全 文 ：园　艺　学　报　2008, 35 (3):419-422
ActaHorticulturaeSinica
收稿日期:2007-08-22;修回日期:2008-02-18
基金项目:国家自然科学基金项目 (30671452; 30571285);高校博士点科研基金项目 (20050434009)
＊通讯作者 Authorforcorrespondence(E-mail:hqyang@sdau.edu.cn)
平邑甜茶叶片不定芽再生及 NO的效应
韩小娇 1 , 杨洪强 1, 2＊ , 由淑贞1 , 段凯旋1 , 张鑫荣 1 , 赵海洲 1
(1山东农业大学园艺科学与工程学院 , 山东泰安 271018;2作物生物学国家重点实验室 , 山东泰安 271018)
摘　要:以平邑甜茶继代组培苗叶片为材料 , 研究了一氧化氮 (NO)供体———硝普钠 (SNP)、 6-BA、
NAA、 2, 4-D、 ZT和光暗条件对平邑甜茶叶片不定芽再生的影响。结果表明 , 6-BA、 ZT、 NAA和暗培养均
有利于叶片不定芽的分化;在含有生长素和细胞分裂素的 MS培养基中 , 加入 6.0和 12.0 mg· L-1的 SNP
可极显著诱导叶片不定芽的分化;以 MS+ 6.0mg· L-1 BA+0.5mg· L-1 NAA+0.2 mg· L-1 ZT+6.0
mg· L-1 SNP为培养基 , 暗培养 15d, 叶片不定芽分化效果最好 , 再生率达 67.8%。
关键词:平邑甜茶;叶片;不定芽再生;一氧化氮
中图分类号:S661　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X(2008) 03-0419-04
AdventitiousShootRegenerationfrom LeavesofMalushupehensisandEffectsofNitricOxide
HANXiao-jiao1 , YANGHong-qiang1, 2＊ , YOUShu-zhen1 , DUAN Kai-xuan1 , ZHANGXin-rong1 , and
ZHAOHai-zhou1
(1CollegeofHorticultureScienceandEngineering, ShandongAgriculturalUniversity, Taian, Shandong271018, China;2State
KeyLaboratoryofCropBiology, Taian, Shandong271018, China)
Abstract:Theefectsofnitricoxidedonor-sodiumnitroprusside(SNP), 6-BA, NAA, 2, 4-D, ZTand
darktreatmentonadventitiousshootregenerationfromleavesofMalushupehensisRehd.werestudied.There-
sultsshowedthat6-BA, ZT, NAAanddarktreatmentcouldincreaseadventitiousshootdiferentiation.Inthe
presenceofauxinandcytokinin, 6.0and12.0mg· L-1SNPcouldsignificantlyinduceleafadventitiousshoot
diferentiation.ThebestresultwasachievedinthemediumMS+6.0 mg· L-1 BA+0.5 mg· L-1 NAA +
0.2mg· L-1 ZT+ 6.0 mg· L-1 SNP, inwhichthepercentageofadventitiousshootregenerationwere
67.8% afterdarktreatmentfor15 d.
Keywords:MalushupehensisRehd.;leaves;adventitiousshootregeneration;nitricoxide
平邑甜茶是湖北海棠 (MalushupehensisRehd.)的一个类型 , 具有高度无融合生殖能力 , 实生后
代变异分离程度极小 , 一旦引入外源基因 , 可通过无融合生殖方式稳定地遗传 , 因此 , 平邑甜茶是一
种良好的外源基因受体材料。
但是 , 成功的基因转化依赖于良好的再生体系 , 而目前报道的平邑甜茶的叶片不定芽分化率最高
仅为 16.3% (张军科 等 , 2000), 这样低的分化率不能满足构建平邑甜茶高效再生体系及转化基因
的需要 。
近来人们发现一氧化氮 (NO)作为一种信使分子能够调节植物的生长发育 (Neiletal.,
2003), 而 NO对叶片不定芽分化的作用目前还不清楚。
DOI :10.16420/j.issn.0513-353x.2008.03.015
园　　艺　　学　　报 35卷
本研究以继代组培苗为材料 , 探讨平邑甜茶离体叶片不定芽再生及 NO供体硝普钠 (SNP)对不
定芽再生的影响 , 为建立平邑甜茶离体高效再生体系奠定基础。
1　材料与方法
供试材料为接种于 MS培养基 、 继代 25 d左右的平邑甜茶组培苗叶片 。
选取顶端 1 ～ 3片生长一致的展开叶 , 去叶缘及叶尖 1/3, 正面向上接种于各处理培养基上。所
有培养基均添加蔗糖 30 g· L-1和琼脂粉 6.5g·L-1 , pH5.8 ～ 6.2。各处理接种 30个叶片 , 重复 3
次 。
培养温度 23 ～ 25℃, 光照强度 50 μmol· m-2· s-1 , 光照 16h·d-1。培养 50d后统计不定芽诱
导率和诱导芽数 。不定芽诱导率 (%)=再生叶片数 /接种叶片总数 ×100, 平均诱导芽数 =再生不定
芽总数 /接种叶片总数 。
所有数据均采用 SAS软件进行统计分析。
2　结果与分析
2.1　6-BA和 NAA对平邑甜茶叶片不定芽再生的影响
由表 1可见 , 含 6.0 mg· L-1 BA和 0.5mg·L-1 NAA的培养基 , 即 8号处理 (图版 , 1)的平
邑甜茶叶片不定芽诱导率达 16.7%, 平均诱导芽数为 0.96个 , 极显著高于其它处理 。
表 1　不同浓度的 6-BA和 NAA对平邑甜茶叶片再生的影响
Table1　Efectof6-BAandNAAonshootregenerationfromleavesofMalushupehensisRehd.
