全 文 ：　第 42 卷 2006年第 1期 　　　　　西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版)
　Vo l. 42　2006　No. 1 　　　　　Journal of No rthwe st No rmal University (Natura l Science)　
收稿日期:2005-08-09;修改稿收到日期:2005-11-18
基金项目:兰州大学干旱农业生态教育部重点实验室基金资助项目
作者简介:李巧峡 (1980—), 女 , 甘肃秦安人 , 硕士 , 助理实验师. 主要研究方向为植物生理生态.
E-mail:liqiaox ia8024@163. com
青藏高原东南部四川嵩草的遗传多样性研究
李巧峡1 , 赵庆芳1 , 2 , 崔　艳1 , 马世荣1
(1. 西北师范大学 生命科学学院 , 甘肃 兰州　730070;2. 兰州大学 生命科学学院 , 甘肃 兰州　730000)
摘　要:基于随机扩增多态 DNA(RAPD)方法分析了青藏高原东南部四川嵩草(Kobresia setchwanensis)4 个居群的遗
传多样性. 14 条随机引物共扩增出 180个位点数 , 其中多态性位点 138 个. 结果表明 , 四川嵩草 4 个居群的遗传多样
性大小与生境有相关性 , 而与海拔没有明显相关性(P=0. 768>0. 05 , r=- 0. 232). AMOVA 数据表明 , 四川嵩草的
遗传变异主要分布在居群内(77. 45%), 居群间的遗传变异占总变异的 22. 55%, 遗传分化指数 GST也显示了相似的结
果(0. 2101), 这一结果符合风媒异交的繁育系统. 从四川嵩草 4 个居群的遗传距离和聚类分析 , 以及用 NTSYS 对四
川嵩草 4 个居群的的遗传距离矩阵与地理距离矩阵间的关系进行 Mante l检测 , 结果表明 , 各居群间的遗传距离与地
理距离之间没有明显相关性(r=0. 61211 , P=0. 9176>0. 05).
关键词:RAPD;遗传多样性;四川嵩草
中图分类号:Q 143　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1001-988 Ⅹ(2006)01-0069-05
Genetic diversity of Kobresia setchwanensis
along the east-southern of Qinghai-Tibet plateau
LI Qiao-xia1 , ZHAO Qing-fang1 , 2 , CU I Yan1 , MA Shi-rong1
(1. College o f Life Science , Northwest No rmal University , Lanzhou 730070 , Gansu , China;
2. Co llege o f Life Science , Lanzhou Univ ersity , Lanzhou 730000 , Gansu , China)
Abstract:Kobresia setchwanensis is a ve ry impo rtant fine pasture and ecological grass in the Qinghai-Tibet
plateau. In present study , the genetic diversi ty of K. setchwanensis collected f rom east-southern o f the
Qinghai-Tibet plateau in China , are investig ated using RAPD markers. 180 lo ci are identified w ith 14
oligonucleo tide primers , out of w hich 138 loci are po lymo rphic. The results show that there is
relationship betw een the habi tats and genetic diver sity of Kobresia setchw anensis , but there is no
co rrelation betw een the alti tude and genetic diversi ty(P=0. 768>0. 05 , r=- 0. 232). AMOVA show that
most of the gene tic variability (77. 45%) reside among individuals wi thin populations , whereas only
22. 55% reside among populat ions. The Gst-values(0. 2101) show the sim ilar result. The results accord
wi th outcrossing , wind-pollinated plant. Additionally , compared Neis unbiased genetic distance matrix
wi th a co rresponding geog raphic distance matrix , the tw o matrices are no t signif icantly co rrelated(r =
0. 61211 , P=0. 9176>0. 05).
