化合物 3:白色固体，易溶于氯仿;ESI － MS
m/ z:319. 3［M － H］－;分子式为 C17H20O6;
1H NMＲ
(400 MHz，CDCl3)δ:5. 15(s，2H，H － 3)，3. 35(d，
2H，6. 8 Hz，1) ，5. 22(t，1H，6. 0 Hz，H － 2) ，2. 27
(t，2H，7. 6 Hz，H － 4) ，2. 40(t，2H，7. 6 Hz，H －
5) ，2. 11(s，3H，CH3 － 4)，1. 77(s，3H，CH3 － 3)，
3. 73(s，3H，CH3O);
13C － NMＲ(100 MHz，CDCl3)
δ:173. 1(s，C － 1)，70. 1(t，C － 3) ，116. 8(s，C －
4) ，144. 2(s，C － 3a) ，163. 7(s，C － 5) ，122. 0(s，C
－6) ，153. 6(s，C －7) ，106. 4(s，C － 7a) ，22. 6(t，C
－1) ，123. 0(d，C －2) ，134. 0(s，C －3) ，34. 3(t，C
－4) ，32. 8(t，C － 5) ，179. 3(s，C － 6) ，11. 5(q，
CH3 － 4)，16. 2(q，CH3 － 3)，61. 1(q，CH3O)。以
上数据与文献 ［7］报道的霉酚酸吻合。
4 结果与讨论
4. 1 化合物 1 结构确定
化合物 1 的 ESI － MS 谱给出准分子离子峰 m/
z:173 ［M － H］－ (100)，同位素峰 m/z:175 ［M
+2］－ (30)，表明分子中有氯元素存在;结合
NMＲ数据，确定分子式为 C7H7ClO3，不饱和度为
4。13C NMＲ谱给出 7 个碳信号，其中 6 个为 sp2 碳
信号，1 个为氧取代的 sp3 碳信号;1H NMＲ 谱在 δ
为 6. 78、6. 73 的 AB 耦合信号，耦合常数 J = 2. 8
Hz，证实芳环上有 2 个间位质子;δ 为 4. 71 的单
峰信号证实了连氧甲基的存在;化合物 1 的 HMBC
谱给出 H －3 和 C － 2 的相关信号，确定氯原子为
C － 2 位取代;H － 5 和 C － 6 的 HMBC 相关信号，
以及 H －7 和 H －5 的 NOE相关信号，确定了甲氧
基为 C －6 位取代 (图 2)。综上所述，化合物 1 的
结构确定为 2 －氯 － 6 －甲氧基间苯二酚。文献检
索证实，该化合物为新天然产物。
图 2 化合物 1 主要 HMBC和 NOE信号
Fig. 2 The key HMBC and NOE correlations of compound 1
4. 2 Fe2 +、Fe3 +络合能力
植物在生长过程需要微量元素做养料，Fe3 +因
水溶性差，较难被植物吸收利用。共生微生物分泌
的铁载体可以通过螯合土壤中 Fe3 +并将其传递到
植物体内，提高植物对营养物质的吸收，从而增加
植物在极端环境的生长能力［9 － 10］。为了研究内生
真菌 Neurospora sp. DHLＲH － F 的生态学意义，本
文初步研究了化合物 1，2，3 对 Fe2 +、Fe3 +的络
合能力。实验结果给出化合物 1 有较强的络合
Fe3 +能力，未观察到化合物 2，3 络合 Fe3 + 的现
象;未观察到化合物 1，2，3 络合 Fe2 +现象。
化合物 1 可形成 Fe3 +络合物的结论，被固定
配基浓度 (图 3 (a))及固定 Fe3 + 浓度 (图 3
(b))这两种 2 种络合方式证实，化合物 1 － Fe3 +
体系紫外吸收曲线在 λ = 250 ～ 275 nm 范围内出
现新的吸收峰;在固定配基浓度的络合方式中，可
观察到等吸收点的形成。根据图 3 (b)中 λ = 264
nm处的吸光度值，初步推断，当配基浓度较低时，
38
中山大学学报 (自然科学版) 第 55 卷
图 3 化合物 1 － Fe3 +紫外吸收光谱
Fig. 3 The UV － absorbance of compound 1 － Fe3 +
化合物 1 － Fe3 +络离子的络合比为 2∶ 1［8］。
来自大花绿绒蒿的内生真菌 Neurospora sp．
DHLＲH-F能产生较大量的 Fe3 +离子络合剂，其生
态学意义有待进一步深入研究。
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