代号
Code
BA/
(mg· L-1)
NAA/
(mg· L-1)
不定芽诱导率 /%
Regenerationfrequency
平均诱导芽数
Numberofbudsperleaf
1 3.0 0.1 0±0fF 0±0fF
2 6.0 0.1 7.78±0.44cC 0.21±0.023dD
3 8.0 0.1 3.33±0.45eE 0.08±0.012efEF
4 3.0 0.3 2.22±0.59eE 0.05±0.006fEF
5 6.0 0.3 8.89±0.57cC 0.46±0.035cC
6 8.0 0.3 5.56±0.33dD 0.15±0.017deDE
7 3.0 0.5 5.56±0.23dD 0.43±0.029cC
8 6.0 0.5 16.7±0.69aA 0.96±0.064aA
9 8.0 0.5 12.2±0.84bB 0.72±0.040bB
F(BA) 34.5＊＊ 13.99＊
F(NAA) 31.33＊＊ 38.72＊＊
　　注:＊表示差异显著 (α=0.05);＊＊表示差异极显著 (α=0.01)。大小写字母分别表示 0.01和 0.05显著性差异。下同。
Note:＊ representsthesignificanceat0.05level;＊＊representsthesignificanceat0.01level.Capitalandlowercaseindicatesignificance
at0.01and0.05level, respectively.Thesameblow.
2.2　光暗条件和生长调节剂对叶片不定芽再生的影响
为进一步提高叶片不定芽的诱导率 , 本试验又设置了光暗处理 , 并增加了另一种生长素 2, 4-D和
另一种细胞分裂素———玉米素 (ZT), 进行了正交试验 , 结果如表 2。
从表 2可知 , 暗培养 15 d比光培养明显提高不定芽的再生率;CTKs(细胞分裂素)极显著诱导
叶片不定芽再生 , NAA诱导效果也很明显 , 而 1.0 mg· L-1的 2, 4-D作用不明显。综合考虑各因素 ,
以 5号处理 (图版 , 2), 即 MS+6.0mg· L-1 BA+0.5 mg· L-1NAA为培养基 、 暗培养 15 d, 平邑
甜茶的叶片不定芽诱导率 (45.6%)及诱导芽数 (1.24)均最高 。
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　3期 韩小娇等:平邑甜茶叶片不定芽再生及 NO的效应　
表 2　CTKs、 NAA和 2, 4-D与光暗培养对平邑甜茶叶片再生的影响
Table2　EfectofCTKs, NAA, 2, 4-DandlightordarktreatmentonshootregenerationfromleavesofMalushupehensisRehd.