Key words:RAPD;genetic diversity;K obresia setchwanensis
　　四川嵩草(Kobresia setchwanensis)属莎草科苔
草亚科嵩草属多年生草本植物 , 主要分布在青藏高
原东南部. 四川嵩草根状茎短 , 秆密丛生 , 纤细 ,
稍坚挺 , 高 5 ～ 40 cm , 粗 1 ～ 1. 5 mm , 钝三棱形 ,
叶对折呈线形 , 苞片鳞片状 , 顶端具长芒 , 花序穗
状 , 着生土壤为高山草甸土. 具有草质柔软 、 营养
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西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版) 　　 第 42 卷　
Journal of Nor thw est Normal Unive rsity (Natural Science) 　　 Vo l. 42　
丰富等特点 , 为各类家畜所喜食 , 是青藏高原高寒
草甸植物群落建群种之一 , 也是构成青藏高原东南
部的主要优良牧草和生态草种[ 1 ] . 青藏高原独特
的高寒生态环境对于四川嵩草在发生 、 演化 、适应
和发展等生命活动过程的影响极其深刻. 笔者以青
藏高原东南部分布的四川嵩草为研究对象 , 运用
RAPD分子标记对四川嵩草的遗传多样性进行了研
究. 旨在探讨青藏高原高寒生态条件下 , 不同居群
的遗传多样性与生境和海拔之间的相互关系以及居
群遗传变异在时空中的分布式样等;通过对遗传多
样性的研究 , 阐明四川蒿草在高寒环境胁迫条件下
的适应机理 , 以期为进一步研究高寒草甸生态系统
的结构 、 功能及其演化提供理论依据 , 并为草场资
源的合理利用与保护 、退化草地的恢复与重建提供
科学依据.
1　材料与方法
1. 1　材料
于 2003年 7月和 8月 , 采集了分布于青藏高
原东南部的四川嵩草(K obresia setchwanensis)4 个
居群 86 个个体. 采用居群取样的方法(20 m ×
20 m), 随机采取 20 ～ 22 个不同克隆系的新鲜叶
片 , 分别用变色硅胶或吸水纸进行快速干燥 , 带回
实验室 , 室温干燥保存待用. 采样地区位于青藏高
原东南部 , 因受西南季风的影响 , 气候相对温暖湿
润 , 植物生长茂密 , 群落总覆盖度 90%左右 , 层
次分化不明显. 采样点的居群主要分布在土壤水分
适中的滩地 、山地阳坡和阴坡 , 在海拔较低的山地
下部 , 一般与矮生嵩草和珠芽蓼等共同形成亚高山
草甸 , 而在海拔较高的山地则与圆穗蓼为共优势种
形成高寒草甸. 4 个居群具体的编号 、 采集地点 、
生态环境和海拔高度见表 1.
表 1　青藏高原东南部四川嵩草采样记录
居群 采样地点 生境 海拔高度 /m 取样个体数
S1 甘肃碌曲　 路旁草滩 3 140 22
S2 甘肃玛曲　 山地阳坡 3 380 20
S3 四川红原　 山地阴坡 3 600 22
S4 四川若尔盖 山地阳坡 3 460 22
1. 2　DNA提取与检测
采用改进的 CTAB法提取总 DNA[ 2 ] . 提取的
DNA 加 200 μL 1×TE , 在 4 ℃冰箱中溶解. 在含
有0. 5 mg /L EB的质量分数为 0. 8%琼脂糖凝胶中
电泳检测各模板有无降解 , 并以 λDNA 为标准 ,
电泳定量.
1. 3　引物筛选
所用引物购自上海生工公司 , 从 250个 RAPD
随机引物中筛选出 14条条带清晰 、多态性高 、反
应稳定并且重复性好的引物进行扩增 , 引物编号见
表 2.
表 2　14个随机引物产生的片段大小范围 、 位点总数
引物序列 范围 bp 位点数
S1270 1 800 ～ 300 13
S1489 2 700 ～ 550 10
S1515 1 200 ～ 300 12
S1516 2 000 ～ 380 12
S1519 2 500 ～ 480 12
S186 3 000 ～ 300 12
S2088 1 750 ～ 300 13
total 3 000 ～ 200 180
S209 2 500 ～ 400 13
S304 1 800 ～ 200 14
S306 1 800 ～ 250 15
S331 2 000 ～ 200 13
S372 1 700 ～ 220 12
S377 1 600 ～ 200 13
S411 1 800 ～ 200 16
　 　 12. 9
1. 4　RAPD-PCR
扩增反应在 Biometra UNO Ⅱ PCR仪上进行.
PCR运行程序如下:94 ℃预变性 5 min;然后进
入 40个循环 (94 ℃ 1 min , 37 ℃ 1 min , 72 ℃
1 min), 循环完成后 , 72 ℃延伸 7 min. 最后于
4 ℃保存.
10 μL 反应体系组成如下:50 mmo l /L Tris-
HCL (pH =8. 3), 质量分数为 10% Fico ll , 1
mmol /L Tar trazine , 500 mg /L BSA , 2 mmo l /L
M gCL 2 , 0. 2 mmo l /L dN TP , 1 μmo l/L prime r ,
0. 5 uni ts TaqDNA po lymerase和 5 ～ 10 ng 模板.
扩增产物在含有 0. 5 mg /L EB的质量分数为
1. 5%的琼脂糖凝胶上电泳 3. 5 ～ 4 h , 电泳介质用
TBE. 使用 Uvi凝胶图像分析系统成像 , 使用 100
～ 3 000 bp分子量标记(图 1).
1. 5　数据分析
根据反应产物在电泳图中的位置 , 按条带的有
无记为 “1” 或 “0” , 形成 RAPD表型的 0 /1数据
矩阵. 用 POPGENE[ 3 ] 软件计算各居群的多态位
点百分率
PPB=具有多态的位点数检测到的位点数 .
Shannons信息指数
I =- ∑P i log 2P i ,
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　2006 年第 1 期 　　李巧峡等:青藏高原东南部四川嵩草的遗传多样性研究
　2006　No. 1 Genetic diver sity o f Kobresia setchwanensis along the east-southern of Q inghai-T ibet plateau 　
P i 为等位基因频率.
Neis基因多样度
h =1 - ∑ ∑P i2 /n1
n2
,
式中 P i 为等位基因频率 , n1 为总位点数 , n2 为材
料数.
基因分化系数
GST = 居群间基因多样性总基因多样性 .
　　基因流估计值
Nm = (1 - GST)
4 GST
.
　　Neis遗传距离
D =- lnI ,
I 为居群间遗传一致性[ 4 ] .
用 SPSS 软件分析不同居群遗传多样性大小与
海拔的相关性. 并用 AMOVA 软件[ 5 ] 进一步分析
居群内和居群间的遗传变异. 根据 Neis遗传距离
用 N TSYS 对不同居群进行 UPGMA 聚类分析.
同时用 N TSYS 对居群的遗传距离矩阵与地理距离
矩阵间的关系进行 Mantel检测. 具体的计算方法
见文献[ 3 ] 、[ 4 ] 、[ 5 ] .
图 1　引物 S186 对四川嵩草 S1(1 ～ 22 泳道)样品的扩增谱带 , M 为 DNA 分子量标量 Marker(100～ 3 000 bp)
2　结果
2. 1　四川嵩草的遗传多样性
用筛选的 14 条 RAPD引物 , 对四川嵩草的 4
个居群进行扩增 , 所得片段大小为 200 ～ 3 000 bp ,
平均每个引物扩增的位点数为 12. 9(表 2). 四川嵩
草 4个居群共计 86个个体 , 共检测到 180条扩增
条带 , 多态条带 138 条. 14条引物扩增的多态条
带比率 (PPB)、 Neis基因多样度(h)和 Shannons
信息指数(I)见表 3. 按所检测到的多态位点丰富
度 , 4 个 居群 的 排序 为:S4 (63. 33%) >S1
(56. 67%)>S2(56. 11%)=S3(56. 11%);Neis基
因多样度(h)依次为:S4(0. 218 4)>S1(0. 200 3)
>S2(0. 199 9)>S3(0. 180 2);Shannons信息指
数(I)依次为:S4 (0. 328 1) >S1 (0. 298 4) >
S2(0. 298 2)>S3(0. 274 6). 3个遗传多样性参数
所反映的趋势基本一致.