代号
Code
CTKs/
(mg· L-1)
NAA/
(mg· L-1)
2, 4-D/
(mg· L-1)
光暗条件
Lightordark
不定芽诱导 /%
Regenerationfrequency
平均诱导芽数
Numberofbudsperleaf
1 ZT2.0 0.5 0 光 Light 16.7±0.87eDE 0.24±0.023dE
2 ZT2.0 0.5 1.0 暗 Dark 25.6±1.33cC 0.65±0.035cD
3 ZT2.0 0.8 0 暗 Dark 20.0±0.64dD 0.18±0.012dE
4 ZT2.0 0.8 1.0 光 light 14.4±1.27eE 0.11±0.015dE
5 BA 6.0 0.5 0 暗 Dark 45.6±1.10aA 1.24±0.121aA
6 BA 6.0 0.5 1.0 光 light 36.7±1.10bB 0.96±0.070bBC
7 BA 6.0 0.8 0 光 light 27.8±0.75cC 0.73±0.046cCD
8 BA 6.0 0.8 1.0 暗 Dark 38.9±0.98bB 1.08±0.085abAB
F(CTKs) 172.8＊＊ 172.23＊＊
F(NAA) 18.26＊ 21.08＊
F(2, 4-D) 　1 　 3.62
F(光暗条件 Lightordark) 39.35＊＊ 26.5＊
2.3　硝普钠和玉米素对平邑甜茶叶片不定芽再生的影响
鉴于一氧化氮的调节作用 (Neiletal., 2003), 本试验在 MS+6.0mg· L-1 BA+0.5 mg·L-1
NAA培养基中加入 NO供体 SNP以考察 NO的效果;同时由于 CTKs诱导效果显著 , 本试验又在上述
培养基中加入 ZT, 进一步考察 CTKs的效果 , 结果见表 3。
由表 3可见 , 在 MS+6.0mg·L-1 BA+0.5mg· L-1 NAA培养中加入 SNP与 ZT后 , 不定芽再
生率均进一步提高 , 其中 SNP的效果达极显著水平 (F=184.37), 而且比 ZT的效果更突出 。在 ZT
与 SNP组合中 , 以 0.2 mg· L-1 ZT配合 6.0 mg·L-1 SNP, 即 2号处理 (图版 , 3)对不定芽再生的
诱导效果最好 , 不定芽诱导率和平均诱导芽数分别达到 67.8%和 2.21个 , 亦即以 MS+6.0 mg· L-1
BA+0.5 mg· L-1 NAA+0.2 mg· L-1ZT+6.0 mg· L-1 SNP为培养基 , 暗培养 15 d, 诱导叶片不定
芽分化的效果最好。
表 3　硝普钠 (SNP)与玉米素 (ZT)对平邑甜茶叶片再生的影响
Table3　EffectofZTandSNPonshootregenerationfromleavesofMalushupehensisRehd.
代号
Code
ZT/
(mg· L-1)
SNP/
(mg· L-1)
不定芽诱导率 /%
Regenerationfrequency
平均诱导芽数
Numberofbudsperleaf
1 0.2 0 53.3±1.79cdCD 1.32± 0.097bcC
2 0.2 6.0 67.8±1.27aA 2.21±0.139aA
3 0.2 12.0 60.0±1.90bBC 1.54±0.121bcC
4 0.5 0 48.7±1.15dD 1.25±0.085cC
5 0.5 6.0 65.5±1.85aAB 2.16±0.110aAB
6 0.5 12.0 56.7±1.96bcC 1.67±0.144bBC
F(ZT) 26.08＊ 0.003
F(SNP) 184.37＊＊ 68.62＊＊
3　讨论
通常认为芽的分化主要依赖于细胞分裂素的刺激 , 本试验发现 SNP可极显著地诱导平邑甜茶叶
片不定芽分化。这可能与细胞分裂素能快速刺激 NO的产生 (Tunetal., 2001)有关 , NO会在细胞
分裂素诱导不定芽分化过程中起 “中介” 作用 , 而利用 “中介 ” 直接处理 , 可更快捷有效地发挥诱
导芽分化的作用 , 因而比单用细胞分裂素效果更突出。
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尽管在苹果属植物中已有不少叶片再生不定芽的研究 (师校欣 等 , 1999;刘莹 等 , 2006), 但
平邑甜茶为天然三倍体 , 由于材料的特殊性 , 其外植体比苹果属其他植物再生不定芽困难的多 。而本
研究中通过在培养基添加 NO供体 、 暗培养等方式使叶片再生率达到 67.8%, 比以前报道的叶片再生
结果 (张军科 等 , 2000)提高了 4倍多 , 而比平邑甜茶原生质体再生不定芽频率 8.7%的结果 (潘
增光和邓秀新 , 2000)提高了近 8倍 。这说明尽管平邑甜茶不定芽分化再生困难 , 但只要有合适的培
养条件 , 可以进一步提高叶片不定芽的再生率 , 并能够最终克服平邑甜茶离体再生困难的问题 。
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图版说明:平邑甜茶叶片不定芽的再生情况
1.基本培养基 (MS+ 6.0mg· L-1 BA+ 0.5mg· L-1 NAA);2.基本培养基 +暗培养 15 d;3.基本培养基 + 0.2mg· L-1 ZT+
6.0mg· L-1 SNP+暗培养 15d.
Explanationofplates:TheregenerationofadventitiousshootfromleavesofMalushupehensis
1.Basicmedium(MS+6.0mg· L-1 BA+0.5mg· L-1NAA);2.Basicmediumindarktreatmentfor15d;3.Basicmediumcontaining0.2
mg· L-1 ZTand6.0mg· L-1 SNPindarktreatmentfor15 d.
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