2. 2　四川嵩草的遗传多样性与海拔的关系
用 Excel和 SPSS 分析了四川嵩草不同居群遗
传多样性大小与海拔的关系. Excel是基于多态条
带比率 (PPB)、 Neis基因多样度(h)和 Shannons
信息指数(I)3 参数所做的分析. 结果表明 , 四川
嵩草不同居群的遗传多样性大小与海拔高度没有相
关性(图 2). SPSS 是基于 Shannons 信息指数所
做的统计 , 结果与 Excel 分析的结果相似(P =
0. 768>0. 05 , r=- 0. 232)(图 3).
表 3　青藏高原东南部四川嵩草遗传多样性的 RAPD分析
居群 取样个体
多态条
带数
多态条带比
率(PPB) /%
Neis基因多
样度(h)
Shannons多样
性指数(I)
S1 22 102 56. 67 0. 200 3 0. 298 4
S 2 20 101 56. 11 0. 199 9 0. 298 2
S 3 22 101 56. 11 0. 180 2 0. 274 6
S 4 22 114 63. 33 0. 218 4 0. 328 1
平均 21. 50 104. 50 58. 06 0. 199 7 0. 299 8
物种 86 138 76. 67 0. 252 7 0. 380 5
图 2　Excel分析的四川嵩草 4 个居群
不同海拔的遗传多样性
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图 3　SPSS 分析的四川嵩草 4个居群的
Shannons信息指数( I)与海拔的相关性
2. 3　四川嵩草的遗传结构
用 AMOVA 进行分子方差分析 , 显示四川嵩
草的遗传变异主要存在居群内(77. 45%), 居群间
遗传变异占总变异的 22. 55%(表 4). 四川嵩草居
群的基因分化系数(GST)为 0. 210 1 , 基因流估计值
(Nm)为 1. 8801.
表 4　青藏高原东部四川嵩草的分子方差分析(AMOVA)
变异
来源 自由度 平方和
期望平均
平方值
方差
成分
百分比
/% P值
居群间 3 410. 23 136. 75 5. 49 22. 55 <0. 0010
居群内 82 1545. 44 18. 85 18. 85 77. 45 <0. 0010
2. 4　四川嵩草居群间的遗传距离和聚类分析
在四川嵩草的 4个居群中 , 以 S2 和 S4 的遗传
一致性最高(0. 937 5), 遗传距离最近(0. 064 6);
以 S2 和 S3 的遗传一致性最低(0. 883 5), 遗传距
离最远(0. 123 8). 在聚类图中 , S1 、 S2 和 S4 聚为
一支. 具体遗传距离表和聚类图见表 5和图 4.
表 5　四川嵩草 4个居群的遗传距离(对角线下)
和遗传相似性(对角线上)
居群 S 1 S 2 S 3 S 4
S 1 **** 0. 906 8 0. 889 4 0. 931 7
S 2 0. 097 8 **** 0. 883 5 0. 937 5
S 3 0. 117 2 0. 123 8 **** 0. 921 9
S 4 0. 070 7 0. 064 6 0. 081 3 ****
图 4　四川嵩草 4 个居群 Neis 遗传
距离的 UPGM A 聚类图
2. 5　居群间的遗传距离与地理距离的关系
用 NTSYS对四川嵩草 4个居群的的遗传距离
矩阵与地理距离矩阵间的关系进行 Mantel检测 ,
其结果为 r=0. 612 11 , P =0. 917 6>0. 05 , 说明
各居群间的遗传距离与地理距离之间没有相关性.
图 5所示为 Mantel检测得到的各居群间遗传距离
和地理距离的相关关系的散点图.
图 5　四川嵩草居群间遗传距离与
地理距离的相关关系
3　讨论
3. 1　四川嵩草遗传多样性与生境和海拔间的关系
本研究结果表明 , 四川嵩草 4个居群中 , 不同
居群的遗传多样性与生境有相关性. 大量资料也表
明[ 6-8] 植物居群遗传多样性的大小与生境有关. 在
四川嵩草中 , 处于阳坡生长的 2个居群 S2 和 S4 及
草滩生长的 1 个居群 S1 其 3 个遗传多样性指数
(PPB , h和 I) 均大于阴坡生长的一个居群 S3(见
表 3). 四川嵩草主要分布在青藏高原的的东南部 ,
植株本来喜温[ 1 ] , 因此 , 在较温暖的生境 , 实生
苗建成较容易. 由此可说明 , 四川嵩草的遗传多样
性与其生境有关 , 是长期进化和适应的结果.
Younga A G 等[ 9 ] 研究表明 , 海拔越高 , 由于
传粉昆虫数量的减小和植物花期的减短 , 以及小居
群效应的产生 , 某些种的有性繁殖会受到影响 , 居
群遗传多样性变小. 而本研究表明 , 四川嵩草 4个
居群遗传多样性的大小与海拔高度没有明显相关
性. Reznicek A A[ 10] 认为苔草亚科植物都是风媒
传粉 , 那么四川嵩草作为风媒传粉植物其传粉过程
不会受到高海拔的影响;而且四川嵩草在长期的自
然选择下 , 在垂直分布上有着广泛的生态适应 , 因
此 , 在所研究的海拔梯度范围之内 , 并没有对遗传
变异产生明显影响;另一方面 , 本研究所选的 4个
取样点的海拔梯度差异不够大 , 也有可能导致此结
果.
3. 2　四川嵩草的遗传结构分析
本研究中 , AMOVA 数据表明 5 种嵩草的遗
传变异主要分布在居群内(77. 45%), 居群间遗传
变异占总变异的 22. 55%. GS T也显示了相似的结
果(0. 2101). 对于四川嵩草来说 , 维持居群内大量
遗传变异一方面与繁育系统有关 , 苔草亚科植物都
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　2006　No. 1 Genetic diver sity o f Kobresia setchwanensis along the east-southern of Q inghai-T ibet plateau 　
是风媒传粉[ 10] , 而且野外观察发现 , 四川嵩草花
序中雄蕊较雌蕊先熟 , 是雌雄异熟植物 , 且产生种
子的能力也不低 , 由此可认为四川嵩草是风媒异花
授粉. 另外青藏高原上的强风 、多风在一定程度上
可促进居群间基因的交流. 但是 , 四川嵩草 4个居
群间的遗传分化系数仍要高于风媒异交植物居群间
遗传分化的平均值 (GST =0. 1930)[ 11] . 四川嵩草
的有性繁殖虽然是风媒异交 , 但四川嵩草是兼性植
物 , 在繁殖对策中克隆繁殖仍占优势 , 而且 , 在青
藏高原高寒生态环境中 , 植物实生苗的建成相对比
较困难. 因此 , 四川嵩草居群间的遗传分化是由其
繁殖对策和高寒生态环境造成的.
3. 3　四川嵩草的遗传距离分析
用 NTSYS对四川嵩草 4个居群的遗传距离矩
阵与地理距离矩阵间的关系进行 Mantel检测 , 其
结果表明 , 各居群间的遗传距离与地理距离之间没
有明显相关性. 基于 Neis遗传距离和遗传聚类图
表明 , 在四川嵩草中的 4个居群中 , 其居群间遗传
一致度与居群所处生境间的相似程度一致. 处于阳
坡的两个生境的居群 S2 和 S4 具有最近的遗传距
离 , 并与草滩生境的居群 S1 聚为一支 , 此结果与
四川嵩草遗传多样性与生境有关的结果比较吻合.
在较温暖的生境 , 实生苗建成较容易 , 因此 , 处于
阳坡和草滩生长的居群其种子流较畅通;而在阴坡
生境生长的居群实生苗建成较困难 , 有限的种子流
造成了居群对局部生态环境的适应 , 进而促使与其
它居群的遗传分化[ 6 ] .
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(责任编辑　孙晓玲)
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